银杏雌、雄植株叶片药用成分含量及转录组差异分析.pdf

Vol.44 No.1Jan.2024第 44 卷 第 1 期2024 年 1 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2023-03-24基金项目：国家自然科学基金项目（32101559）；江苏省自然科学基金项目（BK20200770）。第一作者：傅芸（），硕士研究生。通信作者：付芳芳（），教授，博士，博士研究生导师。引文格式：傅芸,钟寅枭,许薇,等.银杏雌、雄植株叶片药用成分含量及转录组差异分析 J.中南林业科技大学学报,2024,44(1):162-174.FU Y,ZHONG Y X,XU W,et al.Differential analysis of the main medicinal components contents and the transcriptome in the female and male Ginkgo biloba leavesJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(1):162-174.银杏雌、雄植株叶片药用成分含量 及转录组差异分析傅 芸1，钟寅枭1，许 薇1，刘玉华2，张心娴1，魏启轩1，曹福亮1，付芳芳1（1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.江苏农林职业技术学院 风景园林学院,江苏 镇江 212400）摘 要：【目的】探究雌、雄银杏叶片中萜内酯和黄酮醇苷及其主要组分的含量差异及基因在转录水平上的差异。【方法】选取雌、雄银杏各 10 株，以叶片为试验材料，运用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV），分别测定萜内酯、黄酮醇苷含量，并选取萜内酯和黄酮醇苷含量具有代表性的 3 个雌株和 3 个雄株进行转录组测序。【结果】雌株中萜内酯及其主要组分含量均略高于雄株，但差异不显著；黄酮醇苷及其主要组分含量均高于雄株，但各组分中仅槲皮素含量差异显著（P=0.045）。转录组测序共得到 288 023 696 条 Raw reads，257 059 884 条 Clean reads，Q30 91.24%，GC 含量 45.95%，唯一比对率 85.04%。共鉴定（P 0.05 且|log2FC|1）出 676 个差异表达基因，与雌株相比，雄株有 340 个差异表达基因上调表达，336 个 差异表达基因下调表达。GO 富集分析显示有 372 个差异表达基因显著富集到氧化还原过程、碳水化合物代谢过 程、解毒、催化活性等 163 个 GO 条目中。KEGG 富集分析表明差异表达基因主要与植物激素信号转导、植物-病原互作、其他聚糖降解、类固醇生物合成等代谢通路有关。银杏萜内酯和黄酮醇合成通路上相关结构基因的表达在雌株中均高于雄株，与雌株中萜内酯、黄酮醇苷含量高于雄株的趋势相一致。【结论】不同性别银杏叶片中萜内酯和黄酮醇苷含量及生物合成途径相关基因的表达量均有差异，雌株略高于雄株。研究为基于不同性别的叶用银杏优良种质的筛选和培育提供了一定的理论基础。关键词：银杏叶片；雌、雄植株；萜内酯；黄酮醇苷；转录组中图分类号：S718.43 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2024)01-0162-13Differential analysis of the main medicinal components contents and the transcriptome in the female and male Ginkgo biloba leavesFU Yun1,ZHONG Yinxiao1,XU Wei1,LIU Yuhua2,ZHANG Xinxian1,WEI Qixuan1,CAO Fuliang1,FU Fangfang1(1.Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China;2.Jiangsu Vocational and Technical College of Agriculture&Forestry,Zhenjiang 212400,Jiangsu,China)Abstract:【Objective】To explore the differences in the content of terpene lactones and flavonol glycosides and their main components and gene transcription between female and male Ginkgo biloba leaves.【Method】The liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)and high performance liquid chromatography-ultraviolet(HPLC-UV)were applied to determine the content of terpene lactones and flavonol glycosides in 10 female and 10 male G.biloba leaves,respectively.The transcriptome sequencing was performed on 3 female and 3 male G.biloba leaves with representative contents of terpene lactones and flavonol glycosides.【Result】The contents of terpene lactones and flavonol glycosides and their main components in female leaves were relatively higher than those in male leaves,but only quercetin content was significantly different.Through transcriptome sequencing,a total of 288 023 696 Raw reads,and 257 059 884 Clean reads are obtained.Q30 91.24%,GC content 45.95%,and uniquely mapped reads rate 85.04%.A total of 676 differentially expressed genes(DEGs)were identified(P 0.05 and|log2FC|1),and compared with female plants,340 DEGs were up-regulated and 336 DEGs were down-regulated in male plants.GO enrichment analysis showed that 372 DEGs were significantly enriched into 163 GO terms,including oxidation-reduction process,carbohydrate metabolic process,detoxification and catalytic activity.KEGG enrichment analysis showed that the DEGs were mainly related to metabolic pathways such as plant hormone signal transduction,plant-Doi:10.14067/ki.1673-923x.2024.01.016163中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷银 杏 Ginkgo biloba 又 称 公 孙 树、白 果树、鸭掌树，是雌雄异株植物，为裸子植物门Gymnospemae 银杏科 Ginkgoaceae 银杏属 Ginkgo唯一生存种，是世界上著名的孑遗植物，被誉为“活化石”1。银杏是我国特有的经济树种，在果用、叶用、材用、食用、观赏、生态防护、医疗保健等方面具有很高的应用价值，尤其是药用价值在世界范围内越来越受到关注2-3。银杏叶提取物（EGb761）及其制剂中含有多种化学成分，包括黄酮类、萜内酯类、聚戊烯醇类、有机酚酸类、多糖类等化合物，其中主要的活性成分为银杏萜内酯（Terpene lactones）和黄酮醇苷类（Flavonol glycosides），包括银杏内酯 A、B、C（Ginkgolide A、B、C，GA、GB、GC）和白果内酯（Bilobalide，BB）；黄酮醇苷类（Flavonol glycosides）主要有槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、异鼠李素（Isorhamnetin）4-6。银杏内酯和白果内酯是银杏中独有的成分，迄今尚未发现存在于其他任何植物中7，是一种强效特异性血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）拮抗剂8，可以改善心脑血管循环，降低心脑血管疾病和中枢神经系统疾病的发病率9-13。黄酮醇苷具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏肾脏、调节免疫14-19等药理作用。由于银杏生长缓慢，资源有限，有效成分的含量尤其是萜内酯含量非常少20，目前主要从银杏叶和根中提取，少部分来自生物合成21，并且我国叶用银杏的栽培存在起步晚、叶质量不稳定等问题22，因此难以满足国内外市场对银杏叶提取物的巨大需求。目前对银杏萜内酯和黄酮醇苷含量的影响因素研究主要从个体差异23-26、环境条件27-30、栽培措施31-35等方面进行，对于植株性别对银杏萜内酯及黄酮醇苷含量的影响缺乏系统深入研究。本研究以雌、雄银杏的叶片为材料，分别进行含量测定及转录组测序，分析萜内酯和黄酮醇苷含量的差异以及基因表达的差异，以期为不同性别银杏叶中萜内酯和黄酮醇苷的代谢调控研究和叶用银杏优良种质的选育提供理论基础。1 材料与方法1.1 试验材料2021 年 10 月 11 日，于南京林业大学校园内选取长势良好的家佛指实生银杏 20 株，记为1 20 号，每株分东南西北四个方向，每个方向采集大小均匀、叶色一致、无病虫害的银杏叶 20片，混合后分为两份，一份装于信封，于 105 烘箱内杀青 15 min，调至 65 烘至恒质量，粉碎过 40 目筛后常温保存，用于萜内酯、黄酮醇苷含量的测定；一份经液氮速冻后存于-80，用于性别鉴定及转录组测序。1.2 仪器与试剂仪 器：Waters Acquity Arc 高 效 液 相 色 谱 仪（HPLC），Waters 2489 紫外检测器，Empower3色 谱 工 作 站；依 利 特 C18 色 谱 柱（4.6 mm 150 mm，3 m）；Sartorius 纯水超纯水一体机。试剂：标准品银杏内酯 A、B、C 和白果内酯，北京索莱宝科技有限公司，货号分别为 YZ-110862、YZ-110863、YZ-110864、YZ-110865；标准品槲皮素、山柰酚、异鼠李素，上海源叶生物科技有限公司，货号分别为 B20527、B21126、B21554；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；HiPure SF Plant DNA Mini Kit，上海美吉生物医药科技有限公司。1.3 试验方法1.3.1 性别鉴定本研究在选取试验植株时根据树上挂果、地上落果情况及已有雌雄标签来判断性别（表 1），但由于采样时间为 10 月份，正值银杏落果期，因此参考 Liao 等36的方法进行性别鉴定，进一步确认雌雄植株，引物序列信息见表 2。1.3.2 树龄的测定研究表明树龄对银杏叶中萜内酯和黄酮醇苷的含量有一定影响，随着树龄的增长，含量逐pathogen interaction,other glycan degradation and steroid biosynthesis.The expression of related structural genes in the synthesis pathway of ginkgo terpene lactones and flavonol glycosides was higher in female plants than in male plants,which was consistent with the trend of terpene lactones and flavonol glycosides content in female plants being higher than that in male plants.【Conclusion】The contents of terpene lactones and flavonol glycosides and the expression of genes related to biosynthesis pathways in G.biloba leaves of different sexes are different,female plants are slightly higher than that of male plants.This study provides a theoretical basis for the selection and breeding of excellent germplasm of G.biloba for excellent leaves based on different sexes.Keywords:Ginkgo biloba leaves;female and male trees;terpene lactones;flavonol glycosides;transcriptome傅 芸，等：银杏雌、雄植株叶片药用成分含量及转录组差异分析164第 1 期渐降低37-40。量取 20 株银杏的胸径，用生长锥（CO250，瑞典 Haglof）钻取树芯，测定树龄。表 1 银杏的性别记录Table 1 Sex of G.biloba trees编号No.判断依据Criterion编号No.判断依据Criterion1大量落果 11无挂果、落果2无挂果、落果12大量落果3已有标签，为雌株13已有标签，为雌株4已有标签，为雄株14已有标签，为雄株5无挂果、落果15已有标签，为雌株6无挂果、落果16已有标签，为雌株7无挂果、落果17已有标签，为雌株8无挂果、落果18树上挂果9已有标签，为雌株19无挂果、落果10无挂果、落果20树上挂果 表 2 用于 PCR 扩增的引物序列Table 2 Nucleotide sequence of primers used for cloning of DNA名称Name引物方向Orientation引物序列Primer sequence(5-3)GbMADS18 FForwardTATAATTGGGGATGAGCTTTAGbMADS18 RReverseGGGGTGCAAGACAATTTTInternal FForwardAAGAGTGTAGGTGGACACCInternal RReverseTCTCATTGTCTGAGATTCTAGCAATC1.3.3 萜内酯含量的测定萜内酯的提取采用超声提取方法，并通过液质联用法测定其含量（C萜内酯）。C萜内酯=CBB+CGA+CGB+CGC。式中：CBB、CGA、CGB、CGC分别表示 BB、GA、GB、GC 的含量。1）制备标准品溶液：分别精密称取 BB、GA、GB 和 GC 标准品，用甲醇配制成不同浓度的标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，采用外标法定量（BB：y=80 528 289x+1 767 918，R=0.994 7。GA：y=1 401 901x+15 901，R=0.998 9。GB：y=46 111 571x+119 938，R=0.999 7。GC：y=131 860 712x+3 424 825，R=0.995 2）。2）制备供试品溶液：精密称取 100 mg 样品粉末，置于2 mL离心管中，加入1.5 mL提取液（甲醇水=8020，v/v）涡旋混匀，室温超声提取 30 min，并在 4 条件下提取 12 h；于 12 000 r/min 离心 5 min 后，转移上清液至新的离心管中，残渣加入 1 mL 甲醇涡旋混匀，重复超声提取 30 min，于 12 000 r/min 离心 5 min；合并两次上清液后置于低温真空浓缩仪中浓缩至干；加入 100 L 甲醇复溶后，经 0.22 m 有机滤膜过滤，转入进样小瓶中待测。3）色谱条件：Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱（2.1 mm100 mm，3 m）；柱温 35；进样体积 5 L；流速 0.3 mL/min；流动相 AB=0.1%甲酸水甲醇；梯度洗脱：0 0.2 min，A=90%；0.2 3.0 min，A 递 减 至 10%；3 8 min，A=10%；8.0 8.1 min，A 递 增 至 90%；8.1 10.0 min，A=90%。4）质谱条件：离子源 H-ESI；极性 Positive；喷雾电压 3 500 V；鞘气 40 Arb；辅助气 12 Arb；雾化温度 333；离子传输管温度 317；扫描方式 SRM。1.3.4 黄酮醇苷含量的测定黄酮醇苷的提取及含量（C黄酮醇苷）的测定参考张凤景等41的方法，并稍作修改。C黄酮醇苷=（C槲皮素+C山奈酚+C异鼠李素）2.51。式中：C槲皮素、C山柰酚、C异鼠李素分别表示槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量。1）制备标准品溶液：分别精密称取槲皮素、山柰酚和异鼠李素标准品，用甲醇配制成不同浓度的标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以外标法定量（槲皮素：y=34 543x+262.68，R=0.993 7。山柰酚：y=34 977x+8 326.5，R=0.993 5。异鼠李素：y=21 239x+2 032.6，R=0.992 6）。2）制备供试品溶液：精密称取 0.5 g 样品粉末，置于 50 mL 离心管中，加入 25 mL 水解液（甲醇 25%盐酸=41，v/v）并称质量，于 80 水浴中提取 40 min 后快速冷却并称质量，用甲醇补足失重，经 0.22 m 有机滤膜过滤，转入进样小瓶中待测。3）色谱条件：波长 360 nm；柱温 30；流速 1 mL/min；流动相 AB=0.4%磷酸水 甲醇（5050）；进样体积 10 L。萜内酯、黄酮醇苷标准品的图谱见图 1。1.3.5 转录组测序RNA 的提取及测序工作由浙江安诺优达基因科技有限公司完成。得到原始数据（Raw data）后 通 过 Fast QC v0.11.9 检 测 序 列 质 量；使 用trimmomatic-0.39 过滤 Raw data 中的低质量碱基和接头序列，得到 Clean data；采用 STAR v2.7.9a 将序列比对到银杏基因组上，根据比对结果，利用RSEM 计算各样本所有基因的表达量（TPM）；通过在线网站 https:/ P 0.05 且|log2FC|1 为标准，筛选得到差异表达基165中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷因（Differentially Expressed Genes，DEGs），再进行 GO 富集和 KEGG 富集分析，均以 P 0.05表示显著富集。1.4 数据处理采用 Excel 2010 软件进行数据整理，采用SPSS 23.0 软件中的独立样本 t 检验进行差异显著性分析，结果用平均值 标准差表示，P 0.05为差异显著。每个指标设置 3 次重复。2 结果与分析2.1 性别鉴定根据挂果情况，可初步判断部分银杏树的性别（表 1），但仍有部分无法确认。为了进一步确认所选 20 株银杏的性别，利用雄性特异性引物进行了PCR检测，结果如图2所示。由图2可知，1、3、9、12、13、15、16、17、18、20 号银杏为雌株，2、4、5、6、7、8、10、11、14、19 号为雄株，与表1 判断的性别结果一致，可用于后续试验。2.2 树龄鉴定如表 3 所示，20 株银杏的平均胸径为 25.50 cm，除 17 19 号外，其余植株胸径均大于 20 cm。选取其中1、2、4、6、7号银杏进行树芯采样（图3），根据年轮数得到 5 株银杏的树龄分别为 29、30、32、23、21 a，表明所选银杏年龄相对均一。图 1 萜内酯、黄酮醇苷标准品图谱Fig.1 Atlas of terpene lactones and flavonol glycosides in standard solutions红色箭头表示来自 GbMADS18 基因的雄性特异性条带；蓝色箭头表示来自 GAPDH 基因的对照条带。The red arrow indicates male-specific bands from the GbMADS18 gene;The blue arrow indicates the reference band from the GAPDH gene.图 2 银杏性别鉴定Fig.2 Sex identification of G.biloba trees2.3 雌雄银杏叶中萜内酯含量及其差异分析20 株银杏叶片中萜内酯及其主要组分的含量见表 4。由表 4 可知，雌株中 BB、GA、GB、GC、总萜内酯含量范围分别为 0.357 0.804、0.368 1.841、0.346 0.914、0.078 0.320、1.326 3.807 mg/g；雄 株 中 BB、GA、GB、GC、总萜内酯含量范围分别为 0.373 0.789、0.242 1.550、0.325 0.905、0.051 0.293、1.025 3.535 mg/g。傅 芸，等：银杏雌、雄植株叶片药用成分含量及转录组差异分析166第 1 期表 3 银杏的胸径Table 3 The diameter at breast height of G.biloba trees编号No.胸径Diameter at breast height/cm 编号No.胸径Diameter at breast height/cm128.75 1132.70 229.30 1227.75 327.20 1332.25 426.50 1429.10 525.10 1526.10 626.70 1620.00 730.50 1714.80 827.80 1811.70 926.20 1916.10 1031.40 2020.10 雌株银杏叶中BB平均含量为（0.6220.124）mg/g，雄株为（0.5530.154）mg/g，雌株约为雄株的 1.12 倍；雌、雄株GA平均含量分别为（0.9900.549）mg/g 和（0.6640.456）mg/g，雌株约为雄株的 1.49 倍；雌、雄株GB平均含量分别为（0.5610.164）mg/g和（0.5440.300）mg/g，雌株约为雄株的 1.03 倍；雌、雄株 GC 平均含量分别为（0.1910.082）mg/g和（0.1710.090）mg/g，雌株约为雄株的1.12倍；雌、雄株总萜内酯平均含量分别为（2.3630.846）mg/g 和（1.9320.853）mg/g，雌株含量约为雄株的1.22倍（图 4）。可见雌株中萜内酯及其主要组分含量均略高于雄株，但不显著。图 3 银杏的树芯Fig.3 The core of G.biloba trees表 4 银杏叶萜内酯及其主要组分的含量 Table 4 Contents of terpene lactones and its main components in leaves of G.biloba trees (mg/g)编号No.雌株 Female编号No.雄株 Male白果内酯BB银杏内酯 AGA银杏内酯 BGB银杏内酯 CGC总萜内酯TTL白果内酯BB银杏内酯 AGA银杏内酯 BGB银杏内酯 CGC总萜内酯TTLs10.507 0.477 0.381 0.078 1.443 20.690 0.469 0.389 0.097 1.645 30.357 0.409 0.443 0.116 1.326 40.373 0.242 0.325 0.086 1.025 90.587 0.369 0.346 0.078 1.380 50.456 0.297 0.396 0.110 1.259 120.649 0.953 0.552 0.150 2.304 60.418 0.282 0.362 0.051 1.113 130.651 0.911 0.658 0.223 2.443 70.694 0.824 0.580 0.209 2.307 150.804 1.050 0.528 0.198 2.581 80.722 1.083 0.905 0.254 2.964 160.698 1.646 0.535 0.248 3.127 100.418 0.291 0.483 0.116 1.306 170.644 1.634 0.671 0.256 3.204 110.508 0.478 0.501 0.203 1.690 180.731 1.841 0.914 0.320 3.807 140.459 1.126 0.592 0.293 2.470 200.589 0.607 0.580 0.243 2.019 190.789 1.550 0.904 0.291 3.535 均值Average0.6220.9900.5610.1912.363均值Average0.5530.6640.5440.1711.9312.4 雌雄银杏叶中黄酮醇苷含量及其差异分析20 株银杏叶片中黄酮醇苷及其主要组分的含量见表 5。雌株中槲皮素、山柰酚、异鼠李素、总黄酮醇苷的含量范围分别为0.3250.681、0.517 1.116、0.318 0.517、3.446 5.459 mg/g；雄株中槲皮素、山柰酚、异鼠李素、总黄酮醇苷的含量范围分别为 0.284 0.514、0.539 0.964、0.187 0.501、2.818 4.422 mg/g。雌、雄株银杏叶中槲皮素平均含量分别为 0.510 mg/g和0.409 mg/g，具有显著差异（P=0.045）；雌、雄株山柰酚平均含量分别为 0.792 mg/g 和 0.770 mg/g，雌株约为雄株的 1.03 倍；雌、雄株异鼠李素平均含量分别为 0.377 mg/g 和 0.335 mg/g，雌株约为雄株的 1.13 倍；雌、雄株总黄酮醇苷平均含量分别为 4.215 mg/g 和 3.798 mg/g，雌株含量约为雄株的 1.11 倍（表 5，图 4）。可见雌株中黄酮醇苷及其主要组分同样均高于雄株。2.5 银杏转录组测序分析结果2.5.1 测序数据质量分析选取萜内酯和黄酮醇苷含量具有代表性的 3株雌株（16、17、18 号）及 3 株雄株（4、5、6 号）进行转录组测序。6 个样本共得到 288 023 696 个 Raw reads，质控后获得 257 059 884 个 Clean reads，各样本 Q30 91.24%，GC 含量 45.95%，唯一比对率 85.04%，表明测序质量良好，可用于后续分析（表 6）。167中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷2.5.2 差异表达基因筛选及其 GO 富集分析对雌雄银杏的差异表达基因（DEGs）进行鉴定（P 0.05 且|log2FC|1），结果表明，雄株相对于雌株，共筛选得到 676 个 DEGs，其中有340 个基因表达上调，336 个基因下调（图 5）。对 676 个差异表达基因进行 GO 富集分析，结果显示共有 479 个 DEGs 被注释到 GO 数据库中，其中有 372 个（182 个上调基因，190 个下调*表示 P 0.05，差异显著。*indicates P 0.05,the difference was statistically significant.图 4 雌雄银杏叶萜内酯及黄酮醇苷含量对比Fig.4 Comparison of terpene lactones and flavonol glycosides in leaves of male and female G.biloba trees表 5 银杏叶黄酮醇苷及其主要组分的含量 Table 5 Contents of flavonol glycosides and its main components in leaves of G.biloba trees (mg/g)编号No.雌株 Female编号No.雄株 Male槲皮素Quer山柰酚Kaemp异鼠李素Isorh总黄酮醇苷TFG槲皮素Quern山柰酚Kaemp异鼠李素Isorh总黄酮醇苷TFGs10.5380.5170.3183.44620.5040.8160.2513.94030.4590.6740.3563.73740.5140.6750.3553.87690.4050.8740.3324.04150.3300.7970.2943.569120.6540.6650.4084.33560.3970.5390.1872.818130.3250.7480.3233.50570.2840.8730.2523.536150.6590.6730.3724.28080.3320.7520.5013.978160.5061.1160.3845.037100.4370.9640.3614.422170.6810.9770.5175.459110.4760.7680.4884.349180.4970.7710.4084.205140.3460.8050.2923.622200.3780.9030.3554.105190.4660.7080.3693.870均值Average0.5100.7920.3774.215均值Average0.4090.7700.3353.798表 6 转录组测序数据质量汇总Table 6 Summary of transcriptome sequencing data样品名称Sample原始序列Raw reads质控序列Clean readsQ30/%GC/%唯一比对率Uniquely mapped reads/%F1（16）41 350 99239 177 20492.6846.6485.04F2（17）50 659 25644 567 85492.9547.1682.87F3（18）49 120 76642 526 29293.3346.5189.78M1（4）44 227 04241 006 40491.2446.7689.32M2（5）51 009 15244 583 72292.9845.9591.37M3（6）51 656 48845 198 40893.1246.7585.04 以 F1、F2、F3 代表 16、17、18 号雌株；以 M1、M2、M3 代表雄株 4、5、6 号。F1,F2,F3 represent female plants 16,17,18;M1,M2,M3 represent male plants 4,5,6.傅 芸，等：银杏雌、雄植株叶片药用成分含量及转录组差异分析168第 1 期基因）显著富集（P0.05）在163个GO条目（GO Terms）中，其中生物过程（Biological process，BP）类 别 有 79 个 条 目，分 子 功 能（Molecular function，MF）类别有 64 个，细胞组分（Cellular component，CC）类别有 20 个。图 5 差异表达基因火山图和 GO 富集气泡图Fig.5 Volcano map of DEGs and GO enriched bubble chart筛选出 P 值最小的前 20 个 GO Terms，结果（图 5）发现在生物过程模块中，显著富集于氧化还原过程（49 个上调基因，48 个下调基因）、碳水化合物代谢过程（35 个上调基因，38 个下调基因）、解毒（12 个上调基因，7 个下调基因）中的 DEGs 较多；在分子功能模块中，显著富集于催化活性（151 个上调基因，165 个下调基因）、氧化还原酶活性（51个上调基因，51个下调基因）、水解酶活性、作用于糖基键（19 个上调基因，25个下调基因）中的DEGs较多；在细胞组分模块中，显著富集于胞外区（19 个上调基因，13 个下调基因）、外部封装结构（12 个上调基因，8 个下调基因）、细胞壁（12 个上调基因，8 个下调基因）中的 DEGs 较多。2.5.3 差异表达基因 KEGG 富集分析对 676 个 DEGs 进行 KEGG 富集分析，结果显示共有 42 个差异基因注释到 18 条代谢通路中（图 6），其中有 25 个 DEGs（13 个上调基因，12 个下调基因）显著富集（P 0.05）到 4 条代谢通路中，包括植物激素信号转导，涉及 7 个上调基因和 4 个下调基因；植物-病原体互作，涉及6 个上调基因和 3 个下调基因；其他聚糖降解，涉及 3 个下调基因；类固醇生物合成，涉及 2 个下调基因。2.5.4 银杏萜内酯合成途径上的结构基因差异表达分析根据 KEGG 通路和基因功能注释，对银杏萜内酯合成途径中的 AACT、HMGS、HMGR、MVK、PMK、MVD、FPS、DXS、DXR、MECT、CMK、MECPS、HDS、HDR、IDI、GGPPS、LPS 17 个结构基因进行了鉴定，共获得 66 个与银杏萜内酯合成相关的基因，其中共 37 个基因在不同性别银杏叶片中有表达（TPM 1）（图 7）。相对于雄株，在雌株中，AACT（evm.TU.chr4.1505、evm.TU.chr4.1507）、HMGS（evm.TU.chr2.1595、evm.TU.chr11.666）、HMGR（evm.TU.chr9.1801、evm.TU.chr4.1170、evm.TU.chr4.1171）等 24 个 基因的表达量均增加 1 倍以上，其中 AACT（evm.169中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷TU.chr4.1507）在雌株中的表达量是雄株的 2.52倍，HMGR（evm.TU.chr9.1801）是 雄 株 的 2.64倍，PMK（evm.TU.chr12.788）是 雄 株 的 1.78倍，DXS（evm.TU.chr10.14）是雄株的 1.46 倍，HDR（evm.TU.chr9.1982）是雄株的 1.81 倍，LPS（evm.TU.chr1.2006）是雄株的 1.92 倍，LPS（evm.TU.chr1.2013）是雄株的 1.98 倍。可见银杏萜内酯合成途径上相关基因的表达在雌株中高于雄株，这与雌株中萜内酯及其组分含量均高于雄株的趋势相一致。图 6 差异表达基因 KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of DEGs2.5.5 银杏黄酮醇合成途径上的结构基因差异表达分析对银杏黄酮醇合成途径中的 PAL