流感病毒的快速检验方法.doc

流感病毒迅速检测办法

一、 RT-PCR迅速诊断办法
（一） 生物安全规定
（二） 病毒核酸提取
（三） RT-PCR
（四） PCR 产物纯化
（五） 流感病毒RT-PCR检测引物
二、 免疫荧光办法检测流感病毒
（一） 原理
（二） 标本解决
（三） 间接免疫荧光法
（四） 成果判断
三、 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）迅速诊断检测
（一） 基本原理
（二） 实验试剂
（三） 实验环节
四、 迅速诊断试剂盒

流感迅速检测办法，与老式病毒分离鉴定相比具备迅速、简便特点。因而惯用于流感暴发时初期病原学检测用。流感迅速诊断涉及直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR迅速诊断速办法、流感迅速诊断试剂盒等。这里简介RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光迅速诊断速诊断办法和几种流感迅速诊断试剂盒优缺陷。无论那种迅速诊断都无法代替老式病毒分离鉴定办法。

一、 RT-PCR迅速诊断办法
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组有力办法，虽然基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将简介检测流感病毒聚合酶链式反映（PCR）。
流感病毒基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必要合成与病毒RNA互补DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA多聚酶，因而，扩增流感病毒基因组过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；一方面由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反映经25～30个循环，使DNA产物达到倍增效果。

（一） 生物安全规定
生物安全级别与个人防护规定：生物安全二级实验室，防护规定与二级实验室规定相似。并应遵守相应生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR迅速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室生物安全柜里完毕。

（二） 病毒核酸提取
1. 实验材料及仪器
(1) QIAGEN公司Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）
(2) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）
(3) 70% 乙醇
(4) 无菌1.5ml 离心管
(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头
(6) 可调14K微型离心机
(7) 旋转混合器

2. 操作环节
(1) 取1支无菌、无RNA酶1.5ml Eppendorf管，加入500μl RLT。
(2) 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。
(3) 加5μl β-巯基乙醇，充分混匀。
(4) 加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。
(5) 从试剂盒中取出带滤膜离心柱，并标上标本号。
(6) 将第4步混合液体分两次（每次600μl） 吸入于滤柱中，1rpm 离心15秒，弃收集管中离心液。
(7) 滤柱仍放回收集管上，将第4步混合液所有吸入滤柱中，1rpm 离心15秒，弃收集管中液体。
(8) 于滤柱中加入700μl RW1，1rpm 离心15秒。
(9) 从试剂盒中取出一支新2ml收集管，将离心后滤柱转到新收集管上，于柱子中加入500μl RPE，1rpm 离心15秒弃收集管中液体。
(10) 滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离心2分钟。
(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新1.5ml管上，于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶水，室温静置1～3分钟。
(12) 1rpm 离心1分钟，弃滤柱。收集离心液即为提取病毒RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20℃如下保存，-30℃可保存3～4个月。

3. 注意事项
(1) 试剂盒中RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。
(2) 所有用过枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。

（三） RT-PCR
1. 一步法 RT-PCR
(1) 实验材料
1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212
2) RNase inhibitor 40u/μl（Promega）
3) 上游引物 200ng/μl
4) 下游引物 200ng/μl
5) 模板RNA（Templet RNA）
(2) 实验环节
1) PCR反映配备（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）
无RNA酶水（Rnase Free Water） 28.75μl
5×Buffer 10μl
10mM dNTP 2μl
Enzyme Mix 2μl
Rnase inhibitor 0.25μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
RNA 模板 5μl
总量：50μl

2) 将PCR 反映管放入PCR扩增仪
3) RT-PCR 反映条件：此循环反映条件仅共参照，如果引物更换，相应反映条件需要做恰当调节。
® 60℃ 1 min
® 42℃ 10 min
® 50℃ 30 min
® 95℃ 15 min
® 94℃ 30 sec
® 52℃ 30 sec
® 72℃ 1 min
® 返回第 5部，循环34次
® 72℃ 10 min
® 4℃ 保存
4) PCR产物检测
琼脂糖凝胶配备：用1×TBE 将琼脂糖配成1.2%～1.5%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50～60℃时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/μl），终浓度为0.5μg/ml。
PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ，使它沉没过胶面。每份标本取4μl PCR产物，与1μl 5×Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶第一孔加入5μl分子量原则样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约30～40min。
成果分析：用UV～254暗箱式紫外透射仪观测电泳成果，在透射波长254nm 下观测成果效果较好。或者用凝胶成像系统观测电泳成果。

5) 注意事项：含EB琼脂糖经解决后放入科研垃圾袋内统一解决。
具有EB凝胶解决办法：
® 加1倍体积0.5mol/L KMnO4,小心混匀。
® 加入1倍体积2.5 mol/L HCl,小心混匀。于室温放置数小时。
® 加入1倍体积2.5 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。

2. 二步法 RT-PCR
(1) 实验材料
1) 逆转录酶：AMV Reverse Transcriptase，Catalog# M5101 Paromeg
2) 5×RT Buffer
3) 2.5mM dNTP
4) Rnase inhibitor 40u/μl（Promega）
5) 上游引物 200ng/μl
6) 下游引物 200ng/μl
7) 无RNA酶水（Rnase Free Water）
8) Ex-Taq 酶 5u/μl DRR 001A 250u （Takara）
9) 10×PCR Buffer

(2) 实验环节
1) 逆转录反映（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）
无RNA酶水 6.8μl
5×RT Buffer 4μl
2.5mM dNTP 2μl
上游引物 1μl
Rnase inhibitor 0.2μl
逆转录酶 1μl
RNA 模板 5μl
总量：20μl
将上述反映液混匀，42℃水浴作用1小时。然后94℃ 3min ，放置冰上（下步PCR反映或-20℃ 待用）

2) PCR反映配备（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）
无RNA酶水 35.5μl
10×PCR Buffer 5μl
2.5mM dNTP 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
Ex-Taq 酶 0.5μl
cDNA 模板 5μl
总量：50μl
3) 将PCR 反映管放入PCR扩增仪
4) PCR 反映条件：此循环反映条件仅共参照，如果引物更换，相应反映条件需要做恰当调节。
® 94℃ 3 min
® 94℃ 40 sec
® 52℃ 40 sec
® 72℃ 2 min
® 返回第2部，循环30 次
® 72℃ 7 min
® 4℃ 保存
® PCR 产物检测：同一步法

（四） PCR 产物纯化
1. 实验材料
QIAquick Gel Extraction Kit Cat No 28704

2. 操作环节
(1) PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(2) 用干净手术刀切割目DNA片段，将切下DNA胶放入1.5ml离心管（切胶在暗箱或紫外透射仪下操作）；
(3) 加3倍胶体积Buffer QG（即100mg DNA胶加300μl Buffer QG）；
(4) 水浴50℃ 孵育10min，直到DNA胶完全溶解（每隔2～3min 用旋转混合器混匀）；
(5) 加一种胶体积异丙醇（100mg DNA胶加100μl异丙醇）；
(6) 从试剂盒 中取出带滤膜离心柱收集管，并标上标本号；
(7) 将上述DNA液吸入带滤膜离心柱，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜离心柱放回收集管；
(8) 于带滤膜离心柱中加0.5ml Buffer QG，13000rpm离心1min，弃收集管中废液；
(9) 带滤膜离心柱中加入0.75ml Buffer PE，放置2～5min，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜离心柱放回收集管上，13000rpm离心1min；
(10) 将带滤膜离心柱转移到一新1.5ml离心管上；
(11) 于带滤膜离心柱中加20～30μl TE（或Rnase Free Water），室温3～5min，1rpm离心1min，弃小柱，收集离心液即为纯化PCR产物，可直接用于测序。

（五） 流感病毒RT-PCR检测引物
A型检测引物： 5’ CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT
5’ GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACT

B型检测引物 5’ GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG
5’ TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TG

H1亚型鉴定引物 5’ ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC
5’ CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,C

H3亚型鉴定引物 5’ ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC
5’ ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,C

H5亚型鉴定引物 5’ GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG
5’ GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCC

H5亚型鉴定引物 5’ GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA
5’ YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGA

H5亚型鉴定引物 5’ GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC
5’ CTC,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TG

N1鉴定引物 5’ AAG,GGG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT
5’ TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCC

N2鉴定引物 5’ GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC,ATT,G
5’ AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC

二、 免疫荧光办法检测流感病毒
（一） 原理
流感病毒重要感染呼吸道上皮细胞，因而在病人呼吸道标本脱落细胞中具有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。

（二） 标本解决
标本采集最佳用负压抽取法收集呼吸道分泌物。
1. 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。
2. 使用吸管吹打悬浮液多次。

3. rpm离心5分钟。
4. 保存上清液做培养。
5. 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。
6. 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。

（三） 间接免疫荧光法
1. 在特富龙涂层12孔显微载玻片每个孔上加入10 µl细胞悬浮液。
2. 用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥。
3. 用100%冰丙酮室温10分钟固定载玻片。
4. 室温晾干载玻片。
5. 每孔加10 µl 流感相应亚型特异性抗体（1:1000）
6. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
7. pH7.2 PBS洗涤1分钟。
8. 室温晾干载玻片。
9. 每孔加入10 µl 1:20 兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1 % 伊纹氏蓝（Evans Blue）做负染。
10. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
11. pH7.2 PBS洗涤1分钟。
12. 室温晾干载玻片。
13. 加上盖玻片，加上甘油。
14. 在400X 荧光显微镜镜下检查。

（四） 成果判断
阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色细胞质某些。观测到三个以上荧光阳性即可判为阳性。

三、 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）迅速诊断检测
（一） 基本原理
实时荧光定量（Real-time）RT-PCR术，是指在RT-PCR反映体系中加入荧光基团，运用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过原则曲线对未知模板进行定量或定性分析办法。

1. 荧光基团重要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料
(1) TaqMan荧光探针：PCR扩增时，在加入一对引物同步加入一种特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一种报告荧光基团和一种淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射荧光信号可被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶5’-3’外切酶活性将与PCR产物杂交形成双链探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一种荧光分子形成，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同步。
(2) SYBR荧光染料：在PCR反映体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链中SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号增长与PCR产物增长完全同步。

2. 有关几种概念
(1) Ct值：C代表CyCle，t代表threshold。Ct值是指反映管内荧光信号到达设定阈值时所经历循环数 。
(2) 阈值（threshold）：PCR反映前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值缺省设立是6～15个循环荧光信号原则偏差10倍。
(3) 基线（baseline）：指PCR反映指数扩增前平均本底荧光信号值，普通取6～15个循环平均荧光信号值。
(4) Ct值与起始模板关系：每个模板Ct值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。运用已知起始拷贝数原则品可作出原则曲线，其中横坐标代表起始拷贝数对数，纵坐标代表Ct值。因而，只要获得未知样品Ct值，可从原则曲线上计算出该样品起始拷贝数。

（二） 实验试剂
1. 引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物
2. RT-PCR酶
3. RT-PCR反映液
4. Taq酶
5. 无RNA酶水
6. 阳性对照（非感染性体外转录RNA）
7. 阴性对照
8. 无RNA酶水

（三） 实验环节
1. 核酸提取
办法同RT-PCR迅速诊断。

2. RT-PCR反映体系配备
(1) 配备反映体系
从试剂盒中取出相应 RT-PCR反映液、Taq酶，反映液在室温下融化后，rpm离心5秒钟。设所需PCR数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反映体系配制如下表：

试剂
RT-PCR反映液
Taq酶
用量
9.8μl
0.2μl

计算好各试剂使用量，加入一恰当体积试管中，向其中加入n/2颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装10μl。

(2) 加模板
在各设定PCR管中分别加入RNA溶液各10μl，盖紧管盖，放入荧光 PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。

3. RT-PCR反映
(1) 循环条件设立

程序
循环数
温度（摄氏度）
反映时间（分钟:秒）
1
1
42
30:00
2
1
92
3:00
3
5
92
10
45
30
72
1:00
4
40
92
10
60
30
5
1
40
0

(2) 仪器检测通道选取F1通道
1) 成果分析条件设定
读取F1通道检测成果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线最高点，成果显示阴性为准。或可依照仪器噪音状况进行调节。

2) 质控原则
阴性对照检测成果为阴性。
阳性对照Ct值应不大于等于28.0。
否则，本次实验视为无效。

4. 成果判断
1) Ct值无数值样本为阴性样本。
2) Ct值≤30.0样本为阳性。
3) Ct值不不大于30.0样本建议重做。重做成果无数值者为阴性，否则为阳性。

5. 问题解决
(1) 若阴性对照浮现扩增，可以考虑由于环境污染而导致假阳性。此时应设立空白对照检测：在实验当天取一盛有500μl纯水1.5ml离心管置于工作台，并于实验结束后作为待检样品检测，检测成果应为阴性。若浮现阳性则阐明发生环境污染，此时应对室内进行通风、擦洗工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所有自备试剂。
(2) 阳性对照Ct值不不大于30，则应考虑RNA降解，此时应对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，并严格按操作流程进行实验。

四、 迅速诊断试剂盒
流感迅速诊断试剂盒可以用于暴发疫情标本迅速检测，当前全世界有10种市场化流感迅速诊断试剂盒，其中9种为检测流感病毒NP抗原，1种检测流感病毒NA抗原。迅速诊断试剂盒长处是：能在30分钟内提供迅速诊断实验成果；可以协助检测流感爆发；可以在临床中使用；合用于各种状况，操作简便。但是这些试剂盒缺陷是：比病毒培养或RT-PCT精确性要低；有某些诊断实验不能区别甲型和乙型流感病毒感染；没有诊断实验能区别甲型流感病毒各亚型；没有毒株、分子生物学和抗原特性信息。各种诊断试剂盒使用参照试剂盒阐明书。
既有试剂盒可以分为如下三类：

1. 只检测甲型流感病毒
Directigen Flu A
2. 检测和区别甲型和乙型流感病毒
Directigen Flu A + B；FLU OIA A/B FLU OIA A/
XPECT FLU A/B；NOW FLU A/B
Flu A .B；B；Influ B Quick
3. 检测但不能区别甲型和乙型流感病毒
QuickVue Influenza Test
FLU OIA
ZstatFlu

信息来源：《全国流感/人禽流感监测实行方案（～）》