基于igg4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用.pdf

目录基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用.1摘 要.IAbstract.31.材料与方法.81.1 实验材料.81.2 实验方法.142.结果.302.1 AWA抗原浓度.3()2.2 AWA的血清蛋白质组学分析.312.3 免疫反应性抗原的质谱鉴定.332.4 SjIPP生物信息学分析.412.5S/PP克隆、表达及鉴定.432.6 r夕/PP的诱导表达.473 讨论.524结论.54参考文献.55个 人 简 历.60致谢.61综述.62参考文献.69安徽医科大学硕士学位论文基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用摘 要目的血吸虫病仍然是世界上危害最为严重的寄生虫疾病，由于我国政府的高度重 视，我国血吸虫病疫情目前已达到基本控制阶段，传统的病原体直接检测技术已 失去了金标准作用，低流行区血吸虫病的诊断遇到了严峻的挑战，提高监测敏感 性为导向的低流行区监测技术是当前的重中之重，而血吸虫病的正确诊断是血吸 虫病监控的第一步，也是最关键步骤。发展一种简便、经济、敏感和特异，尤其 适合现场大规模检测的快速血吸虫病诊断方法，为我国血吸虫病的防控并最终消 除提供重要的工具。方法制作日本血吸虫感染动物模型，收集日本血吸虫成虫；制备日本血吸虫成虫 抗原（AWA）,进行两维电泳（2-DE）,再雇佣western-blot方法、用混合的血吸 虫感染患者血清筛选，最后用抗人IgG4二抗检测血吸虫成虫抗原中能够与患者 血清中IgG4抗体反应的抗原分子。切取这些与患者血清中IgG4结合的抗原分子 用胰酶消化，进行质谱鉴定，并进行进一步的生物信息学分析，寻找具有诊断价 值的候选分子，并克隆重组候选分子。最后将重组抗原包被反应板，用基于IgG4 二抗作为检测工具的ELISA方法，来评估候选抗原在血吸虫病诊断中的应用价 值。结果建立了日木血吸虫成虫两维电泳图谱，western-blot结果显示，基于IgG4为 检测工具的血清蛋白组学筛选出40多个具有免疫反应性的阳性蛋白点，其中有 16个点能够与原始的2-DE凝胶相对应。质谱鉴定结果表明，这16个点分属于 10个蛋白质，它们分别是日本血吸虫顺乌头酸酶（SjAA）、热休克蛋白70（SjHSP70）、M2型丙酮酸激酶（SjPKM2）、磷酸甘油酸酯激酶（SjPGKl）、a-L-岩藻糖甘酶（SjALF）、无机焦磷酸酶（SjIPP）、谷胱甘肽转移酶（SjGST）、0 本血吸虫2L7kDa抗原（Sj2L7）、22.6kDa膜相关抗原（Sj22.6）和曼氏血吸虫肌 安徽医科大学硕士学位论文浆钙结合蛋白(SmSCP)o通过生物信息学分析，SjIPP具有多种潜在的生物学功 能，更重要的是，SjIPP含有丰富的B细胞抗原表位，可能预示，SjIPP在血吸虫 病的疫苗开发和诊断应用中具有良好的前景。进一步，我们成功克隆并原核表达 H 了重组SjIPP(rSjIPP),而且纯化的rSjIPP纯度好，浓度也达到了 3.5mg/ml。ELISA结果显示，rSjIPP对急性血吸虫感染诊断的敏感性极高，达到了 100%,对慢性血吸虫感染诊断也较高，其敏感性为87.1%,其特异性为95%；可喜的 是，与其它寄生虫的交叉反应较低，分别是肺吸虫为3.7%、肝吸虫为4.5%、线 虫为4.2%。结论利用IgG4为检测工具的血清蛋白质组学，成功从日本血吸虫成虫中筛选出 了 SjIPP诊断候选分子，并成功重组出rSjIPPo ELISA结果证明，rSjIPP在血吸 虫病的诊断中具有良好的应用前景。关键词：日本血吸虫；蛋白质组学；IgG4；无机焦磷酸酶(IPP)；诊断2安徽医科大学硕士学位论文Screening and appl ication of antigen f or diagnosis of Schistosomiasis japonica base on IgG4-oriented proteomicsPostgraduate:Cao Hongrong Superv isor:Prof.Shen Jil ong AbstractObjectiv e Worldwide schistosomiasis continues to be a serious public health problem.Over a few decades,China has made remarkable progress in reducing Schistosoma japonicum infections in humans to a relatively low level.At present,schistosomiasis is about to be brought under control in china.The direct parasite examination gives rise to a relatively insensitive outcome because of low worm burdens,which leads to less efficiency in low transmission settings.Now,it is urgent that a search for a diagnostic approach with a simple,affordable,sensitive,and specific assay for field diagnosis of Schistosoma japonicum,is essential and should be given high priority towards full control and elimination of schistosomiasis.Methods Adult worms were collected from infected rabbits with Schisitosoma japonicum.Adult worm antigen(AWA)extract was prepared and subjected to two-dimension electrophoresis(2-DE).The reactive proteins were screening,excised,digested by trypsin and further identified by LC-MS/MS following IgG4-oriented Western blotting.The candidate molecules for diagnosis of schistosomiasis was cloned and expressed from the transformed E.coli after bioinformatics analysis.Furthermore,the recombinant protein was applied with enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and evaluated for its performance in ELISA for diagnosis for schistosomiasis.Resul ts This IgG4-oriented serological proteome assay yielded more than 40 immunodominant spots.Sixteen of these spots were precisely matched with a homologous 2-DE gel and successfully identified by LC-MS/MS as corresponding to 3安徽医科大学硕士学位论文ten different proteins.These proteins were S.japonicum aconitase(SjAA),heat shock protein 70(HSP70),pyruvate kinase M2 isoform(SjPKM2),phosphoglycerate kinase(SjPGKl),a-L-fucosidase(SjALF),inorganic pyrophosphatase(SjIPP),glutathione transferase(SjGST),21.7 kDa antigen(Sj21.7),tegument membrane-associated antigen(Sj22.6)and sarcoplasmic calcium-binding protein of S.mansoni(SmSCP).Bioinformatics analysis displayed that SjIPP possesed variety of biological functions and abundant antigen epitopes for B cell,which implied potential insight about diagnosis for schistosomiasis.Furthermore,SjIPP was successfully expressed,and the recombinant protein was further applied in the diagnosis of human schistosomiasis using IgG4-ELISA.The ELISA results revealed sensitivities of 100%and 87.1%for acute schistosomiasis and chronic schistosomiasis,whereas the assays showed a specificity of 95.0%with rSjIPP recombinant protein.Remarkably,rSjIPP showed low cross reaction with these sera infected with Paragonimus westemamiilung fluke),C.sinensis(liver fuluke)or nematodes(roundworms).The cross reaction rates were respectively 3.7%,4.5%and 4.2%.Consl usions SjIPP was successfully screened as a diagnostic candidate from AWA of Schistosoma japonicum by IgG4-oriented proteomics followed by expression.Our present study confirmed that rSjIPP was a useful diagnostic biomarker for Schistosoma japonicum infection.Keywords:Schistosoma japonicum;proteomics;IgG4;inorganic pyrophosphatase(IPP);diagnosis4安徽医科大学硕士学位论文刖目血吸虫病依然是世界上危害公众健康最严重的疾病之一 口。引起血吸虫病的 主要病原体有曼氏血吸虫、日本血吸虫、埃及血吸虫等。目前全球血吸虫病患者 超过2亿，风险人群超过7亿3（表1,图1）,每年因血吸虫病死亡人数28 万之多。我国是日本血吸虫病流行区，解放后，由于我国各级政府的高度重视，血吸虫病的流行得到了很好的控制，甚至有几个省或直辖市血吸虫病已经消除，我国血吸虫病疫情目前已基本达到控制阶段4,提高监测敏感性为导向的低流行 区监测技术和方法、以达到有效控制血吸虫病疫情一，防止疫情I口I升和反弹。表1：全球血吸虫感染及风险人群分布（2008年WHO/NTD报道）Proportion of the number treated in the region compared to number estimated to be infected in the regionTable 1:Schistosomiasis estimated infected and populations treated in 2008 as reported to WHO/NTDRegionEstimated infected populationEstimated population at risk of infectionPopulation received treatmentProportion of estimated infected population treated%*African214,216,248582,062,77011,700,6185.5European74576,94700EasternMediterranean14,O38,1H106,638,9072,665,02919.0Americas7,138,10051,066,73965,3351.0South-East Asian24211J1700Western Pacific1,332,26420,797,3253,069,475100Global236,725,709760,654,40517,500,4757.4在过去半个多世纪，我国血吸虫病的防治取得了重大的进步，目前多数地区 流行状态处于相对较低的水平，但在一些核心地区的局部区域，血吸虫病流行依 然存在，这些地区再次感染和反复化疗还时有发生。选择性地服用毗喳酮是目前 我国血吸虫病控制项口的重要策略之一，而血吸虫病的正确诊断是血吸虫病控制 项目实施的第一步，也是最关键步骤。然而，目前还没有一种理想的血吸虫病诊 断方法，这对我国实现血吸虫病的全面控制是一个巨大障碍。因此，迫切发展一 种简便、经济、敏感和特异，尤其适合现场大规模检测的快速血吸虫病诊断方 法，为我国血吸虫病的防控并最终消除提供重要的工具5,6J05安徽医科大学硕士学位论文SmonwrvS apewumQeN 小p and 3cFrom Grysee!5e al Human schistosomiasis Lar tee!200Low transmission(pre-elimination)High transmission图1:血吸虫病的全球分布2Fig 1:Global distribution of schistosomiasis目前血吸虫病的诊断方法主要有直接病原学检测、免疫学检测、分子生物学 检测7,8。直接病原学检测被认为是血吸虫病检测的“金标准”，包括改良加藤氏(Kato-Katz,K-K)厚涂片法、毛蝴孵化法(MH)、粪便盐水梯度离心法等9,10,这种方法经济、简捷、快速、特异性高，在流行区的血吸虫病诊断和控制中 发挥着重要的作用；然而该方法的敏感性较低，而且随着抗血吸虫药物的广泛使 用、卫生条件的改善和卫生习惯的改变，多地的血吸虫病得到了有效的控制，作 为“金标准”的直接病原学检测失去了“金标准”的能力11。因此，能够检查出“真 正的“血吸虫感染患者至关重耍，低流行区血吸虫病的诊断和监测面临着严峻的 挑战5,12。最近，基于DNA检测技术在血吸虫病的诊断中展露出良好的应用前景，该 技术被证明对血吸虫病的疗效考核和监测管理具有重要的参考价值13,14o根据 动物实验和人体研究，愈来愈多的证据表明，DNA检测技术由于具有高敏感性和 高特异性，提高了血吸虫病的诊断水平。研究证明，PCR实验能够特异性扩增血 吸虫的DNA片段，而对其它蠕虫DNA无扩增反应。此外，PCR法具有非常高的 敏感性，它能够检测到每克标本中2.4个虫卵；而且real-time PCR法不仅能够检 6安徽医科大学硕士学位论文测感染强度（虫荷定量），还能够早期诊断，在感染后1-30天就可以检测出，因 此它对新近暴露的人群（如旅行者）的急性感染诊断意义重大15,16。然而尽管 PCR技术前景喜人，但仍有些问题需要改进，目前该技术还处于研究阶段，各 种报道方法的敏感性结果存在较大差异，还存在虫卵阳性而PCR阴性的结果。因 此，分子生物学检测技术方法必须要进行进一步的改善和提高。此外，由于分子 生物学检测技术需要特殊仪器，且试剂成本昂贵，不适合大规模现场检测。血吸虫病的免疫学检测技术近年来得到了长足的发展，进行了大量的研究。环卵沉淀试验（COPT）和间接血凝试验（IHA）曾一度在我国广泛使用，其方法 学也进行了一系列的改良。COPT在非流行区健康人群的敏感性达到94.1%-98.6%,假阳性率也较低，只有2.5%-3.6%,但对于流行区反复化疗的患者的敏感 性较低，且操作复杂、耗时长17,18。IHA是在上世纪60年代、继COPT后发 展起来的，目前在我国的一些血防所和基层医院仍在使用。与COPT比较，IHA 相对简便、快速，但阳性预测值（PPV）较低，敏感性和特异性各报道不一，交 又反应较高，与肺吸虫的交叉反应达到64%-84%19o这些都限制了它们进一步 的应用。酶联免疫吸附试验（ELISA）是在上世纪70年代发展起来的用于血吸虫 病的诊断，传统的ELISA方法使用的是血吸虫成虫（AWA）和虫卵可溶性抗原（SEA）粗抗原，其敏感性和特异性有所提高，阴性预测值（NPV）较高，但大 多数报道的PPV同样也很低。利用重组抗原作为诊断工具的免疫学方法近年来进 行了大量的研究，目前测试的抗原主要有SjGAPDH.rSjLAP、rSjFBPA.rSjGST、rSj23HD、rSj32、rSjl4-3-3 rSj22.6 rSj31-b等，这些抗原中大多数具 有较高的敏感性和特异性，但与上述方法一样，交叉反应比较高20-22,其可靠 性仍需进一步大规模的验证。IgG是体液免疫中功能和结构最复杂、含量也最丰富的一类免疫球蛋白。IgG 有四个亚类，根据发现的先后顺序命名为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4,其中IgGl含 量最高，而IgG4含量最低，但在蠕虫感染和过敏性疾病患者血清中，特异性IgG4 水平明显升高8,23-在血吸虫病患者，有研究显示，IgG4水平与虫荷呈正相 关，而且还与宿主对血吸虫的易感性有关；此外，血吸虫感染者经有效治疗后，7安徽医科大学硕士学位论文血清中的特异性IgG4水平明显降低，一定疗程后甚至恢复到正常水平。由于蠕虫 存在丰富的多糖抗原和磷酸胆碱，这是引起蠕虫间交叉反应的主要抗原，而IgG4 抗体分子的可变区不能够识别多糖抗原和磷酸胆碱，避免了交叉反应的发生，具 有更高的特异性的，因此，特异性IgG4检测对血吸虫感染不仅有较高的诊断价 值，而且在疗效考核和愈后判断方面也具有潜在的应用前景，值得进一步研究开 发。本研究旨在蛋白质组学技术基础上，利用日本血吸虫感染的患者血清中的特 异性IgG4,检测日木血吸虫成虫抗原，筛选日本血吸虫病诊断候选分子，并进一 步评估它们在血吸虫病诊断和疗效考核中的表现。1.材料与方法1.1实验材料1.1.2 血清标本50份急性血吸虫感染血清、70份慢性血吸虫感染血清，均来自于安徽 省血吸虫病流行区，由安徽省血吸虫病防治研究所和东至县血吸虫病防治 站收集。27份肺吸虫、22份肝吸虫和24份线虫感染的阳性血清来自于非 血吸虫病流行区，60份正常血清来自于非血吸虫病疫区的健康大学生。所 有标本收集后置-80c保存备用。1.1.3 实睑试剂含尾蜘的阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所；新西兰大白兔购自 安徽医科大学实验动物中心，3-4月龄，体重2.5-4.5 kg；pET-28a质粒和 E.coZZ XL I-blue E.coli BL2.DH5a菌株均为安徽医科大学病原生物学教研室保存。双向电泳系统（美国伯乐公司）、UMAX Powerlook 2100XL 扫描仪（台湾力捷技术公司）、LC-MS/MS液质联用质谱仪（美国热电公 司）、DNA梯度扩增仪（德国Biometra公司）、全自动酶标洗板机（美国 Biotek公司）、全自动酶标仪（美国Biotek公司）。8安徽医科大学硕士学位论文双向电泳用IPG胶条、载体两性电解质（Bio-Iyte）、2D样品纯化试剂 盒、尿素、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT）、矿物油、碘乙酰胺、硫麻、低熔 点琼脂糖等购于美国伯乐公司；辣根过氧化物酶标记（HRP）抗人和抗兔 IgG4 亚型抗体均购自美国 Southern-Biotech 公司；Protease inhibitors cocktail package购于罗氏公司；乙口青、三氯乙酸、碳酸氢镂、乙酸购于Sigma公 司；胰酶（质谱级）购于Promega公司。TRIzol为美国Invitrogen公司产 品；pGEM-T easy载体、逆转录试剂盒购于美国Promega公司；质粒提 取、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；小鼠抗His-tag单克隆抗体为德 国默克Novagen公司产品；预染蛋白质分子量标准购于加拿大MBI公司；Ex-Taq聚合酶为大连宝生物公司产品，BamH I 0 Xho I限制性内切酶由大 连宝生物公司生产，引物由上海生工生物工程有限公司合成。分装成10小管，每小管1ml,-20冰箱保存。1.1.4主要试剂配制水化上样缓冲液尿素7M4.2g硫月尿2M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65mmol/L0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%（w/v）50Pli（40%）（现加）溟酚蓝0.001%10（1%漠酚蓝）MilliQ水（电导2岗）定容至10ml胶条平衡缓冲液母液 尿素6M36g9安徽医科大学硕士学位论文2%0.375mol/LpH8.8 25ml20%SDSTris-HCl甘油MilliQ 水分装成10管，每管10mL胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液DTT充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液碘乙酰胺充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖Tris甘氨酸SDS澳酚蓝MilliQ 水加热溶解至澄清，2g(1.5M pH8.8 Tris-HCl)20ml定容至100ml20C冰箱保存。10ml0.2g10ml0.25g0.5g0.303g1.44g1ml(10%SDS)lOOpl(1%澳酚蓝)定容至100ml0.5%25mmol/L192mmol/L0.1%0.001%室温保存。10安徽医科大学硕士学位论文LB液体培养基：胰蛋白胺 1g酵母提取物 0.5g氯化钠 0.5g用5N NaOH调pH值至7.0,用去离子水定容至100ml,高压灭菌后于 4备用。LB固体培养基：将上述培养液按照l.5g/100ml加入琼脂粉，高压溶解，稍冷却后制板。20%IPTGIPTG 2g去离子水 8ml定容10ml,用0.22卜im滤器过滤除菌，分装1ml,-20。保存（使用时终浓度为1 mmol/L）2 0mg/ml X-galX-gal 200mg二甲基甲酰胺 8ml溶解后用二甲基甲酰胺定容至10ml,用0.22um滤器过滤除菌，分装 1mL-20避光保存。2 x蛋白上样缓冲液：pH 6.8 Imol/LTris-HCl 1ml2.筑基乙醇 1ml10%SDS4ml11安徽医科大学硕士学位论文0.1%浪酚蓝 0.5ml甘油 2ml无菌水 1.5ml30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29gN,N-亚甲双丙烯酰胺 1g溶于60ml去离子水中，37助溶，定容100ml过滤后放置于棕色瓶中室 温保存。10%SDS：称取SDS 10g,加入90ml蒸储水，68助溶，加几滴浓盐酸调pH至7.2,定容 lOOmL10%过硫酸镂：称取0.1g过硫酸锈溶于1ml蒸僧水，临用前配制（4可保存一周）。浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH 6.8 Tris-HCl缓冲液）：称取6.055g Tris,加入70ml蒸储水，使之溶解，用浓盐酸调至pH6.8,再加蒸储水至总体积100ml,4c保存。分离胶缓冲液（L5mol/L pH 8.8 Tris-HCl缓冲液）：称取Trisl8.16g,先用70ml蒸储水溶解，再用浓盐酸调至pH 8.8,最后力口水补至100ml,4c保存。Tris甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）：12安徽医科大学硕士学位论文去离子水900mlTris 碱3.02g甘氨酸14.4g10%SDS10ml用去离子水补至1000ml转移缓冲液：甘氨酸 2.93gTris 碱 5.82gSDS 0.37g甲醇 200ml加双蒸水至1000ml脱色液：将甲醇、水、冰醋酸按45：45：10的比例配制。考马斯亮蓝R-2 50染液：称取0.25g考马斯亮蓝R250溶于100ml脱色液，用1号Whatman滤纸过 滤染液。0.01M pH 7.4磷酸盐(PBS)缓冲液：NaCl 8gKC1 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g13安徽医科大学硕士学位论文于800ml蒸储水中溶解，用HC1调pH至7.4,定容1000ml包被稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6）：碳酸钠 1.5g碳酸氢钠 2.9g加双蒸水至1000ml1.2实验方法1.2.1 血吸虫感染动物模型的建立将50只日本血吸虫尾蝴感染的阳性钉螺置于去氯水中，25C、光照2 小时，逸出尾蜘。用接种环从水面挑取尾拗，移至盖玻片上，在解剖镜下 观察活力并计数；固定新西兰大白兔，剃除腹部体毛，以去氯水湿润皮 肤，将附有尾蝴的盖玻片覆于其上（含尾蝌面与皮肤接触），保留15-20mino每只家兔感染日本血吸虫尾物1000条左右，清洁级饲养。1.2.2 兔血清的收集分别于尾蝴感染前和感染后42天，耳缘静脉抽取静脉血液或剖杀后心 脏取血，分离血清，-80保存备用。1.2.3 日本血吸虫成虫的收集在尾蝴感染后6周（42天），耳缘静脉注射肝素抗凝，门静脉灌流收 集日本血吸虫成虫，用生理盐水洗涤三次，离心后弃上清，收集成虫，称 重后置-80保存备用。124血吸虫成虫抗原（AWA）的双向电泳（2DE）1.2.4.1 AWA 的制备1）取血吸虫成虫约400mg于匀浆器内，加入1ml磷酸盐缓冲液（PBS）和适量 的蛋白酶抑制剂混合溶液。2）冰上匀浆lOmin,将匀浆液吸入1.5ml离心管内。14安徽医科大学硕士学位论文3）4,18 OOOrpm离心15min,小心吸取中间层澄清液体04）将收集的澄清液体再次4 18 000rpm离心60min,收集上清，测定上清液蛋 白浓度后，每管分装100口，置-8（）保存备用。L2.4.2 AWA蛋白浓度的测定（BCA法）1）吸取3ml BCA试剂A和60MBeA试剂B 工作液，充分混匀。2）吸取lOjil蛋白标准液（5mg/ml）,用生理盐水稀释至lOOpd,终浓度为 0.5mg/mlo3）将标准品按1、2、4、8、12、16、20川加到96孔板标准品孔中，用生理盐 水补足至20似。4）加“ilAWA与样品孔中，用生理盐水补足至20口。5）每孔加入混匀后的BCA工作液200可，混匀，37孵育30min。6）测定波长550nm处的吸光度值。7）根据标准品各孔的浓度和吸光度值，绘制标准曲线。8）根据标准曲线公式，计算出AWA样品蛋白浓度。12 4.3AWA样品双向电泳（2DE）前纯化1）从-80冰箱中取出AWA样品2管（每管100川），室温放置解冻。2）每管加入300川沉淀剂1,充分涡旋，冰上孵育15min.3）每管继续加入300|il沉淀剂2,充分涡旋。4）15 000g离心5min,立即弃上清，将离心管再次离心15-30sec（离心管放置方 向应与上次一致），去除残存上清。5）加入40（11洗液1于沉淀部位，涡旋，15 000g离心5min,去除上清。6）加入25似超纯水于沉淀顶部，涡旋10-20sec。7）加入1ml洗液2（已.2（）预冷）和5削洗液2添加剂，涡旋Imin。8）-20孵育30min,期间每隔lOmin取力离心管,涡旋30sec。9）25 000g离心5min,去除上清，将离心管再次离心15-30sec（离心管放置方向 应与上次一致），去除残存上清。沉淀应为白色，空气中干燥3-5min,不要过 分干燥，否则难于重悬。15安徽医科大学硕士学位论文10）每管加入130W 2-DE水化上样缓冲液，涡旋Imin,室温孵育5min,再次涡 旋Imin,使其充分溶解。11）15 000g案温离心5min,澄清样品。L2.4.4AWA等电点聚焦（IEF）1）从20冰箱中取出IPG胶条，室温放置lOmin（pH3.10,线性）。2）吸取上述124.3中纯化后的澄清样品125口，均匀的铺入等电点聚焦盘的槽 中。3）用镶子小心去除IPG胶条上的保护层。4）分清胶条的正负极，轻轻地将胶面向下置聚焦盘中的样品上，正负极一定要 对好，注意胶条与样品接触面不要产生气泡。5）在每根胶条上覆盖矿物油1mL防止聚焦过程中样品中液体蒸发，尿素结晶 析出。6）盖上盖子（注意正负极），设置IEF程序，程序如下：水化50V15h主动水化S1250V线性30min除盐S2500V快速30min除盐S34000V线性3h升压S44000V快速20,000Vhur聚焦S5500V快速lOh保持7）设置聚焦的胶条数为2,极限电流为50|iA/根，聚焦时的温度为17。8）合上IEF仪器盖子，接通电源，开始聚焦。16安徽医科大学硕士学位论文1.2 4.5十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）1）按下方配制12%SDS-PAGE凝胶（分离胶）两块：超纯水 3.3ml30%丙炜酰胺溶液 4.0ml1.5mol/LpH8.8 Tris-HCl 缓冲液 2.5ml10%SDS 100110%过硫酸锭 10011TEMED 4m总体积 10ml2）安装好玻璃板，速在两玻璃板间灌注凝胶溶液，上方预留约1cm,在丙烯酰 胺溶液上层轻轻覆盖超纯水，将凝胶置于室温。3）配制胶条平衡缓冲液L4）在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。5）将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入2ml胶条平 衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。6）配制胶条平衡缓冲液II。7）第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用 滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表 面）。再加入胶条平衡缓冲液IL继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。8）用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好 的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着 自己。9）将琼脂糖封胶液进行加热溶解。17安徽医科大学硕士学位论文10）将10 x电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成lx电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的 气泡。11）第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液IL并 用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表 面）。12）将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镶子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 lx电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同 样操作。13）将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在 凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。14）用镜子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺 凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镶子、压舌板 或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。15）放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。16）在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。17）在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用低电压50V,待样品在完 全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电压至100V,待溟酚蓝指示剂达 到底部边缘时即可停止电泳。18）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防 止污染胶面）。19）进行考马斯亮蓝染色、脱色或继续进行Western-blot。1.2.5诊断抗原的血清学筛选及质谱鉴定1.2 51免疫血清筛选“Western,bl otI）电泳结束后，戴上手套，裁6张滤纸和一张硝酸纤维素膜（NC）,大小应与凝 胶大小吻合，将其和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。2）将塑料夹黑色面（阴极）向下，铺上海绵，再在其上放置3张用转移缓冲液 浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐。18安徽医科大学硕士学位论文3）从电泳槽上撤下放置SDS-PAGE凝胶的玻璃，小心把凝胶铲起，平铺在滤纸 上，再把NC膜放在凝胶上，精确对齐，然后用一玻璃棒做滚筒以挤出气泡，注意凝胶与膜间不能留有气泡。4）最后将3张滤纸放在NC膜上方，各层精确对齐并排除气泡。5）将塑料夹黑色面（凝胶侧）朝向阴极，将夹层物中NC面朝向阳极，接通电 源，恒流200mA,转移2h。6）断开电源，把NC膜转移至含封闭液（5%脱脂奶粉.PBS溶液）的平皿中，4封闭过夜。7）翌日弃去封闭液，加入1：200稀释的血吸虫感染患者混合血清，37c孵育1 小时。8）用PBST洗NC膜4次，每次10分钟。9）再加HRP标记的羊抗人IgG4（工作浓度为1：25 000）,37孵育1小时。10）用PBST洗NC膜4次,每次10分钟。11）暗室内剪切与凝胶大小完全一致的胶片，混匀增强化学发光（ECL）A液和B 液，涂抹于NC膜上，覆盖胶片曝光。1.2.5.2图像扫描与分析扫描胶片与同源的考马斯亮蓝染色的2-DE凝胶，利用Bio-Rad公司专业 双向电泳分析软件PDQuest软件（Version 8.02）结合人工识别修正，匹配胶 片与凝胶上的点。1.2.53 凝胶内目的蛋白的消化1）采用干净的剪刀剪去移液器吸头少许，用该吸头挑取口的蛋白点，放置 于干净的EP管中（1号），切碎（约Imn?）,点动离心12000rpm,1Osec o2）用50mmOI/LNH4HCO3洗涤胶点，用移液器吸弃液体。3）加入不少于 200似 的 30%ACN/50mmol/L NH4HCO3,振荡 30sec,在室 温下放置5-10min后，移弃液体。重复此步直至考马斯亮蓝完全被洗 脱。19安徽医科大学硕士学位论文4）加入 200m 的 50%ACN/50mmol/L NH4HCO3,移弃液体，再加入 100%ACN,直至胶体变成白色，移弃液体。5）真空抽干l（）-30min直至胶体完全干燥。6）在每个上述的EP管中加入50国 含0.1 胰蛋白酶的50 mmol/L NH4HCO3,37 c酶解过夜。7）收集酶解液体于另一个干净的EP管（2号）。8）加入200Pd 6（）%ACN/5%三氯醋酸（TFA）至1号管，水浴超声Imin,收集液体于2号EP管中。重复一次。9）在1号EP管中加入100%ACN 200111,直至胶体变白，收集液体于2号 EP管中。10）冷冻真空抽干，加入25 HL 50 mm0I/LNH4HCO3/O1甲酸，重悬，质谱 检测。1.2.5.4质谱鉴定上述蛋白酶解片段由Therm。LTQ离子胧质谱仪分析鉴定（美国热电集团），采用液相色谱质谱联用鉴定方案，液相色谱为GE公司，型号为Ettan MDLC HPLCo蛋白肽段在线分离，色谱柱为C18柱（3.5（im,300A,Agilent Technologies）,采用线性梯度，0.1%蚁酸（溶质A）和乙晴（溶质B）（4-60%乙 月青，50min）,质谱仪扫描范围为400-2000amu,选取最高佶号的5个肽段进行二 级分析（鉴定出后，随后的3分