trizolLS试剂使用中文说明指导书.docx

TRIzol LS 试剂(ambion)（汉字说明书）
货号 规格 室温贮存
10296-010 100ml
10296-028 200ml
产品描述
TRIzol LS试剂适适用于液体样品，如人、动植物、酵母、细菌或病毒起源液体样品，提取高质量总RNA（DNA和蛋白质也能够）全过程只需1小时。TRIzol LS试剂里含有酚、异硫氰酸胍和其它成份，因为在摇匀样品过程中能很有效地抑制RNase活性，所以TRIzol LS试剂能维持RNA完整性。TRIzol LS试剂许可同时处理大量样品。
TRIzol LS试剂能从一个样品里有序分离提取RNA、DNA和蛋白质。TRIzol LS试剂均质化样品后，加入氯仿，能看见分层现象，上层是透明含RNA水相，中间层，下层是红色有机相（含有DNA和蛋白质）。水相RNA用异丙醇能沉淀分离；中间层或下层中DNA用乙醇沉淀分离；异丙醇沉淀能使蛋白质从酚-醇相上清液中沉淀出来。沉淀出RNA、DNA和蛋白质洗脱杂质，重悬后用于下游。
分离RNA能够用于RT-PCR, Northern Blot analysis, Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning
分离DNA能够用于PCR, and Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots.
分离蛋白质能够用于Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation.
注意：TRIzol LS试剂适适用于液体样品（如，血液和病毒制品）。TRIzol LS试剂和TRIzol试剂仅在它们成份含量上不一样，TRIzol LS试剂浓度更高，所以相对于同个样品时，TRIzol LS试剂需要量更少。不要将未稀释TRIzol LS试剂用于固体样品。处理固体样品时，TRIzol LS试剂没有TRIzol试剂效果好，收率要低些。
警告
TRIzol LS试剂含有成份含有毒、腐蚀性和刺激性，假如处理不慎会有危害健康。请在通风橱里操作，并穿好试验服、戴好手套和安全眼镜。避免直接接触TRIzol LS试剂，会造成皮肤、眼睛或呼吸道等暴露部位化学灼伤。假如万一接触了皮肤或眼睛，请立即用大量水冲洗15min，必需时去医院护理。假如吸入了气体，立即到通风地方呼吸新鲜空气，必需时去医院护理。
内容和贮存
TRIzol LS试剂有100ml和200ml两种规格，室温运输和贮存。妥善保管，1年内性质全部很稳定。
使用目标
仅用于研究，不能用于人或动物诊疗或诊疗。
需要材料
分离RNA、DNA和蛋白质还需要下列材料，不过我们未提供
分离RNA时，需要：氯仿；异丙醇；75%乙醇（DEPC水处理过）；无RNase水或0.5%SDS；能达成12,000*g高速离心机；聚丙烯微量离心管；水浴槽（55-60℃）。
分离DNA时，需要：氯仿；100%乙醇；75%乙醇；0.1M柠檬酸钠（10%乙醇）；8mM NaOH；能达成12,000*g高速离心机；聚丙烯微量离心管。
分离蛋白质时，需要：氯仿；异丙醇；100%乙醇；0.3M盐酸胍（95%乙醇）；1%SDS；能达成12,000*g高速离心机；聚丙烯微量离心管。
样品准备
样品均质化
1.确定样品类型，在室温下以下表操作。TRIzol LS试剂和样品体积比为3:1，一定要按指定量加入TRIzol LS试剂，不然提取RNA会有DNA污染。
注意：当样品少许（<106细胞或<10mg组织）或样品体积<0.25mL，为方便提取RNA，需用无RNase水调整样品体积到0.25ml。
样品类型为生物液体时，操作步骤：1.每0.25ml样品加入0.75mlTRIzol LS试剂；2.移液器上下吹匀几次，使样品均匀。注意：污染物质含量高生物液体（如，全血）应该先用无RNase水按1:1稀释。
样品类型为组织时，操作步骤：1.每50-100mg组织样品或0.25ml组织悬液加入0.75mlTRIzol LS试剂；2.高速搅拌器混匀样品。注意：采集样品后要立即处理和冷冻组织样品，不能处理未稀释固体样品。
样品类型为单层贴壁细胞时，操作步骤：1.吸出培养皿中培养液；2.每10cm2表面积培养皿加入0.3-0.4mlTRIzol LS试剂,直接加到培养皿里细胞上；3. 移液器上下吹匀几次，在培养皿里直接裂解细胞。注意：不要在培养皿中加水混匀，粘附在皿上残留培养液足够了。
样品类型为悬浮细胞时，操作步骤：1.离心去除培养液取得细胞；2.每0.25ml样品（来自动植物或酵母细胞5-10*106，或细菌细胞1*107）加入0.75mlTRIzol LS试剂；注意：加入TRIzol LS试剂之前切忌洗涤细胞，避免增加mRNA降解机率；3. 移液器上下吹匀几次，裂解细胞，对于酵母或细菌细胞，可能还需要高速搅拌器来充足裂解。
2.（可选）当样品里脂肪、蛋白、多糖或胞外物质（如，肌肉、脂肪组织或块茎植物等材料），需要再加个分离步骤，移除样品里难溶物质。注意：假如你还需要回收样品里DNA，就不能做此步。
具体步骤：1.混匀样品（如前面步骤1所述）后，4℃下，12,000*g离心样品10min；注意：离心后沉淀物质包含ECM、多糖和高分子量DNA，RNA在上清液里，若样品富含脂肪，在上清液上面还有脂肪层；2.移除覆盖脂肪层；3.将澄清上清液移到新离心管中。
3.进行相分离，或储存已混匀样品。此样品能在室温放置多个小时，或在-60到-70℃最少30天。
相分离
1. 室温静置已混匀样品（见混匀样品步骤）5min。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.2ml氯仿。盖紧离心管盖子。
3. 使劲地手摇离心管15s。
4. 室温静置2-15min。
5. 4℃下，12,000*g离心样品15min。
注意：混合物被分为3层，上层是澄清水相，中间层，下层是红色酚-氯仿相，只有RNA被排除在水相里。上层水相体积约占TRIzol LS试剂最初体积~70%。
6. 倾斜离心管为45°，小心地用移液器吸走水相，避免吸到中间层或有机层。
7. 将水相移到新离心管，然后进行RNA分离步骤。
8. 假如需要分离DNA和蛋白质，则保持中间层和酚-氯仿相有机层。详见DNA分离步骤和蛋白质分离步骤。有机相可在4℃保留过夜。
RNA分离步骤
当制备和处理RNA时，需要采取合适方法避免RNase污染。
RNA沉淀
1. （可选）当沉淀从少许样品（<106细胞或<10mg组织）提取RNA，需要添加5-10μg不含RNase糖原作为水相载体。注意：糖原是RNA辅助沉淀剂，浓度≤4mg/ml时不会抑制第一链合成，也不会抑制PCR。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.5ml100%异丙醇到水相。
3. 室温静置10min。
4. 4℃下，12,000*g离心10min。
注意：离心前，RNA通常看不见，离心后，在离心管底部和侧面可见丝状沉淀物。
5. 进行RNA洗涤和重悬
RNA洗涤和重悬
1. 移走离心管里上清液，只留RNA沉淀。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀。涡旋，混匀样品。
3. 4℃下，7500*g离心5min，弃上清液。
4. 真空或空气干燥RNA沉淀5-10min，不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
注意：不要让RNA沉淀干燥太根本，不然RNA沉淀溶解度降低，会使A260/280<1.6。
5. 用无RNase水或0.5%SDS（20-50μL）重悬RNA沉淀，移液器上下轻轻吹溶液几次。
注意：假如要用于随即酶反应中，就不要将RNA溶解在0.5%SDS里。
6. 在水浴槽55-60℃孵育10-15min。
7. 继续下游操作或储存在-70℃。
DNA分离步骤
从相分离步骤中保留中间层和酚-氯仿层提取DNA。
DNA沉淀
1. 移走覆盖在中间层上残留水相层，这是包含到DNA提取质量关键一步。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.3ml 100%乙醇。
3. 盖紧离心管，上下颠倒几次，混匀样品。
4. 室温静置2-3min。
5. 4℃，*g离心5min，沉淀DNA。
6. 移走酚-氯仿层，假如需要提取蛋白质，则保留在新离心管中。该上清液可在-70℃下保留数月。
7. 对DNA沉淀进行DNA洗涤和重悬。
DNA洗涤和重悬
1. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1ml柠檬酸钠/乙醇溶液（10%乙醇溶有0.1M柠檬酸钠，PH8.5）。
2. 室温静置30min，不定时轻轻地上下倒置混匀。
注意：DNA能在柠檬酸钠/乙醇溶液里保留2h。
3. 4℃，*g离心5min，弃上清液。
4. 再次洗涤（反复步骤1-3）。
注意：当DNA沉淀较多（>200μg）时，反复洗涤两次。
5. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1.5-2ml75%乙醇。
注意：DNA样品在75%乙醇4℃能保留数月。
6. 室温静置10-20min，不定时轻轻地上下倒置混匀。
7. 4℃，*g离心5min，弃上清液。
8. 真空或空气干燥DNA沉淀5-10min，不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
9. 以0.2–0.3 μg/μL 浓度用8mM NaOH重悬DNA，每50-70mg组织或1*107细胞加入8mM NaOH 0.3-0.6mL。
注意：我们高度提议用温和碱溶液重悬DNA，因为分离DNA在水或Tris缓冲液中重悬效果不好。
10. 4℃，12,000*g离心10min，移走不溶物质。
11. 将含DNA上清液转移到新离心管中，若需要，用HEPES调整PH，进行下游操作。DNA能在4℃保留过夜，要想长久保留，则需用HEPES调整PH7-8，添加1mM EDTA，保留在4℃或-20℃。
DNA和RNA产量测定
用RNA和DNA在260nm和280nm处吸收值测定浓度。
预期产量
下表列出了多种起源材料提取RNA（A260/280>1.8）和DNA（A260/280为1.6-1.8）标准产量

蛋白分离步骤
从DNA沉淀步骤后留下来酚-氯仿层分离蛋白质，蛋白质沉淀或蛋白透析。
蛋白质沉淀
1. 每1mlTRIzol LS试剂加入1.5ml异丙醇到酚-氯仿层。
2. 室温静置10min。
3. 4℃，12,000*g离心10min，保留沉淀蛋白，弃上清液。
4. 对蛋白沉淀进行蛋白洗涤。
蛋白洗涤
1. 准备洗涤液，即：0.3M盐酸胍溶于95%乙醇。
2. 每1mlTRIzol LS试剂加入2ml洗涤液，洗涤蛋白沉淀。
3. 室温静置20min。
注意：蛋白样品可在0.3M盐酸胍-95%乙醇，4℃下保留30天或-20℃最少保留十二个月。
4. 4℃，7500*g离心5min，弃洗涤液。
5. 反复步骤2-4，两次。
6. 洗涤3次后，加入2ml100%乙醇，涡旋。
7. 室温静置20min。
8. 4℃，7500*g离心5min，弃乙醇洗涤液。
9. 空气干燥蛋白沉淀5-10min，不要干燥太根本。
10. 进行蛋白重悬步骤。
蛋白重悬
1. 加1%SDS200μL,用移液管上下吹打直到蛋白重悬。
注意：为了根本溶液蛋白沉淀，可能需要将蛋白沉淀在水浴槽50℃孵育。
2. 4℃，10,000*g离心10min，让不溶物质沉淀。
3. 将含有蛋白上清液转移到新离心管，进行下游操作或保留在-20℃。
蛋白透析
1. 将酚-氯仿层溶液放进透析膜中。
注意：酚-氯仿层溶液能溶解一些透析膜（如，纤维素酯）。操作前需要检验下。
2. 在4℃下，用0.1%SDS溶液透析样品，需要更换3次0.1%SDS溶液，透析16h后第一次更换，过4h后（即透析20h）第二次更换，过2h后（即透析22h）第三次更换。
注意：需要0.1%SDS溶液再次溶液蛋白样品，低浓度SDS是不够，若需要，能够先将蛋白沉淀溶解后再稀释SDS。
3. 4℃，10,000*g离心透析液10min，蛋白在上清液中。
4. 将上清液转移到新离心管中，进行下游操作或保留在-20℃。
5. （可选）加入100μL 1%SDS和100μL 8M尿素，溶解蛋白沉淀。
蛋白产量测定
Bradford法检测蛋白浓度（SDS浓度必需小于0.1%）。
问题和处理
问题
原因
处理
RNA产量低，DNA产量低或蛋白质产量低
l 样品均化或裂解不充足
l 最终RNA、DNA或蛋白质重新溶解不完全
l 降低原始材料量。将组织切更碎些，确保能完全沉醉在TRIzol LS试剂，达成最好裂解效果。
l 反复用移液器吸移样品并在50-50℃加热样品，增大溶解。
RNA降解，DNA降解或蛋白降解
l 样品搜集后没有立即处理或冷冻。
l RNA、DNA或蛋白分离后没有保留在正确温度下。
l 样品搜集后必需立即处理或冷冻。
l RNA样品保留在-60到-70℃，DNA样品和蛋白样品保留在-20℃。
RNA污染或DNA污染
l 吸收水相时也吸到了中间相或有机相
l 水相移除不根本
l 0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀不充足

l 在相分离后不要试图将水相溶液吸洁净。
l 在沉淀DNA之前必需吸洁净残留水相溶液。
l 确保0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀。
RNAA260/280值偏低
l 样品均质化时，TRIzol LS试剂体积用量不够
l 有机相移除不洁净
l 依据样品类型加入合适量TRIzol LS试剂。
l 相分离后不要试图将水相溶液吸洁净。
DNAA260/280值偏低
DNA样品里有酚残留
再用0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀1次。