丙氨酸的发酵生产课程设计.pdf

湖湖 北北 大大 学学发发 酵酵 工工 程程 与与 设设 备备 课课 程程 设设 计计题 目 丙氨酸的发酵生产 专业年级 09 级生物工程 学生姓名 学 号 指导老师 2012 年 6 月 20 日2目目录录1 前言31.1 丙氨酸简介3 1.2 丙氨酸的国内外研究现状32 发酵机制42.1 菌种的筛选4 2.2 菌种保藏53 发酵工艺及特点6 3.1 丙氨酸发酵机制6 3.2 丙氨酸发酵的工艺控制6 3.3 丙氨酸提取工艺6 3.4 相关设备74 菌种的制备及种子的扩大培养8 4.1 菌种的制备8 4.2 种子的扩大培养835 培养基的组成及制备8 5.1 培养基的组成8 5.2 培养基的灭菌96 无菌空气制备系统107 工艺计算118 三废处理11 8.1 活性污泥法11 8.2 生物滤池法11 8.3 发酵后的滤渣12 参考文献1241 1 前前言言1 1.1 1 丙丙氨氨酸酸简简介介 DL-丙氨酸化学名为 DL-丙氨酸（简称丙氨酸），分子式为 CH3CH(NH2)COOH,分子量 89.09，无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末，有甜味，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，无旋光性【1】。丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的21种氨基酸之一。组成蛋白质分子的氨基酸都是 L-氨基酸。结结构构 用用途途 DL-丙氨酸主要用做食品添加剂，同时也是重要的医药中间体。在国外已广泛应用于食品工业，年需求量很大，且增长迅速，其主要生产国为日本，主要生产企业有武藏野化学株式会社和味之素。1 1.2 2 丙丙氨氨酸酸的的国国内内外外研研究究现现状状DL-丙氨酸不仅仅是有特殊香味的氨基酸，而且也被用来与其他呈香味的物质混合食指显出更高级的香味。另外，DL-丙氨酸是甜味很强的氨基酸，比蔗糖甜，为甘氨酸的 1.6 倍，是最甜的一种氨基酸。DL-氨基酸还有缓冲作用、螯合作用和防止其他氨基酸褐变的作用【2】。DL-丙氨酸作为营养强化剂和调味品，在国外已被普遍使用。按美国联邦法规可安全用于食品，其主要用途为【3-5】：（1）增强化学调味料的调味效果；5（2）改善人工甜味剂的味感，添加 110的本品可使甜味柔和，改善后味；（3）合成清酒的调味料，用量 0.010.03；（4）改善有机酸的酸味，15添加量就可使酸味接近天然的味道；（5）提高腌制效果，按 NaCl 量的 510添加，可缩短腌制时间；（6）提高含醇饮料的质量，按 0.11.5添加可使酒味醇和，并可防止发泡酒老化，减少酵母气味；（7）防止油类和油类食品氧化，添加量为0.011.0；（8）改善浸渍品的风味,添加量为 0.20.3；（9）食用香料，食品中添加量小于 1；（10）食用防腐保鲜剂的复配组分。DL-丙氨酸用于食品添加剂时，可单独使用，也可与谷氨酸钠等制成符合调味剂或复合甜味剂。DL-丙氨酸在医药工业上主要用于合成氧氟沙星的原料氨基丙醇和维生素B6的主要原料【6】。DL-丙氨酸作为饲料添加剂，也收到了良好的效果【7】。用 DL-丙氨酸合成的氨基酸农药（如 DL-丙氨酸-月桂酯盐酸盐、N-硬脂酰-DL-丙氨酸等）已投入使用，具有对人畜安全、污染小的特点【8】。2 2 发发酵酵机机制制2 2.1 1 菌菌种种的的筛筛选选 采用以葡萄糖、氯化 铵为主要成分的培养基,研究了20个属、334 株好气性细菌的氨基酸生产能力。结果表明,几乎在每个属细菌的培养液中都能检出丙氨酸。在土壤中分离出来的 棒杆菌【9】属细菌，具有产生丙氨酸的能力。棒杆菌属细菌是放线菌目中一属革兰染色阳性、不运动、非抗酸性、无芽孢的杆菌。菌体直形、弯形或多形，常呈棒状。一般不运动。好氧或兼性厌氧，化能有机营养型。进行氧化性或发酵性代谢。从自然界中分离菌种的一般过程：采样 预处理 培养 菌落的选择 菌种的鉴定 采样对象：以采集土壤为主。采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。6 菌落的选择方法见下图：a.稀释倒平板法 b.涂布平板法菌种鉴定经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。2 2.2 2 菌菌种种保保藏藏 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条7件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。3 3 发发酵酵工工艺艺及及特特点点3 3.1 1 丙丙氨氨酸酸发发酵酵机机制制 葡萄糖经过糖酵解途径生成的丙酮酸，通过转氨反应和还原氨基化反应生成L-丙氨酸。发酵周期60小时。(1)转氨反应丙酮酸+L-氨基酸L-丙氨酸+-酮酸(2)还原氨基化反应丙酮酸+NH4+NADHL-丙氨酸+NAD+H20由于菌体具有消旋酶活性,结果发生消旋化，生成了DL-丙氨酸【10】.3 3.2 2丙丙氨氨酸酸发发酵酵的的工工艺艺控控制制3.2.1 pH 丙氨酸生产菌的最适 pH一般是中型或微碱性，pH7.67.8条件下积累丙氨酸。3.2.2 温度 丙氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度为 3032。对数生长期维持温度30-32。谷氨酸合成的最适温度为 303.2.3 通风量 由于发酵过程中有谷丙转氨酶作用，而有氧才能产生谷氨酸，所以丙氨酸发酵也是有氧发酵。应在长菌期间低风量，产酸期间高风量，发酵成熟期低风量。3.2.4 泡沫 丙氨酸发酵时好气性发酵，因通风和搅拌和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生泡沫是正常的，但泡沫过多不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸代谢，也会影响正常代谢以及染菌。因此，要控制好泡沫是关键。消泡方法有机械消泡（靶式、离心式、刮板式、蝶式消泡器）和化学消泡（天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂）两种方法【11】。3 3.3 3丙丙氨氨酸酸提提取取工工艺艺丙氨酸提取【12】的基本方法有：等电点结晶法、特殊沉淀法、离子交换法、溶剂萃取法、液膜萃取法。83 3.4 4相相关关设设备备丙氨酸发酵罐见下图。94 4 菌菌种种的的制制备备及及种种子子的的扩扩大大培培养养4 4.1 1 菌菌种种的的制制备备种子培养过程：斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐斜面菌种制备培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，氯化钠 0.5%，琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养条件：32，生长 18-24 小时培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3 次4 4.2 2 种种子子的的扩扩大大培培养养1.一级种子（摇瓶）培养基：葡萄糖 2%，尿素 0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养条件：于 1000ml 三角瓶中，装液 200-250ml,32培养 12 小时。培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基2.二级种子(种子罐)培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养 7-10 个小时培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109 个/ml；大小均匀，呈单个或八字排列；活力旺盛；PH 7.0-7.2 时结束，6.887.0-7.2。5 5 培培养养基基的的组组成成及及制制备备5 5.1 1 培培养养基基的的组组成成发酵罐培养基成分：葡萄糖 1310KH2PO4 0.1MgSO4.7H2O 0.04酵母膏 0.1玉米浆 0.4尿素 1.8pH 7.67.85 5.2 2 培培养养基基的的灭灭菌菌 培养基的灭菌：指用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物。工业灭菌方法：1连续灭菌（连消）：是采用专一灭菌设备 连消塔，在高温下对液体培养基进行短时间加热灭菌。优点：（1）培养基受热时间短（可在 2030s 达到预定灭菌温度），营养成分破坏少；（2）质量均匀；（3）适用于自动控制。适用条件：大规模生产，培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少。连续灭菌流程图:2.分批灭菌(实消):指培养基在发酵罐中灭菌。优点：无需专一灭菌设备，但易发生局部过热而破坏营养成分的现象。11 适用条件：当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以采用分批灭菌为好。对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比较方便。设备灭菌：实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。培养基采用连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前，直接用蒸汽进行空罐灭菌，用无菌空气保压，待培养基流入罐后，开始冷却。其他设备一般采用蒸汽灭菌。6 6 无无菌菌空空气气制制备备系系统统发酵对空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标。两级冷却、分离、加热的空气除菌流程：适合于各种气候条件，能充分地分离空气中的水分，提高过滤效率。油雾和水雾的分离去除比较完全，保证干过滤。7 7 工工艺艺计计算算年产1000t产率40g/L发酵周期60h12发酵罐数 2个发酵罐装料系数 0.7发酵罐公称体积 V=106/40/146/2/0.7=122m3种子罐公称体积 V=122*1%=1.2m3种子罐数 30 个8 8 三三废废处处理理 丙氨酸发酵过程中产生的主要是废水。其主要来源有：废母液，反应罐废残液，设备清洗液，废气吸收液，废渣稀释，物料事故跑料液等。这些废水污染物种类繁多，浓度很高，分子量一般很大，生化处理时间长，对环境污染严重。8 8.1 1 活活性性污污泥泥法法【13】利用活性污泥对污水进行好氧生物处理的方法，其基本工艺流程是曝气池和二次沉淀池依次串联，并有回流污泥管将二次沉淀池沉淀下来的污泥又送回到曝气池中。活性污泥处理流程图：8 8.2 2 生生物物滤滤池池法法 原理：利用需氧微生物对污水或有有机性废水进行生物氧化处理的方法。以淬石、焦炭、矿渣或人工滤衬等作为先填层，然后将污水以点滴状喷洒在上面，并充分供给氧气和营养，此时在滤材表面生成一层凝胶状生物膜（细菌类、原生动物、藻类、茵类等），当污水沿此膜流下时，污水中的可溶性、胶性和悬浮性物质吸附在生物膜上而被微生物氮化分解。为使生物滤池有效地处理污水：（1）微生物的繁殖，必需有足够的表面积。（2）必需充分供给微生物氧气。（3）污水需具有适于生物处理的水质。生物滤池法有标准滤池法和高速生物滤池法两种方式。生物滤池法工艺流程图：138 8.3 3 发发酵酵后后的的滤滤渣渣 一般是制作成其他产品进行再次利用，转化为饲料，很多滤渣可以喂鱼，作为食饵，并且食物中的微生物还有净化水体的作用。对于一些不可以直接使用的固体废弃物我们可以使用堆肥法 堆肥法【14】是指用于处理有机垃圾。其原理是利用微生物对垃圾中的有机物进行代谢分解，在高温下进行无害化处理，并能产生有机肥料。堆肥法原理图：9 9 参参考考文文献献【1】章思规.实用精细化学品手册，有机卷（上）M.北京：化学工业出版社，1996,89.【2】毛建卫，崔艳丽，王桂仙.DL-丙氨酸合成工艺的新进展及其应用J.科技通讯，2002,18（2）：93-95.【3】凌关庭.食品添加剂手册（第三册）M.北京：化学工业出版社，2003,47-48.【4】俞长銮，莫尔品（译）.发展中的氨基酸工业（三）J.氨基酸杂志，1984，（3）：53-55.【5】赵建国.氨基酸在食品工业中的应用现状及进展 J.氨基酸杂志，1984，（3）：32-37.【6】杨得本（译）.氨基酸在工业上的应用途径 J.氨基酸通讯，1981,11:3-18.【7】余传隆.努力开发氨基酸在饲料工业中的应用 J.氨基酸杂志，1984，（2）：24-33.14【8】余杨坤.氨基酸农药国外研究情况 C.武汉大学氨基酸研究室.氨基酸学术论文集（1973-1983）.武汉：氨基酸杂志社，1983:29-34.【9】张克旭.氨基酸发酵工艺学 M.北京：中国轻工业出版社，1992,723-725.【10】郭四化.L-丙氨酸的消旋和 D-丙氨酸的制备及 L-丙氨酸的合成工艺研究D.杭州：浙江大学硕士学位论文，2005.【11】寇天平.发酵生产中泡沫的消除 J.发酵科技通讯，2006 年 01 期.【12】刘菊湘,刘国栋,阎虎生,程晓辉,何炳林,姜根华,杨国英.用低交换容量聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂柱色谱分离中性氨基酸J.高等学校化学学报，2001 年 12 期.【13】姚汝华，周世水.微生物工程工艺原理.华南理工大学出版，2005,9：377-380【14】梁世中.生物工程设备.中国轻工业出版社，2011，6：548-549 发发酵酵工工程程与与设设备备课课程程设设计计成成绩绩评评定定表表成成绩绩评评定定内内容容及及要要求求：15 课程设计格式符合要求程度（10 分）。（）参考文献格式及是否全面（5 分）。（）课程设计内容达到要求程度：（65 分）：（）前言（10）发酵机制（5）发酵工艺及特点（15）菌种的制备及种子的扩大培养（10）培养基的组成及制备（15）无菌空气制备系统、工艺计算、三废处理（10）答辩情况：汇报情况、是否能回答所提问题（20），（）总总分分：（）总总成成绩绩：指指导导教教师师签签名名：答答辩辩小小组组教教师师签签名名：