外周血干细胞采集物经长期液氮保存后活性和免疫学特性的变化.pdf

硕士学位论文外周血干细胞采集物经长期液氮保存后活性和免疫学特性的变 化摘要外S3缸干细胞采集物经长期液氮保存后111活性和免疫学特性的变化 摘要 目的比较长期液氮深低温冷冻保存的外周血造血干细胞（PBSC）采集物与新 鲜采集物中有核细胞（NC）的活性、CFU-GM生成能力的差异，探讨影响CFU-GM 形成的相关因素；比较长期液氮深低温冷冻保存的外周血造血干细胞采集物与新 鲜采集物中淋巴细胞的免疫表型及其分泌细胞因子能力的差异；观察外周血干细 胞采集物中有核细胞经长期深低温冷冻保存后形成CIK细胞能力及其细胞毒活性。方法 外周血干细胞采集物标本共47例，冷冻标本按保存时间分为两组:实验1 组（保存35年，26例），实验2组（保存57年，9例）；新鲜采集的标本（12例）作为对照组。冷冻标本经解冻、新鲜标本经裂解红细胞后行CFU-GM培养，流式细 胞学检测有核细胞中核酸染料7AAD着色的细胞百分比（代表坏死率）以及有核细 胞中表达活化的c aspase-3的细胞百分比（代表凋亡率工 流式细胞学检测CD34+细 胞百分比及淋巴细胞免疫表型。的有核细胞悬液用lOpig/mlPHA刺激分泌 细胞因子，培养48h后收集培养液上清。EILSA法检测培养液上清中的细胞因子：IL-2、IFN-7和TNFa。利用10例冷冻标本和7例新鲜标本经IFN 土、抗CD3Mc Ab、IL-2联合诱导扩增CIK细胞，14天后收获细胞，检测活力、免疫表型，MTT法检 测CIK细胞对K562、Raji细胞株的杀伤活性。结果两实验组的坏死率和凋亡率均高于对照组（尸V0.05）,实验2组凋亡率为 35.60%17.51%,高于实验 1 组（24.14%16.87%,40.031）。CFU-GM/lOZc 随 保存时而延长有下降趋势，CFU-GM/I05NC与CD34+细胞的百分比有显著相关性（PV0.05）,与有核细胞活性无相关性。三组的淋巴细胞免疫表型及其分泌的IL-2、IFN和TNFa无统计学差异。冷冻标本和新鲜标本来源的CIK细胞分别扩增了 41.8 倍（11.50-80.64倍）和22.8倍（11.8435.50倍），活化后 CD8+T细胞比例升高（尸0.05），但CD3+CD16/56+细胞比例并没有升高。两种来源的CIK细胞对K562、Raji细胞株的杀伤作用无显著性差异。结论 与新鲜的外周血干细胞采集物相比，冷冻保存37年的采集物中有核细 胞活性减低，体外形成CFU-GM的能力下降：但淋巴细胞的免疫表型和分泌IL-2、IFNf 和TNF-a的能力无明显差异。冷冻PBSC采集物中的有核细胞体外形成 CFU-GM的能力下降可能与CD34+细胞的活性丢失有关。利用长期冷冻保存的外周 血干细胞采集物可以大量扩增出CIK细胞，具有与新鲜标本来源的CIK细胞相同的 细胞毒活性。关键词 外周血造血干细胞；冷冻保存；活性；表型；CIK细胞；细胞毒活性IAbstractThe Changes of Viability and Immunogenicity of PBSC Collections After Long-termCryopreservationAbstract Objective To c o mpare n u c leated c ell viability CFU-GM-f brmin g c apability between the f resh an d the lo n g-term c ry o preserved PBSC c o llec tio n s,an d to stu dy the f ac to rs whic h might c o rrelate with the CFU-GM.To c o mpare immu n o phen o ty pes an d f u n c tio n s o f sec rec tin g c y to k in es o f ly mpho c y tes in the c o llec tio n s between the f resh an d f ro zen samples.To o bserve whether CIK c ells c o u ld be prepared f ro m lo n g-term c ry o preserved PBSC c o llec tio n s an d still retain the c y to to xic ity.Methods Amo n g the to tal 47 samples o f PBSC c o llec tio n s,f ro zen samples were divided in to two gro u ps:gro u p 1(c ry o preserved f o r 35 y ears,n=26)an d gro u p 2(c ry o preserved f o r 5-7 y ears,n=9);f resh samples(n=12)were as c o n tro l.Flo w c y to metry metho d(FCM)based o n 7AAD o r c aspase-3 stain in g was applied to assess the degree o f c ell n ec ro sis(7AAD+)o r apo pto sis(c aspase-3+)in c ry o preserved an d red-c ell ly tic c o llec tio n samples.Ly mpho c y te immu n o phen o ty pes an d the perc en tage o f CD34 po sitive c ells were also detec ted by FCM.CFU-GM c u ltu re was do n e to stu dy the hemato po ietic ac tivity.The NC su spen sio n s(5xl05/ml)were stimu lated by PHA(10|ig/ml).An d af ter simu lated 48 h,the c u ltu re su pern atan ts were c o llec ted to detec t the c o n c en tratio n s o f IL-2、in terf ero n-y(IFN-7)an d TNF-a by EILSA.Used 10 f ro zen samples an d 7 f resh samples to expan d CIK c ells by IFNy,an ti-CD3 mo n o c lo n al an tibo dy an d IL-2.On the 14th day,CIK c ells were harvested to exam viability an d an aly se immu n o phen o ty pes an d c y to to xic ity.Results Bo th the n ec ro sis an d apo pto sis levels o f gro u p 1 an d gro u p2 were higher than c o n tro l gro u p(P0.05);apo pto sis c ell o f gro u p2 was mo re than gro u p 1(35.60%17.51%to 24.14%16.87%,产=0.031).CFU-GM/105NC dec reased as the c ry o preservatio n phase pro lo n ged an d it was the perc en tage o f CD34+c ells,bu t n o t the c ell viability c o rrelated well with CFU-GM/105NC in the c o n tro l an d gro u p 1.There were n o statistic ally dif f eren c es in immu n o phen o ty pes an d sec reted c y to k in es amo n g three gro u ps.CIK c ells f ro m lo n g-term f ro zen samples were expan ded 41.8-f bld(ran ged f ro m 11.50-to 80.64-f bld),an d 22.8-f bld(ran ged f ro m 11.84-to 35.50-f o ld)f ro m f resh samples.The perc en tage o f CD8+c ell in c reased af ter c u ltu red(P CD49d、CD49e.CD44、CD43 等的表达。在冻存复苏的 外周血CD34+细胞表面下调的L-选择素在体外孵育前4小时内上调不明显，过夜后表 达才恢复为冷冻保存前的46%120%,而纯化CD4+细胞时引起的L选择素的下调在 孵育4小时内显著上调。这可能进一步证明细胞冷冻后是延缓进入细胞周期的。13冷冻保存对淋巴细胞的影响经动员后外周血造血干细胞采集物中除含有所需的造血干细胞以外，通常还含有 大量的单核细胞和活化T淋巴细胞同，其中的成熟活性T淋巴细胞含量是骨髓中的淋巴 细胞的十倍以上倒。因此冷冻保存可能会影响移植物的免疫学特性“早在上世纪七十 年代，人们就关注了冷冻保存对免疫细胞的影响。当时有报道显示冻存的淋巴细胞在 同种异体混合淋巴细胞反应中仍可保持异基因刺激和增殖能力：九十年代，用酶联免 疫吸附测定(ELISA)方法检测冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)分泌的细胞 因子，证明经过冷冻保存的单个核细胞在脂多糖(LPS)的刺激下可增强分泌IL-2、IL-6、TNF-a.IFN-y.U10等的能力，而分泌IL-12的能力下降1叫。分泌IFN”、IL-6能力 的增强与冷冻保存灭活了可分泌前列腺素E-2(PGE-2)等免疫抑制因子的单核细胞有 关；而TNF、IL12分泌能力的变化则与内源性IL-10的产生相互影响。另外，冷冻保 存似乎可增强T淋巴细胞对植物凝血素(PHA)刺激分泌IL-2反应的敏感性冽。近年来，有研究用ELISPOT的方法来研究经冻存后的外周血单个核细胞分泌细胞因子的能力，同样证明冻存并不影响有丝分裂原刺激T淋巴细胞分泌细胞因子的能力，而且CD4+、CD8+T细胞对回顾性抗原的刺激仍维持足够的分泌细胞因子的能力灯。但HIV感染患 者的淋巴细胞在冻存后减弱了对HIV-p24抗原和部分回顾性抗原如巨细胞病毒、流感病 毒B的增殖反应J】。这一点在研究免疫缺陷患者的淋巴细胞功能时应该值得注意，必 要时仍需以新鲜的外周血标本来检测。同造血干/祖细胞一样，冷冻保存会减少淋巴细胞表面部分粘附分子的表达：如 CD62L、CCR53,关于冻存对淋巴细胞亚群分布的影响有数篇报道，但结果并不一 致24-281,外周血造血干细胞采集物若能在保存后仍维持适当的淋巴细胞亚群及生物学 活性，则可以促进造血，提高抗感染、抗肿瘤免疫等，对那些自体移植的肿瘤患者而言 具有重要的临床意义。1.4冷冻保存对单核细胞的影响单核细胞在体液免疫和细胞免疫中具有重要的调节作用，它们通过不同亚群分泌 的辅助性因子和PGE-2而起着辅助或调节作用。分泌PGE-2的单核细胞对免疫反应起 下调作用，这种单核细胞对冷冻处理较敏感，经冻融后被灭活3，从而影响了淋巴细 胞的分泌细胞因子功能的改变。Dan c igerg网】用两步密度梯度法从300ml360ml的肝 素抗凝外周血中分离出高纯度的单核细胞(90.6%),并按常规液氮冷冻保存方法进 行了冻存。复苏后检测单核细胞粘附内皮细胞、对FMLP(N-f brmy l-L-methio n y l-L-leu c y l-L-Phen y lalan in e)的趋化、向 巨噬细胞和树突细胞诱 导等能力与新鲜分离的单核细胞无明显差异。二保存条件的优化2.1保存温度的选择4文献综述外周血造血干细胞体外保存的研究进展在4C下保存PBSC,简单、经济、实用，在短期内特别是右5天的保存，已经成 为支持高剂量化疗的常用手段，但仍然无法长期有效的保存。通过程控降温、然后 将造血干细胞保存于液氮的经典方法已有几十年的历史，其效果好，复苏的细胞损失 少，细胞存活率及回收率均较高。Magrin四等报道，CD34+细胞活力和CFU-GM 的回 收率能达到81.5%和70%但液氮保存费用昂贵、操作复杂、融化后易发生细胞聚集，故研究者一直在研究一种简便、有效且经济的造血干细胞体外长期保存方法。自1983年Stif f等应用6%HES、5%DMSO和4%人血白蛋白作为冻存保护剂，经非 程控降温冻存造血干细胞取得较好的效果之后，越来越多的研究表明经过非程控降温 直接-8CTC冻存外周造血干细胞是一种行之有效的方法。1991年，Mak in o】用这种方 法保存PBSC 518个月，细胞活率为88.45%3.6%,CFU-GM回收率73.8%4.1%,红 系爆式集落形成单位（BFU-E）回收率为82.25%6.9%Katay ama网等报道甫这种方法 保存PBSC 5年，细胞回收率为80%,BFU-E回收率为91.0%26.0%,CFU-GM回收率 79.4%3%。这项研究结果表明直接-80冻存外周造血干细施也适用于长期保存，但 直接80是否可长期冻存外周造血干细胞尚需待临床研究进一步确认。In adajl1却用-80。保存了35月的PBSC在临床上获得了成功植入，尽管他的研究认为冷冻保存时间 与CFU-GM回收率成负相关，保存三年的PBSC的CFU-GM回收率仅为56%。这至少说 明80体外保存三年的外周造血干细胞仍可在临床上成功使用。Tak au eB】比较了两组（各12人）进行PBSC移植的患者，一组未经程控降温放于80P,以5%DMSO和6%羟 乙基淀粉（HES）为保护剂，一组以10%DMSO为保护剂，经程控降温放于液氮中。两 组患者粒细胞和血小板的恢复无差异，提示简便的非程控降温保存干细胞可有效应用 于临床。Mo n tan ari M等的也比较了这两种PBSC冷冻保存方法对回输后造血重建情况 的影响，非程控降温直接-80保存组（192例）的早期植入功能受损外，移植后的其 他临床过程与液氮保存组（69例）无明显不同，两组的长期造血重建相当，所有患者 均稳定植入，没有发生晚期造血衰竭.Ku do Y13刀等将冷冻袋置于保护性铝盒中，再放 在泡沫盒后置85冰箱中，并将小样置于冻存管中放在两层泡沫盒中，同样置-85P 冰箱中，检测冷冻保存袋和冷冻保存管的温度变化，发现温度下降的速率是非常令人 满意的，故作者将这种保存方法称之为一种简便的程控降温方法。目前，通过非程控 方法直接将PBSC在-80冷冻保存已成为一种新的趋势和潮流。22冷冻保护剂的选择目前造血干细胞保存最常用的保护剂为：DMSO、HES和白蛋白等。DMSO为渗 透性保护剂，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内 外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免 受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。DMSO还能显著地改变细胞内许多酶的活性，抑制蛋白的合成；改变细胞的呼吸功能，使细胞耗氧量下降；它还是一种自由基清除剂，可减轻冷冻及复温过程中产生的自由 基对细胞的损害。HES是非渗透性保护剂，溶于水但不能渗入细胞内，使细胞处于过 冷状态，降低溶质浓度，从而保护细胞。白蛋白对细胞膜则有稳定作用。将渗透性保护剂和非渗透性保护剂连用可产生理想的协同低温保护作用，同时也 可减少不同冷冻保护剂的毒性作用-关于各种冷冻保护剂的浓度及联合应用已进行了 很多探索。大多研究推荐10%的DMSO作为冷冻保护剂液氮保存PBSC,Bak k en AM38 等通过对液氮法保存PBSC小样本的研究发现DMSO的终浓度为5%时保存一年的样本 细胞活力和集落生成能力高于10%DMS。组。但由于这是小样本研究，5%DMSO作为 终浓度保护剂保存自体PBSC尚需进一步的临床研究。东南大学硕士学位论文近年来，许多研究报道了一种新的冷冻保护剂海藻糖与其他冷冻保护剂联合 使用显示出较好的冷冻保护作用。海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，特性 非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护 膜，可以非常有效地保护生物膜和生物大分子，从而避免细胞受到干燥、冷冻和渗透 压巨变造成的伤害。实验证明在液氮保存或非程控降温-8(rc冰箱冷冻保存的常规冷冻 保护剂中加入海藻糖可以明显提高脐血(CB)干/祖细胞的各类集落的回收率，这提 示海藻糖对各系造血干/祖细胞没有特别的偏倚保护作用阳，砌。长期培养起始细胞(ETC-IC)培养也证明海藻糖至少可以对造血干/祖细胞保持与DMSO相同的保护作用 39,41海藻糖和生物抗氧化剂过氧化氢酶合用可以更好地保护脐血/胎肝造血干/祖 细胞表面粘附分子和生长因子受体以及相关功能，如对M210B细胞的黏附能力、对生 长因子IL-3,干细胞因子(SCF)的反应和长期集落生成能力等长久 最新的研究报道口司，也证实联合这两种佐剂添加到常规冷冻保护液中，对脐血造血干细胞表面与迁徙、粘 附功能有关的分子有更好的保护作用。与不添加这两种成分的对照组相比，复苏后的 细胞对基质细胞来源的因子la(stro mal-derived f ac to r-1 alpha)的反应(迁徙能力)好，其受体CXCR4高表达；对这些迁徙的细胞分析集落形成能力，证明迁徙的细胞为早期 造血祖细胞，可形成各种髓系克隆。脐血细胞表面与归巢相关的分子FLT3R也高 表达，对FET3配体反应好，粘附于间质和细胞外基质的能力较对照组也高。10%DMSO 联合海藻糖、过氧化氢酶冻存小鼠骨髓干细胞可以减少细胞凋亡和反应性活性氧分子 的产生；小鼠体内形成CFU-S、pre-CFU-S的能力和短/长期造血干细胞植入能力均较 单用10%DMSO的对照组高】。目前常用生物抗氧化剂有维生素C(Vit-C),Q维生素 E C a-Vit-E)的醋酸盐和过氧化氢酶等，以过氧化氢酶的保护作用最好也。23保存时细胞浓度非程控降温80保存外周血造血干细胞时可以以较高的细胞浓度保存，从而可减 少因回输过多的冷冻保护剂造成的不良反应，也可以节省保存空间。Kawan o,Y等比较 了在2X 107/ml-7X lO7/mi和2X 10%保存pbsc的CFU-GM回收率，虽然高细胞浓度保 存组CFU-GM回收率比低细胞浓度组略低，但差别并无统计学意义，且临床上干细胞 移植后的三系造血重建亦无明显差别的。但高细胞浓度保存时复温后总细胞存活率是 下降的，Yan g,小4习的研究表明复温后的细胞活力与保存时的细胞浓度具有显著相关 性，r=0.936o这说明有功能的造血干/祖细胞的活性在冷冻过程中并没有明显受保存 细胞浓度的影响，因此应当建立一个有效的评估方法来评估冷冻保存对所需要的细胞 造成的活性和功能损伤。三复温后的检测指标从细胞浓度和冷冻保存对细胞凋亡的影响等研究可以看出，需要在保存物复温后 建立一个比较好的检测指标才能更有效地评估冷冻保存对有功能的细胞的影响但关 于在冷冻保存物解冻后是否需检测具有活力的CD34+细胞还存在着争议，各研究结果 并不十分一致。Feu gier P等佝采用多参数分析统计方法评价冻存前后MNC、CD34+细胞、CFU-GM,病情及预处理方案对移植后造血系统恢复的影响，分析显示冻存前 与复温后的CD34细胞数是回输造血干细胞后造血恢复显著而独立的相关因子。回输时 具有活力的CD34+细胞2X 1067kg和cf u-GM 0.5X l()6/k g对中性粒细胞植入有相当 大的影响【37,4叫而CD344细胞回收率和CFU-GM回收率则与移植后中性粒细胞和血小 板的恢复无显著相关，CFU-GM与血小板的恢复无关4习。对106例行自体造血干细胞 6文献综述外周血造血干细胞体外保存的研究进展移植治疗的淋巴瘤病例的移植后长期造血功能恢复情况的研究表明：虽然冷冻前后 CD34+细胞计数与恢复正常造血具有显著相关性，但冷冻前的CD34+细胞数5X 1()6/Kg是移植一年后恢复正常的外周血细胞计数独立的预后因子【4刀。Abrahamsen1481 认为，虽然简单线性回归分析显示冷冻前后CD34+细胞数与中性粒细胞和血小板的植 入相关，但多重回归模型分析则显示较在收集干细胞后立即检测CD34+细胞数而言，冷冻后回输的CD34+细胞计数并不能更好地预测造血成功植入。因此Abrahamsen认 为，在那些冷冻保存前已检测CD34+细胞数，且CD34+细胞高于2X 1()6/Kg的患者而言，冷冻保存物复苏后没有必要检测具有活性的CD34+细胞数量。虽然对复苏后CD34+细胞检测的价值还存在争议，但有一点可以明确的是；回输 的CD34+细胞量与移植后造血恢复有重要的关系。因此，在复温后检测具有活力非词 亡的CD34细胞和相关集落形成能力可监测操作过程和长期冷冻保存后的不可预见的 细胞丢失，对那些冷冻保存前没有检测CD34+细胞量的患者和预测有可能造血植入缓 慢的高危病人具有重要的意义。四展望关于细胞冷冻损伤机制的研究和冷冻后细胞功能改变的研究的不断深入，有助于 加深人们对冷冻损伤的认识，促进具有抗凋亡作用的冷冻保护剂的开发和冻存方法的 不断改进，从而可使外周血造血干细胞保存得到比目前更好的冷冻保存效果。7东南大学硕士学位论文综述二CIK细胞的研究进展免疫细胞过继疗法已成为放、化疗及后肿瘤患者辅助治疗的重要手段之一,对于促 进患者免疫系统的重建、消除残留病变及造血干细胞移植物体外净化都具有良好效 果。人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞.肿瘤浸润淋巴（TIL）细胞、抗 CD3单抗（抗CD3Mc Ab）激活的杀伤细胞,但是由于体外增殖能力低、体内使用需 IL-2维持活性，取材困难及细胞毒力低下等原因，这些免疫细胞的临床应用受到很大限 制,细胞因子诱导的杀伤细胞是将入单个核细胞在体外经过多种细胞因子（IFN）、IL-2、抗CD3Mc Ab等）共同诱导而获得的一群异质性细胞，兼具有T淋巴细胞强大 的抗瘤活性和自然杀伤细胞（NK细胞）的非MHC限制性杀瘤特点，被认为是肿瘤过 继免疫治疗的新希望。现就CIK细胞的体外诱导、生物学特性、作用机制及临床应用 等综述如下。一 CIK细胞的体外诱导1-1诱导方法首先由美国斯坦福大学医学中心Sc hmidt-Wo lf IG等于1991年应用IFN-y xIL-2 抗CD3Mc Ab在体外成功地从外周血单个核细胞诱导出具有体内、体外对淋巴瘤细胞 株高度杀伤活性的杀伤性细胞，此后的大多研究多沿用这一经典培养方法或添加其他 的细胞因子如：IL-1、IL-7、IL-12、PHA等532。培养过程中细胞因子作用各异且加 入的顺序至关重要：抗CDSMc Ab与T细胞上的CD3抗原结合从而促进T细胞的 有丝分裂；IL-1介导CB MNCs表达白介素2受体，与IFN）和抗CD3Mc Ab合用以 提高CIK细胞的毒效应，但其对细胞的扩增不起作用：IL-2促进T细胞的增殖；IFN-y 可上调CB MNCs表面的IL-2受体数及肿瘤细胞上MHC I类分子的表达；PHA是T 细胞的多克隆活化剂。加入不同的细胞因子可能会影响CIK细胞增殖活性、免疫表型 和细胞毒活性等。比如：用IL-12代替IL2,会降低CIK细胞的扩增倍数；用IL-7 代替IL-2会引起扩增的CIK细胞中CD4+细胞的比例增加【5叫用PHA替代抗 CD3Mc Ab时会影响CIK细胞的CD3+CD56+细胞的纯度和细胞毒活性，但在培养 三天后将PHA洗脱单补充IL-2或在行传统CIK细胞培养前先用PHA刺激24小时则 可改善细胞的扩增和细胞毒活性如，将抗CD3Mc Ab包被于培养板上比在培养液中 加入悬浮的抗CD3Mc Ab扩增CIK细胞的效果要好】。因此CIK细胞体外扩增的方 法还需进一步探讨和优化。体外诱导扩增cik细胞的前体细胞来源至目前为止，国内外大多数学者研究CIK细胞的生物学特性或临床应用时多使用 从人外周血单个核细胞来源的CIK细胞。正常外周血单个核细胞中含CD3+CD5介的细 胞约1%5%,在体外经IFN-、rIL-2抗。口31八6和比-1。扩增后该群细胞可100他 以上伊】。随培养时间延长，该群细胞比例增高，在体外诱导30天后其绝对值可扩增3000 多倍，纯度达39.9%8.63%【刈。但肿瘤患者外周血中总淋巴细胞降低，各淋巴细胞亚 群比例紊乱，血清中存在众多免疫抑制因子，从肿瘤患者的外周血单个核细胞诱导的 CIK的增殖活性和生物学活性可能会低于从健康供者PBMC来源的CIK细胞a】，因此近 年来有学者探究用其他来源的单个核细胞来诱导CIK细胞的产生。王家祥狗等比较了 从脐血和外周血MNCs来源的CIK的生物学活性，认为:脐血CIK细胞的扩增速度、杀伤 活性均显著优于外周血CIK细胞：脐血CIK细胞以诱导肿瘤细胞坏死为主，外周血CIK 细胞以诱导肿瘤细胞凋亡为主。目前国内已有数篇关于利用CB MNCs成功体外扩增出 8文献综述CIK细胞的研究进展具有生物学活性的CIK细胞的报道，但对CB MNCs来源的CIK细胞的临床应用价值还 需进一步探究。黄文荣何等则研究了从骨髓来源的单个核细胞来源的CIK细胞的生物 学活性，发现骨髓来源CIK细胞的细胞毒活性与外周血来源的CIK细胞相似，但诱导 后的增殖活性，NK细胞样T淋巴细胞（NKT,CD3+CD56+）的纯度比不上外周血来 源的CIK细胞。Alvamas冗口旬等利用病人移植时采集的经过GCSF动员的外周血干细 胞采集物诱导CIK细胞，诱导出的CIK细胞对人B细胞淋巴瘤细胞株OCL-Ly 8具有与未 经动员的外周血单个核细胞来源的CIK细胞相似的细胞毒活性，但NKT的扩增速度比 不上后者。这可能与经过G-CSF动员后的淋巴细胞具有向Th2极化的现象伊烟有关.CIK细胞的生物学活性2.1 CIK细胞的异质性CIK细胞为多种细胞因子诱导产生的异质细胞群，经诱导后主要表达CD3、CD56、CDS.CDlla.CD28、CD54、CD4、HLA-DR、CD33 等表面标志，因而由多种 细胞亚群构成。CD3CD56双阳性细胞和CDS阳性的杀伤性T细胞是构成CIK细胞强 大杀瘤活性的主要效应细胞，CD3+CD56+亚群为增殖倍数最多,杀瘤活性最强的亚群 53.60-物。扩增的CD3+CD56+T细胞群来源于培养物中CD3+CD56而不是CD3-CD56+的细胞群。培养后也迅速扩增的CD4+细胞具有明显的“Thl优势”,可以调节宿 主免疫细胞活性；同时CD4+CIK细胞可通过诱导肿瘤细胞凋亡实现对肿瘤的抑制和2.2 增殖活性高国内外的大量研究证实，与既往研究的TIL、LAK细胞相比，经过IFN-f、IL-2、抗CD3Mc Ab等细胞因子的联合诱导下，CIK细胞可在体外达到最大的增殖速度3】。这种快速增殖的特性保证了临床应用时能提供足够的免疫细胞。23细胞毒活性高，杀瘤谱广同时表达CD3和CD56两种膜蛋白子的NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细 胞强大的抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤特点网。经大量体外试验和负瘤小 鼠体内实验，CIK细胞具有明显优于LAK细胞的杀瘤特点，而且其体内细胞毒性无 IL-2依赖性；与LAK相比，CIK细胞对多重耐药肿瘤细胞具有更强的敏感性【的。同 样，CIK细胞的体外细胞毒活性也高于1106刀。对于多种肿瘤细胞系（包括NK敏感的 K562和NK不敏感的Hela、HL-60,人B淋巴瘤细胞系OCI-LY8,人胃癌腹膜转移 细胞株OCUM-2MD3，肝癌细胞系BEL-7402）均表现出强大的杀伤活性。Ho n gen g S 从6名经过高强度化疗处于缓解期的肿瘤患儿的外周血MNCs诱导出CIK细胞，体外 细胞毒实验表明CIK细胞对多种儿童常见肿瘤的细胞株均具有强大的溶瘤活力。即使 用K562细胞预先吸收了 CIK细胞的细胞毒作用，也不能完全废除CIK细胞对自身白 血病细胞株的杀伤活性砌。2.4 对正常细胞毒性低CIK细胞能在体外减少3个数量级的K562细胞集落，但只能减少小于一个数量 级（25%）的由造血祖细胞生成的CFU-GM3，由此体现了 CIK细胞在造血干细胞 移植中的净化移植物的价值。从肝癌病人的外周血中得到的CIK细胞对肝癌耐药株 Bel-7402/R具有很高的细胞毒活性（10:1时50%）,但对肝胚胎干细胞株L-02的杀伤 9东南大学硕士学位论文活性则小于10%【期。三CIK细胞的细胞毒作用3.1 对肿瘤细胞的直接杀伤CIK细胞释放胞浆颗粒到细胞外，通过颗粒内含物发挥对靶细胞直接杀伤作用，这是CIK细胞发挥细胞毒作用的主要方式。释放颗粒途径有两条：CIK细胞表面粘 附分子LFA“与ICAM4的相互作用刺激CIK细胞脱颗粒并释放BLT酯酶，导致颗粒依 赖性细胞溶解，该途径对细胞内c AMP水平有关，但不受免疫抑制药物CsA和FK506 的影响：CIK细胞通过其表面CD3或CD3样表面受体与抗CD3Mc Ab的相互作用刺激 CIK细胞脱颗粒并释放BLT酯酶。与第一条途径不同的是，这条途径既受第二信使 c AMP的调控，又受免疫抑制药物CsA和FK506的影响。LFA-1和细胞间黏附分子（ICAM-1）在介导CIK细胞杀伤靶细胞时起着非常重要的作用，LFA-1抗体和ICAM-1 抗体均可使CIK细胞对靶细胞的杀伤活性明显受抑缺6】X2诱导肿瘤细胞凋亡Vemeris等0的实验提示,CIK细胞在培养过程中表达FasL,能抵抗FasL+的 肿瘤细胞引发的效应细胞FasFasL凋亡，又可诱导Fas+的肿瘤细胞凋亡，发挥对肿瘤 细胞慢性杀伤作用，保证抗瘤活性的长期持久。抗Fas单抗可减弱CIK细胞对肝癌细 胞株的杀伤活性口久33活化后产生大量炎性细胞因子实验证明3，培养的CIK细胞在第6-10天IL-1*IL-2、IFN-B等促炎因子基因 高表达，TNFr基因第20天时高表达，而TNF书和TRAIL基因在培养的各个时期组 成性表达。抑炎因子IL7、IL-5基因在 仁10天时稳定表达，在培养后期表达增多，TGF-B基因后期表达。抗炎一促炎因子的平衡对于维持体外CIK细胞的高增殖性和 细胞毒活性起着重要的作用。用白血病细胞株刺激CIK细胞后，CD3+CD56+的CIK 细胞高表达的细胞因子基因与CIK细胞的Thl及Tel极化的现象是一致的；而用对 CIK细胞具有抵抗性的急性淋巴细胞白血病细胞株刺激时，具有免疫抑制作用的 TGF-P基因高表达41。3.4CIK细胞回输后可以激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能Shig等观察到接受CIK细胞治疗的13名原发性肝细胞癌患者在乙肝病毒滴度下 降、肿瘤生长速度减慢、生化指标好转的同时，患者体内的淋巴细胞亚群和树突细胞 较治疗前明显改善。CIK细胞治疗10天后，体内CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD25+细胞较治疗前显著改善；树突细胞（DC）数量增加，DC1从治疗治疗前0.59%提高到 0.85%,DC2从0.26%提高到043%（尸0.01）。CIK治疗13月后，患者体内的淋巴 细胞亚群仍能维持在CIK治疗后初期的水平。另外，CIK细胞也能改善手术后肺癌患 者的外周血淋巴细胞亚群阿。这些临床研究说明，CIK细胞过继免疫治疗对肿瘤患者 免疫功能恢复有促进作用，改善的免疫功能对于抑制肿瘤生长和复发具有重要的意 义。四 增强CIK细胞的细胞毒作用的研究10文献综述CIK细胞的研究进展4.1 基因转染技术的应用Fin k e S71将IL-7的基因转染进CIK细胞中，转染后的CIK细胞高分泌TNF-a,其增殖活性、对多种肿瘤细胞株的杀伤活性均强于未转染的CIK细胞。杨永红等将 多药耐药蛋白（mdrl）基因转染CIK细胞，使CIK细胞保持杀伤性活性的同时获得 了多药耐药性。4.2 利用双向特异性抗体利用新开发的针对EpCAM/CD3双向特异性抗体可将CIK细胞特异性连接到表达 EpCAM的肿瘤细胞表面，显著增强CIK细胞的杀伤活性，若同时给予IL-2或IFN有 协同作用啊。这为临床治疗表达特异性抗原的肿瘤提供了一个新的思路。43利用负载肿瘤抗原的树突细胞（DC）共培养用负载CD138+的多发性骨髓瘤细胞抗原肽的DC刺激的CIK细胞对CD138+的 骨髓瘤细胞有显著的作用，但对CD138-的细胞则无明显杀伤作用。并且只有负载纯 化肿瘤抗原肽的DC刺激的CIK细胞才能产生高效而特异的细胞毒作用,负载患者血 清肽的DC则不能诱导CIK细胞产生这种效应。这说明DC能将肿瘤抗原肽信息传递 给CIK,使CIK细胞能特异性地识别并杀伤肿瘤细胞I叫这种独特性效应在负瘤小鼠 的体内实验中也得到了验证网L五CIK细胞的临床应用研究目前已有关于应用CIK细胞临床治疗肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、急性白血病.淋巴 瘤等恶性肿瘤的报道，以国内报道为主。国外最近才报道了关于CIK治疗9名自体移植 失败的进展期淋巴瘤病人（7例霍杰金病，2例淋巴瘤）的一期临床研究结果陷1 9名患 者中2例有部分反应，2例病情稳定，其中一名病情稳定了 18个月。综合国内的临床研 究报道3-76,83.88,CIK细胞回输给病人后，能改善患者体内的细胞免疫状态，对化疗后 处于缓解期及接受造血干细胞移植患者或手术治疗的实体瘤患者的体内微小残留病灶 具有清除作用；但对进展期、晚期的肿瘤患者，由于体内肿瘤负荷较大，CIK细胞的远 期疗效优势不能充分体现。说明CIK的临床疗效受体内肿瘤负荷的制约，在接受CIK的 免疫治疗前应该联合其他治疗手段尽量降低肿瘤负荷。所有的研究都显示CIK细胞临床 治疗毒副作用轻微，主要有低热、乏力等，可自行缓解，治疗后大多病人短期内主观 感觉明显改善，食欲增强、睡眠改善、体力增强，体重增加等。六展望CIK细胞因为具有在体外强大的增殖能力、广谱杀瘤活性、对正常造血干细胞影 响轻微，能有效清除肿瘤微小残留病灶，且临床应用安全等优点，有望成为免疫过继 疗法的一种重要的细胞成分。但对CIK细胞培养条件的优化，如何在非特异性抗肿瘤 活性的基础上诱导其更高的特异性抗肿瘤活性，临床应用时机、细胞用量、应用周期 以及临床合适病例的选择等方面还值得进一步探索。11东南大学硕士学位论文实验实验一 PBSC采集物经长期液氮冻存后活性，淋巴细胞表型及其分泌细胞因子功能的变化第一章材料和方法标本和试剂1-1标本来源共收集了 47份外周血干细胞采集物标本。新鲜对照组标本12例（健康供者3例，恶性实体瘤3例、恶性血液病6例）。长期冷冻保存的样品分为两组：实验1组（保 存35年，恶性实体瘤8例、恶性血液病15例、免疫病3例）和实验2组（保存 27 年,恶性实体瘤4例、恶性血液病4例、免疫病1例）。采集PBSC时大多恶性病患 者大多处于缓解期，部分标本缺少采集时疾病进展资料。所有的PBSC都是经过动员 后采集的，健康供者单用G-CSF,患者用化疗联合G-CSF方法动员，使用CS-3000 plu s 血细胞分离机采集，采集物用ACDA抗凝。冷冻保存时，使用DMSO为冷冻保护剂，终浓度为10%,经程控降温后置液氮中保存。1-2主要试剂 红细胞裂解液 IMDM培养液 rHu IL-3 rHu GM-CSF 甲基纤维素PHA胎牛血清 生理盐水7AAD解放军八一医院制备 美国Gibic o公司PEPRO箕c h