UPLC-MS_MS同时测定牙膏中7种人工甜味剂的含量.pdf

www.ffc-分析与测评2024年4月第2期Apr.2024,No.2香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS128www.ffc-作 者江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029 熊 雯 吴 珍 吉伟佳 易路遥#UPLC-MS/MS 同时测定牙膏中 7 种人工甜味剂的含量*摘 要采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）建立牙膏产品中 7 种人工合成甜味剂的快速检测方法。样品通过体积分数 50%乙醇溶液提取并稀释后，以 Acqutiy UPLC BEH C18（100 mm2.1 mm1.7 m）色谱柱进行分离，乙腈-体积分数 0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，多反应监测（MRM）模式下正负离子同时进行定性和定量分析。结果表明，阿斯巴甜在 4 120 ng/mL 范围内线性良好，其他 6 种人工甜味剂（糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、纽甜和阿力甜）在 10 300 ng/mL 范围内线性关系良好（r2 0.998 9），平均加标回收率在 96.51%104.87%，相对标准偏差（RSD）在 0.83%2.73%，检出限为 0.004 0.050 g/kg。本方法简便易行，准确度高，重现性好，适用于牙膏中 7 种人工甜味剂的快速定量检测分析。关键词牙膏 人工合成甜味剂 超高效液相色谱-串联质谱法 快速定量 Simultaneous Determination of Seven Artificial Sweeteners in Toothpaste by UPLC-MS/MS*XIONG Wen WU Zhen JI Weijia YI Luyao#(Jiangxi Institute for Drug Control,NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Traditional Chinese Patent Medicine,Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality,Nanchang 330029,Jiangxi,China)Abstract:A simple and rapid method was developed for the determination of seven artificial sweeteners in toothpaste by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were extracted and diluted with 50%(volume fraction)ethanol,then performed on an Acquity UPLC BEH C18 column(100 mm2.1 mm1.7 m)with the mobile phases of 0.1%(volume fraction)formic acid and acetonitrile by gradient elution.The identification and quantitation of seven artificial sweeteners were performed by UPLC-MS/MS in positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring(MRM)mode.Aspartame showed good linear relationship in the range of 4-120 ng/mL,and other six sweeteners like saccharin sodium,acesulfame-K,cyclamate,sucralose,alitame and neotame calibration curves had good linearity in the range of 10-300 ng/mL with correlation coefficient(r2)0.998 9.The recoveries of seven investigated sweeteners varied from 96.51%to 104.87%with the relative standard deviations(RSDs)in 0.83%-2.73%.The limits of detection were 0.004-0.050 g/kg.The established method is efficient,sensitive,and can be applied for the rapid determination of seven artificial sweeteners in toothpaste.Keywords:toothpaste artificial sweetener ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS/MS)rapid determination作 者 简 介熊雯（1983），女，硕士，工程师，主要从事化妆品、食品药品检验研究。#通信作者：易路遥（1983），女，硕士，高级工程师，主要从事化妆品、食品药品检验研究。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0037*基金项目：江西省药品监督管理局科技计划（编号2021KY50）收稿日期：2023-02-10；修回日期：2023-04-25第 2 期分析与测评熊 雯，等：UPLC-MS/MS同时测定牙膏中7种人工甜味剂的含量129www.ffc-www.ffc-甜味剂是牙膏生产必不可少的原料之一。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，其中天然甜味剂较为安全，有报道人工合成甜味剂有关的副作用，包括情绪和行为改变、皮肤过敏、头痛、呼吸困难、代谢肥胖和癌症等1-2，短时间内大剂量的摄入人工合成甜味剂会增加中风、老年痴呆的风险3-5。牙膏常同时添加糖精钠、三氯蔗糖等多种人工甜味剂产生协同效应，从而获得比单一甜味剂更丰富饱满的口感，尤其儿童牙膏经常使用水果香精导致其口味与食品混淆，极可能造成幼儿“吃牙膏”现象。儿童免疫系统不成熟，未知情况下有害物质甚至会对其造成永久性的伤害。我国允许使用的人工甜味剂主要有三氯蔗糖、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、甜蜜素、阿力甜和纽甜。鉴于色谱仪器的普遍性，该类物质研究多采用高效液相色谱法、气相色谱法和离子色谱法6，但这类方法不适用于甜味剂多组分的同时测定。牙膏仅涉及糖精钠、安赛蜜和阿斯巴甜 2 3 种成分在高效液相色谱仪中应用的研究已有报道7-8。高效液相色谱串联质谱法能同时测定多种人工合成甜味剂，但当前研究多集中于糕点、饮料等食品领域9-11，其复杂基体样品多采用水或者甲醇水溶液提取并经繁杂的固相萃取柱或者蛋白沉淀剂处理。采用安全环保的乙醇水混合溶液对样品进行简单提取操作，并通过超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立同时测定牙膏中我国常用 7 种人工甜味剂的含量，对于增补牙膏甜味剂研究以及控制牙膏的质量安全具有重要意义。1 试验部分1.1 仪器与试剂Xevo TQ-S 型液相串联质谱仪，美国 Waters公司；ST16R 型离心机、超纯水机，美国 Thermo Fisher 公司；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；XS205DU 型、ML204 型电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司。三氯蔗糖、糖精钠，中国食品药品检定研究院；安赛蜜，德国Dr.Ehrenstorfer公司，纽甜、阿斯巴甜，上海源叶生物科技有限公司；阿力甜，北京曼哈格生物科技有限公司；甜蜜素，美国 Standford Chemicals 公司；甲醇、乙腈、甲酸，色谱纯，美国 Sigama-Aldrich 公司；乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。待测 72 批次牙膏，市售。1.2 液相色谱条件色 谱 柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm 2.1 mm1.7 m）；柱温：20 ；流速：0.25 mL/min；进样体积：1 L；流动相 A：体积分数为 0.1%甲酸水溶液；流动相 B：相为乙腈溶液。梯度洗脱程序（均为体积分数）：0 min，90%A；0.5 min，90%A；3.0 min，10%A；4.0 min，10%A；4.1 min，90%A；8.0 min，90%A。1.3 质谱条件离子源化模式为 ESI 正、负离子同时扫描；多反应监测模式（MRM）采集；阀切至废液时间为 1.6 min；毛细管电压为 3 kV；脱溶剂温度为 450 ；脱溶剂气流量为 800 L/h。这 7 种化合物的母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能见表1，其中*表示定量离子；其总离子色谱图见图 1，MRM 色谱图见图 2。表 1 7 种人工甜味剂的离子参数名称母离子子离子锥孔电 压/V碰撞能/V离子模式阿斯巴甜295.1120.20*3030+295.1180.203019三氯蔗糖395.0395.00*4010395.0359.004017安赛蜜162.0162.00*307162.082.153018糖精钠182.0106.10*3525182.042.253528甜蜜素178.0178.00*3515178.080.103528纽甜377.2200.10*3530377.2345.203517阿力甜330.2295.002725330.2312.05*27181.4 标准溶液的配制分别精密称取三氯蔗糖、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、甜蜜素、阿力甜和纽甜各 10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，即得各标准单标储备溶液。分别精密吸取阿斯巴甜储备溶液 0.20 mL，其他各标准单标储备溶液 0.50 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用体积分数50%乙醇稀释至刻度，摇匀即得混合标准溶液（阿分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品130www.ffc-www.ffc-斯巴甜质量浓度为 2 g/mL，其他 6 种甜味剂质量浓度均为 5 g/mL）。混合标准系列工作溶液的制备：精密吸取混合 标 准 使 用 液 各 0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mL，置于 10 mL 量瓶中，加体积分数 50%乙醇稀释到刻度，摇匀，即得系列标准曲线溶液。图 1 7 种人工甜味剂的总离子色谱图1.5 样品前处理称取样品约 0.2 g（精密至 0.001 g），置于具塞比色管中，加体积分数 50%乙醇至 10 mL，涡旋 1 min，超声提取 15 min，放至回室温，5 000 r/min 离心 10 min，精密吸取上清液 0.050 mL，置于 10 mL 容量瓶中，加体积分数 50%乙醇稀释至刻度，摇匀作为待测溶液，经 0.22 m 滤膜过滤，即得。2 结果与讨论2.1 阀切换时间参数的选择在试验仪器条件下，空体积时间为 0.93 min，化合物最早出峰时间约为 1.9 min，因此设置阀切至废液时间为 1.6 min。（1）牙膏往往含有大量无机盐成分氟化物和摩擦剂（包括碳酸盐、磷酸盐等），摩擦剂虽难溶于水和乙醇，但其质量含量占膏体的 20%50%，因此也不能排除有些许无机盐成分被溶剂提取。（2）牙膏中含有 20%30%（质量分数）的赋形剂如甘油和丙二醇等，透明牙膏中的用量甚至高达 75%。（3）当前基体复杂的食品基质多采用溶液提取并经固相萃取柱或者蛋白沉淀剂处理，而牙膏不含蛋白质而含大量极性成分等不保留组分，其进入液相色谱后可通过阀切换至废液不进质谱。因此，设置阀切换时间在一定程度能保护质谱仪，并简化牙膏样品的前处理步骤。2.2 流动相的优化试验考察了水-乙腈、水-甲醇、体积分数0.1%甲酸水溶液-乙腈、体积分数 0.1%甲酸水溶液-甲醇、5 mmoL/L 的甲酸铵溶液-乙腈以及5 mmoL/L 的甲酸铵溶液-甲醇 6 种流动相。对比甲醇与乙腈，发现乙腈作为流动相时，7 种化合物的峰型以及分离效果更好；而水相仅含水溶液时，糖精钠、甜蜜素和安赛蜜存在峰型太宽甚至严重拖尾现象；相对于流动相含 5 mmoL/L 甲酸铵溶液，其含体积分数 0.1%甲酸溶液时，三氯蔗糖、纽甜以及阿斯巴甜的响应值约高 2 4 倍，尤其对响应较小的三氯蔗糖和纽甜，差别明显。因此选用体积分数 0.1%甲酸水-乙腈作为流动相。2.3 提取溶剂的选择为考察不同溶剂的提取效率，选用阴性样品进行单水平（阿斯巴甜添加质量浓度为 20 ng/mL，其余 6 种化合物添加质量浓度为 50 ng/mL）双平行添加回收试验，通过单点法对比不同溶剂的提取率。文献报道甜味剂的提取溶剂一般为纯水溶图 2 7 种人工甜味剂的 MRM 色谱图141071210710107810761074107210701410712107101078107610741072107011080510602106011070510405106051060强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps强度/cps1.001.001.002.002.002.003.003.003.004.004.004.005.005.005.006.006.006.007.007.007.008.008.008.00时间/min2.357时间/min（a）阿斯巴甜时间/min妞甜阿力甜安塞蜜三氯蔗糖甜蜜素、糖精钠阿斯巴甜2.4502.8402.2302.2301.9272.3881.001.001.001.001.001.002.002.002.002.002.002.003.003.003.003.003.003.004.004.004.004.004.004.005.005.005.005.005.005.006.006.006.006.006.006.007.007.007.007.007.007.008.008.008.008.008.008.00时间/min（b）阿力甜时间/min（c）纽甜时间/min（d）甜蜜素时间/min（e）糖精钠时间/min（f）安赛蜜时间/min（g）三氯蔗糖第 2 期分析与测评熊 雯，等：UPLC-MS/MS同时测定牙膏中7种人工甜味剂的含量131www.ffc-液和甲醇水混合溶液，选取水，25%、50%、75%乙醇，25%、50%、75%甲醇 7 种提取溶剂（考察的混合提取溶剂百分比均为体积分数）作为考察对象。结果发现：（1）当提取溶剂水含量太高时，牙膏中的发泡剂导致样品溶液泡沫丰富而不利于后期稀释定量，因此水、25%乙醇、25%甲醇不适合作为牙膏中甜味剂的提取溶剂。（2）75%乙醇作为提取剂时，出现肉眼可见极少量的团絮状物质，部分化合物的提取率仅为 85%左右，说明乙醇含量太高时，样品不分散易结团，造成提取效果不佳。（3）50%乙醇、50%甲醇和 75%甲醇作为提取剂时，样品分散效果好，且不易气泡，同时对人工甜味剂的提取效率均能达到 95%以上。甲醇存在一定毒性，而提取溶剂 50%乙醇也达到较好提取效果，相较常用提取溶剂甲醇水混合溶液，采用 50%乙醇相对更安全环保。因此，选用50%乙醇作为提取溶剂，不同提取溶剂对 7 种化合物的提取率结果见表 2。表 2 不同提取溶剂对 7 种人工甜味剂的提取率序号溶剂提取率/%阿斯巴甜三氯蔗糖安赛蜜糖精钠甜蜜素纽甜阿力甜1体积分数 50%乙醇96.1298.76101.6799.3498.3395.37102.672体积分数 75%乙醇87.5284.3391.5285.6489.1786.7290.653体积分数 50%甲醇97.57104.8599.8199.7597.3497.68103.574体积分数 75%甲醇101.40101.8296.3797.5295.0199.8197.482.4 方法学验证2.4.1 线性关系取系列标准曲线溶液照上述条件测定，得曲线方程，表明采用上述方法，阿斯巴甜在 4 120 ng/mL 的范围内线性良好。其他 6 种人工甜味剂在 10 300 ng/mL 的范围内线性良好。线性方程和相关系数见表 3。2.4.2 检出限与定量限在阴性样品中添加标准溶液，以 S/N 3 确定本方法的检出限（LOD），阿斯巴甜检出限为0.004 g/kg，纽甜、阿力甜检出限均为 0.01 g/kg，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素检出限为 0.02 g/kg，三氯蔗糖检出限为 0.05 g/kg。以 S/N 10 确定本方法的定量限（LOQ），阿斯巴甜定量限为 0.01 g/kg，纽甜、阿力甜定量限均为0.03 g/kg，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素定量限为 0.07 g/kg，三氯蔗糖定量限为 0.17 g/kg。检出限和定量限见表 3。表 3 7 种人工甜味剂线性关系序号名称标准曲线r2值检出限/(g kg-1)定量限/(g kg-1)1阿斯巴甜y=12 327.700 x+7 459.3100.999 80.0040.012三氯蔗糖y=127.229x+62.1820.999 40.050.173安赛蜜y=476.914x+322.1360.999 50.020.074糖精钠y=602.259x+2 102.9600.999 60.020.075甜蜜素y=661.332x+1 706.0800.999 70.020.076纽甜y=119.252x+350.616 0.999 20.010.037阿力甜y=254.396x+104.2120.998 90.010.032.4.3 加样回收试验分别在阴性样品中添加7种混合标准溶液进行低、中、高 3 个水平的回收试验以验证方法的准确性，阿斯巴甜添加水平分别为 0.2、0.4、0.8 g/kg，其余 6 种人工甜味剂添加水平分别为 0.5、1.0、2.0 g/kg，每个水平进行 2 个平行试验。按上述方法测定，各化合物的回收率在 96.51%104.87%，相对标准偏差（RSD）在 0.83%2.73%。具体回收率结果见表 4。2.4.4 精密度试验取线性质量浓度为 100 ng/mL（阿斯巴甜质量浓度为40 ng/mL）的混合标准品溶液连续进样6次，www.ffc-分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品132www.ffc-7 种甜味剂 RSD 在 0.90%1.70%，精密度良好。2.5 实际样品分析采用本方法测定了 72 批次牙膏中 7 种人工甜味剂。其中，7 批次检出三氯蔗糖，检出量为 0.257 2.397 g/kg；65 批次检出糖精钠，检出量为0.447 4.684 g/kg；另有 3 批次检出标签未标识组分糖精钠，提示存在标签标识规范问题。3 结语采用 UPLC-MS/MS 法建立的牙膏中 7 种人工甜味剂的测定方法，7 种化合物在相应范围内线性关系良好（r2 0.998 9），加标回收率在 96.51%104.87%，RSD 在 0.83%2.73%，检出限为 0.004 0.050 g/kg。该法简便易行，准确度高，重现性好，适用于牙膏中7种人工甜味剂的快速检测分析，为制定法定标准提供参考。从而为打击滥用人工甜味剂行为提供及时有效的保障，在一定程度上保障人民牙膏日常使用安全。参考文献1 PUROHIT V,MISHRA S.The truth about artificial sweeteners:are they good for diabetics?J.Indian Heart Journal,2018,70(1):197-199.2 史卿.人工甜味剂诱发小鼠葡萄糖耐受性改变及饮食调节机制研究 D.杭州:浙江工商大学,2019:2-3.3 BEMSTEIN A M,KONING L D,FLINT A J,et al.Soda consumption and the risk of stroke in men and women J.American Journal of Clinical Nutrition,2012,95(5):1190-1199.4 PASE M P,HIMALI J J,BEISER A S,et al.Sugar-and artificially sweetened beverages and the risks of incident stroke and dementia J.Stroke,2017,48(5):1139-1146.5 WERSCHING H,GARDENER H.Sugar-sweetened and artificially sweetened beverages in relation to stroke and dementia J.Stroke,2017,48(5):1129-1131.6 邓浩,潘永波,张容鹄,等.UHPLC-MS/MS 法同时测定水果中的 7 种人工甜味剂 J.分析试验室,2021,40(9):1059-1064.7 赵春晓,蔡晶,江洋.HPLC 法同时测定牙膏中阿斯巴甜、糖精钠和安赛蜜 J.口腔护理用品工业,2013(4):36-37.8 国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.牙膏中丁磺氨钾和糖精钠的测定:GB/T 315322015 S.北京:中国标准出版社,2015.9 刘晓霞,丁利,刘锦霞,等.高效液相色谱-串联质谱法测定食品中 6 种人工合成甜味剂 J.色谱,2010,28(11):1020-1025.10 张树权,冯城婷,林秋凤,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测糕点中 6 种甜味剂 J.食品安全质量检测学报,2021,12(1):144-150.11 沈燕飞,朱仙娜,姚澄,等.阀切换离子色谱技术同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂 J.食品科学,2018,39(16):311-316.表 4 7 种人工甜味剂的回收率序号名称低中高RSD/%添加量/(g kg-1)回收率/%添加量/(g kg-1)回收率/%添加量/(g kg-1)回收率/%1阿斯巴甜0.297.640.499.150.898.950.832三氯蔗糖0.599.871.0100.622.0104.872.653安赛蜜0.597.341.098.652.0100.521.624糖精钠0.5101.351.096.572.097.642.555甜蜜素0.597.921.0102.42.098.32.56纽甜0.596.511.099.032.0101.912.737阿力甜0.599.471.096.142.097.551.71