天津地区中华绒螯蟹及养殖环境中二尖梅奇酵母流行情况调查.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302004天津地区中华绒螯蟹及养殖环境中二尖梅奇酵母流行情况调查徐晓丽1，郝爽1*，李媛媛2，郝俊1，贾磊1，耿绪云1，张鹏3(1.天津市水产研究所，天津 300221；2.天津农学院，天津 300191；3.天津市北辰区农业发展服务中心，天津 300400)摘要：为探究近年天津地区中华绒螯蟹(河蟹)“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的感染情况及传播特点，本研究于2020年2022年间，从天津地区稻蟹综合种养殖企业和育苗场采集各生长阶段河蟹样品(包括溞状幼体、大眼幼体、种蟹等)236批共8 163只，环境样品51批共116份(包括养殖水体、底泥、稻田野杂鱼虾等)。将处理过的上述样品涂布孟加拉红固体平板，28 培养48 h后观察菌落形态。采用PCR检测上述样品及疑似菌落中的二尖梅奇酵母并测序比对。结果显示，部分样品在固体平板上长出乳白色、边缘光滑、不透明的圆形菌落，镜检观察可见菌体长约3 滋m7 滋m，呈大量多边出芽生殖的圆形或卵圆形。PCR结果显示部分样品出现339 bp的目的条带，测序后于NCBI数据库中比对结果显示，测序片段与二尖梅奇酵母相应基因序列高度一致。统计结果显示，河蟹样品总阳性率14.71%(1 201/8 163)、批次阳性率34.32%(81/236)，养殖环境样品总阳性率12.07%(14/116)、批次阳性率13.73%(7/51)。根据PCR检测结果按月份统计2020年2022年间河蟹二尖梅奇酵母的阳性率，分析该病原感染的季节流行规律；在该病原流行季节，按年份统计该病原的阳性率以分析该病原的流行趋势。对河蟹养殖环境经PCR检测该病原，并结合不同生长阶段河蟹及其环境样品的PCR检测结果，分析二尖梅奇酵母的传播途径，并分析该病原感染对河蟹养殖经济效益的影响。结果显示：3、4、5、6月份养殖河蟹的个体阳性率分别为26.22%(392/1495)、52.7%(293/556)、58.37%(408/699)和10.24%(43/420)，批次阳性率分别为55.56%(25/45)、80.95%(17/21)、83.33%(25/30)和26.32%(5/19)，其中4、5月份个体阳性率和批次阳性率均显著高于其他月份(0.05)，7月11月未检到该病原；对2020年2022年每年3月6月该病原感染河蟹的统计结果显示，2020年、2021年、2022年越冬后河蟹个体阳性率分别为37.17%(139/374)、43.69%(814/1863)、25.19%(235/933)，2022年个体阳性率较2021年显著降低(0.05)；越冬后二尖梅奇酵母感染河蟹的批次阳性率较高，2020年、2021年、2022年批次阳性率分别为86.67%(13/15)、71.43%(45/66)、44.12%(15/34)，呈逐年下降趋势。河蟹养殖环境的PCR检测结果显示，当年春季暴发“牛奶病”的暂养池水体和底泥中检出大量二尖梅奇酵母，而上一年发病暂养池的上述样品及稻田野杂鱼虾中均未检到该病原。不同生长阶段河蟹及其环境样品检测结果显示，二尖梅奇酵母在育苗期间种蟹中的样品阳性率达36.11%(65/180)，批次阳性率达90%(9/10)，但在溞状幼体、大眼幼体中均未检到该病原。感染二尖梅奇酵母的扣蟹(感染率在26.92%以上)虽未发生“牛奶病”，但当年成蟹同比缩小30%50%，产量降低30%以上。上述结果表明，天津地区二尖梅奇酵母感染河蟹时期为每年3月6月，其中4月5月为感染高峰期，且感染率呈逐年下降趋势；水平传播是二尖梅奇酵母的主要传播方式，未发现垂直传播途径；感染该病原后严重影响河蟹养殖的经济效益。本研究为了解中华绒螯蟹“牛奶病”病原的流行规律和传播途径，并为制定该病的有效防控措施提供了参考依据。关键词：中华绒螯蟹；二尖梅奇酵母；牛奶病；流行情况调查中图分类号：S945文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1127-08收稿日期：2023-02-10基金项目：天津市科技计划项目(22YFZCSN00200、22ZYCGSN00310、21YFSNSN00090)；天津市农业农村委天津市淡水养殖产业技术体系创新团队项目(ITTFRS2021000)作者简介：徐晓丽(1983-)，女，山东蓬莱人，正高级农艺师，博士研究生，主要从事水产动物病害防治研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorInvestigation on the prevalence ofinand culture environment in Tianjin areaXU Xiao-li1,HAO Shuang1*,LI Yuan-yuan2,HAO Jun1,JIA Lei1,GENG Xu-yun1,ZHANG Peng3(1.Tianjin Fishery Research Institute,Tianjin 300221,China;2.Tianjin Agricultural University,Tianjin 300191,China;3.Agricultural Development Service Center of Beichen District,Tianjin 300400,China)Abstract:In order to explore the infection situation and transmission characteristics ofleading tomilky disease inin Tianjin in recent years,this study conducted research from integrated rice crab breedingenterprises and nurseries in Tianjin between 2020 and 2022.8163 crabs(include zoaeas,megalopas,broodstock crabs)and 116culture environmental samples from major breeding zones(include water,sediment,wild fish and shrimp)were collected.Thesamples were spread on Bengal Red culture medium and cultured at 28for 48 hours to observe the colony morphology.PCRwas used to detectin the above samples and suspected colonies,and sequenced for comparison.The results showedthat milky-white,smooth-edged,opaque round colonies grew on the solid plates of some samples.Microscopic examinationshowed that the bacterial cells were about 3滋m to 7滋m long and were round or oval in shape with a large number of polygonalbuddings.PCR results showed that 339bp target bands were present in some samples.After sequencing,they were compared in theNCBI database.The results showed that the sequenced fragments were highly consistent with the corresponding gene sequences of.The statistical results showed that the overall positive rate of crab samples was 14.71%(1201/8163),and the batchpositive rate was 34.32%(81/236).The overall positive rate of culture environmental samples was 12.07%(14/116)and the batchpositive rate was 13.73%(7/51).According to the results of PCR detection,the positive rate ofwas calculated bymonth from 2020 to 2022,and the seasonal prevalence of the infection was analyzed.During the epidemic season of the disease,the positive rate of the disease was counted by year to analyze the epidemic trend of the disease.PCR was also used to detectin the crab culture environment,and combined with the PCR results of crabs and their environmental samples atdifferent growth stages,the transmission route of the disease was analyzed,and the impact of pathogen infection on the crabfarming was analyzed.The results showed that the individual positive rates of crabs in March,April,May and June were 26.22%(392/1495),52.7%(293/556),58.37%(408/699)and 10.24%(43/420),respectively;and the batch positive rates were 55.56%(25/45),80.95%(17/21),83.33%(25/30)and 26.32%(5/19),respectively.The batch positive rates in April and May weresignificantly higher than those in other months(0.05).No pathogen was detected from July to November.The statistical resultsof the infection situation of crabs from March to June in 2020 to 2022 showed that the positive rate of crabs infected withafter overwintering was higher,and the individual positive rates were 37.17%(139/374),43.69%(814/1863)and25.19%(235/933),respectively,and the individual positive rate in 2022 was significantly lower than that of 2021(0.05);Thepositive rates of batches in 2020,2021 and 2022 were 86.67%(13/15),71.43%(45/66)and 44.12%(15/34),respectively,showinga decreasing trend year by year.The PCR test results of the culture environment of crabs showed that a large number ofwere detected in the water and sediment of the temporary breeding pond where milk disease broke out in the spring of thatyear,while nowas detected in samples and wild fish and shrimp of the rice field where milk disease broke out inthe previous year.The test results of crabs and their environmental samples at different growth stages showed that,during hatchingstage,the positive rates ofin broodstock crabs reached 36.11%(65/180),while nowas detected inthe samples of zoaeas and megalopas.Although crabs infected with the yeast(infection rate above 26.92%)did not suffer frommilk disease,the adult crab shrank by 30%-50%,and the yield dropped by more than 30%.The above results showed that theepidemic period of milky disease ofwas from March to June in Tianjin,with April to May being the peak period ofinfection,and the infection rate showed a downward trend year by year.Horizontal transmission was the major transmission routeof,and no vertical transmission route had been found.The economic benefit of the culture ofwasseriously affected by infection with.This study provides a reference for understanding the epidemic regularity andtransmission route of milky disease inand formulating effective prevention and control measures.Key words:;milky disease;prevalence survey中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1128中华绒螯蟹()又称河蟹，生命周期一般为2年，从受精卵依次开始经历溞状幼体、大眼幼体(蟹苗)、仔蟹(豆蟹)阶段，于当年秋季长成扣蟹(蟹种)，进入池塘越冬，次年春天进入成蟹养殖阶段，秋季可挑选性腺发育良好的成蟹强化培育作为种蟹(亲蟹)1。作为我国重要的淡水经济养殖品种，2021年国内河蟹养殖产量达80.8万吨2。天津地区养殖河蟹主要为稻蟹综合种养模式，近年来该模式经大力推广，河蟹养殖规模不断扩大。2020年4月，天津地区多家养殖场自外地引进的扣蟹暂养期间发生大规模“牛奶病”，死亡率在50%100%，对迅速发展的稻蟹综合种养产业影响重大。病蟹具有活力减弱，步足易脱落，围心腔内蓄积大量牛奶状液体的表观特征，与2019年2020年间在盘锦地区发生的河蟹“牛奶病”症状相似3。徐晓丽等研究证实该病病原为二尖梅奇酵母()4，与其它学者对盘锦地区近年流行河蟹“牛奶病”的病原研究结果一致5-6。2021年，天津地区河蟹“牛奶病”再次发生7，给养殖户造成严重经济损失。中华绒螯蟹“牛奶病”自2018年首次发现于辽宁盘锦地区8，近年在天津、辽宁、江苏等地均有报道9-10，已呈流行趋势，防控形势严峻。已有研究表明，二尖梅奇酵母可以感染中华绒螯蟹、三疣梭子蟹()11、脊尾白虾()12、大 鳞 大 马 哈 鱼()13等多种水产动物，且具有跨宿主传播能力14，目前尚无可用的有效药物，该病原所致的水产动物疾病严重制约该养殖业的健康发展。目前，有关河蟹“牛奶病”在天津地区的流行规律、致病机制等尚不明确，缺乏对该病的系统调查和有效防控措施。本研究于2020年2022年间，采用PCR对天津地区养殖河蟹及其环境中的“牛奶病”病原持续监测，探究自然条件下二尖梅奇酵母对河蟹的感染及传播途径，为河蟹“牛奶病”防控措施的制定提供参考依据。1材料与方法1.1样品采集及主要试剂选择天津地区主要稻蟹综合种养养殖企业和育苗场，采用大面积调查与重点点位跟踪相结合的采样方法，定期检测不同生长阶段河蟹感染的病原菌，以及养殖环境中的病原菌污染情况。2020年2022年间采集各养殖阶段河蟹样品236批共8 163只，水体、底泥、稻田野杂鱼虾等养殖环境样品51批共116份(其中稻蟹综合种养养殖企业环境样品42批共98份，河蟹育苗场环境样品9批共18份)；二尖梅奇酵母基因组DNA由本研究室保存。孟加拉红培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、异戊醇购自北京索莱宝科技有限公司；DNA聚合酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.2采集样品的处理、河蟹的外观检查及各样品中分离菌的形态学观察样品采集、运输以及保存按水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范(SC/T7103-2008)执行。水样采用400目筛绢过滤于无菌瓶中，4 静置备用。底泥加入等体积的无菌生理盐水充分漩涡混匀后，4 静置，取上清备用。溞状幼体、大眼幼体、仔蟹、野杂鱼虾用碘伏浸泡消毒，无菌水充分冲洗，沥干水分，按质量体积比1颐5的比例加入预冷的生理盐水冰浴并研磨匀浆，4 静置，取上清备用。扣蟹、种蟹等用70%酒精体表消毒，于1 mL无菌注射器预先抽50 滋L抗凝剂，于第三步足血窦采集血淋巴液50 滋L，充分混匀4 静置备用。之后掰开头胸甲，观察其围心腔内是否有牛奶样病变。分别取上述处理好的溞状幼体、大眼幼体、仔蟹匀浆液、血淋巴液、水样、底泥及野杂鱼虾上清液各100 滋L，滴至孟加拉红固体平板培养基上并涂布均匀，28 恒温培养48 h后，观察菌落形态，取疑似菌落镜检。1.3样品中二尖梅奇酵母的PCR检测参照文献15方法提取处理过的待测样品及平板上疑似菌落DNA，采用特异性引物0815F(5-ATGAACCCTCGTCCCAACT-3)/0815R(5-GATAGCCTTGCCATTACTTCC-3)，以本实验室保存的二尖梅奇酵母基因组DNA作阳性对照、DEPC水作阴性对照，经PCR鉴定二尖梅奇酵母16。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果提交NCBI网站比对17-18。1.4二尖梅奇酵母感染河蟹的季节流行规律和流行趋势分析根据病原的PCR检测结果，按月份计算并统计2020年2022年期间天津主要稻蟹综合种养模式中养殖河蟹二尖梅奇酵母感染的个体阳性率和徐晓丽，等.天津地区中华绒螯蟹及养殖环境中二尖梅奇酵母流行情况调查第 11 期1129M:DL2000 DNA Marker;P:Positive control;N:Negative control;1-8:Partial samples图2部分样品中二尖梅奇酵母的PCR检测结果500bp250bp100bpMPN12345678批次阳性率，分析该病原的季节流行规律；在二尖梅奇酵母感染的流行季节，按年份计算并统计采集河蟹样品的个体阳性率和批次阳性率19，分析该病原的流行趋势。个体阳性率(%)=阳性个体数/采样个体 数伊100%；批次阳性率(%)=阳性批次数/采样批次数伊100%(注：每批次样品中只要有1例样品检测结果呈阳性，则该批次计为阳性)。采用SPSS 22.0软件中的字2检验对检测数据进行统计学分析20，0.05表示差异显著。1.5二尖梅奇酵母的传播途径分析结合主要稻蟹综合种养区域养殖环境样品，育苗场种蟹、溞状幼体、大眼幼体及其环境样品的PCR检测结果，分析二尖梅奇酵母的传播途径。1.6二尖梅奇酵母感染对河蟹养殖经济效益影响的分析选择本地区有代表性的规模较大的河蟹养殖场，于2020年2022年间，将感染二尖梅奇酵母的扣蟹(感染率为26.92%90.00%)未经暂养直接放入稻田后，跟踪监测河蟹的发病及成蟹规格，初步分析感染二尖梅奇酵母对河蟹养殖效益的影响。2结果2.1采集河蟹的剖检病变及各样品中分离菌形态的初步观察结果将河蟹掰开头胸甲后观察，部分河蟹围心腔内积蓄乳白色牛奶状液体，三角瓣及心脏发白，具有典型“牛奶病”症状4-5(图1A、图1B)。采集的样品经处理后涂布孟加拉红固体平板上，48 h后长出乳白色、边缘光滑、不透明、湿润的圆形菌落(图1C)，取疑似菌落镜检，可见大量多边出芽生殖的圆形或卵圆形、直径约3 滋m7 滋m的菌体(图1D)。上述结果与二尖梅奇酵母感染河蟹症状及培养特性一致，初步表明从各样品中分离到了二尖梅奇酵母。2.2样品中二尖梅奇酵母的PCR检测结果对从天津地区主要稻蟹综合种养殖企业、河蟹育苗场采集不同生长阶段河蟹及其养殖环境样品，处理后采用PCR检测其中的二尖梅奇酵母特异性基因，对平板培养基上生长的疑似菌落也采用PCR检测。结果显示，部分样品和阳性对照均扩增到339 bp的目的条带(图2)。对PCR产物测序后于NCBI数据库中比对，结果显示测序片段与二尖梅奇酵母相应基因序列高度一致。统计结果显示，河蟹样品总阳性率14.71%(1 201/8 163)、批次阳性率34.32%(81/236)，养殖环境样品总阳性率12.07%(14/116)、批次阳性率13.73%(7/51)。该结果进一步确定分离的病原为二尖梅奇酵母，且其在天津地区河蟹中感染率较高。2.3二尖梅奇酵母感染河蟹的季节流行规律和流行趋势分析结果统计2020年2022年不同养殖月份二尖梅奇酵母感染河蟹的情况，结果显示，3、4、5、6月份 养 殖河 蟹的个 体阳 性率分 别为26.22%(392/1495)、52.7%(293/556)、58.37%(408/699)和10.24%(43/420)，批次阳性率分别为55.56%(25/45)、80.95%(17/21)、83.33%(25/30)和26.32%(5/19)。其A：正常蟹；B：发病蟹(箭头指示为病变组织)；C、D：二尖梅奇酵母菌落及菌体形态(箭头指示为病原酵母)A:Normal crabs;B:Diseased crabs(arrow indicate severely milkytissues);C,D:Photograph of cells and colonies of(arrow indicate pathogenic bacteria)图1河蟹外观病变、河蟹及其环境样品在孟加拉红平板培养基上形成的菌落形态ABCD中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1130中4月、5月批次阳性率及个体阳性率均显著高于其他月份(0.05)，7月11月未检出该病原(表1)。结果表明，天津地区二尖梅奇酵母感染河蟹具有季节性特征，主要感染时期为每年3月6月，且主要感染越冬后的扣蟹及种蟹，其中4月、5月为该病原感染的高峰期。根据二尖梅奇酵母感染河蟹的季节规律，对2020年2022年每年36月越冬后的该病原感染的河蟹进行统计。结果显示，2020年、2021年及2022年越冬后河蟹个体阳性率分别为37.17%(139/374)、43.69%(814/1 863)、25.19%(235/933)；越冬后二尖梅奇酵母感染河蟹的批次阳性率较高，2020年、2021年、2022年批次阳性率分别为86.67%(13/15)、71.43%(45/66)、44.12%(15/34)，呈逐年下降趋势。2020年春季采集的河蟹多具有典型的发病症状，根据 水生动物产地检疫采样技术规范，仅采集少量发病个体，导致年度个体阳性率偏低，2022年个体阳性率较2021年显著降低(0.05)。上述结果表明，近年二尖梅奇酵母对河蟹的感染率呈下降趋势。2.4二尖梅奇酵母的传播途径分析采集天津地区主要稻蟹综合种养区养殖环境样品共42批次，包含养殖水体42份、底泥42份、野杂鱼虾14份样品(河蟹养殖常用密眼袖网包住进排水口，防止河蟹逃逸同时拦截野杂鱼进入养殖区域吞食蟹苗，因此野杂鱼虾样品量较少)。PCR检测结果显示，当年春季暴发“牛奶病”的河蟹暂养池水体(5份)和底泥(5份)中均可检到大量二尖梅奇酵母(阳性率100%)，上一年发病的河蟹暂养池水体(8份)、底泥(8份)及稻田野杂鱼虾(4份)中均未检测到二尖梅奇酵母，近年未发病的河蟹暂养池水体(29份)、底泥(29份)及稻田野杂鱼虾(10份)中也未检到二尖梅奇酵母，表明二尖梅奇酵母并非环境中普遍存在，主要通过被感染的河蟹水平传播进入水体及底泥中。为进一步研究二尖梅奇酵母对河蟹及其养殖环境的感染传播途径，采集河蟹育苗场中种蟹、溞状幼体、大眼幼体样品30批次，养殖环境样品9批次，对上述样品中的二尖梅奇酵母进行PCR检测。结果显示，种蟹样品阳性率36.11%(65/180)、批次阳性率90%(9/10)，在种蟹养殖池环境中也检到大量二尖梅奇酵母，但在溞状幼体、大眼幼体及其养殖环境中均未检到该病原(表2)。结果表明，二尖梅奇酵母主要感染种蟹并存在于其养殖池环境中，具有水平传播能力，但不具有垂直传播能力。2.5二尖梅奇酵母感染对河蟹养殖经济效益影响的分析结果2020年2022年，跟踪监测天津地区4家规模较大养殖场的河蟹养殖情况，其中部分养殖场因2020年4月大规模发生的河蟹“牛奶病”而延误购苗，5月进购的扣蟹(后经检测对二尖梅奇酵母感染率为26.92%90.00%)未能经暂养直接放入稻田养殖后，虽未发生河蟹“牛奶病”，但当年成蟹大小同比缩小30%50%，产量降低30%以上。表明河蟹感染二尖梅奇酵母后，虽然未出现大量发病及死徐晓丽，等.天津地区中华绒螯蟹及养殖环境中二尖梅奇酵母流行情况调查第 11 期1131表1天津地区养殖河蟹不同月份二尖梅奇酵母的检测及统计结果采样个体数Sample number阳性个体数Number of positive individuals个体阳性率/%Individual positive rate/%采样批次数Sampling batch阳性批次数Number of positive batches批次阳性率/%Batch positive rate/%149539226.22452555.56711月From Julyto November181300910055629352.70211780.9569940858.37302583.334204310.2419526.32养殖月份Culture months3月March4月April5月May6月June表2天津地区育苗场河蟹及其养殖环境中二尖梅奇酵母的检测及统计结果采集样品数Number of samples阳性样品数Number of positive samples样品阳性率/%Samples positive rate/%采样批次数Sampling batch阳性批次数Number of positive batches批次阳性率/%Batch positive rate/%种蟹Broodstockcrabs1806536.1110990种蟹养殖环境Cultureenvironmentof broodstockcrabs44100221003000002000溞状幼体、大眼幼体养殖环境Cultureenvironmentof zoaeasand megalopas1400700溞状幼体、大眼幼体Zoaeas andmegalopas样品类型Sample type亡，但严重影响经济效益。3讨论河蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的流行与河蟹养殖环境、养殖阶段、病原丰度、宿主体质等因素密切相关，本研究结果显示，发病高峰期主要集中在每年3月6月，发病个体主要为越冬后的扣蟹及种蟹。推测当春季水温升高至7 以上时，经历越冬期的河蟹开始摄食，此时若饲料投喂不足、养殖密度过高，易造成河蟹营养缺乏、相互残食，在淤泥较厚、有机质丰富、水质条件差等环境胁迫下，导致二尖梅奇酵母迅速增殖并传播，当水温升至15 20，出现发病死亡高峰，病死蟹在水体中成为新的传染源，同时使水质进一步恶化。Sun对盘锦地区河蟹感染“牛奶病”情况调查发现，8月采集的河蟹样品中可检测到二尖梅奇酵母21，这与本研究结果不同。二者调查结果的差异，推测一是天津地区稻蟹田环境不同于辽宁盘锦地区，稻田中设置有环沟或进排水渠，可为河蟹提供良好的栖息环境，降低了农药及温度变化对河蟹体质的影响；二是同一时期，不同地域水温有差别，温度不仅影响宿主的免疫力水平22-23，也影响二尖梅奇酵母的传播效力24-26。推测自然条件下，随着气温升高，河蟹摄食量增加、体质增强，环境及河蟹体内微生物菌群改变，病原酵母即使存在也无法占据优势，其生长被抑制无法致河蟹发病。实际生产中，是否可以采取升高水温及营养调控措施降低河蟹的发病率，有待进一步研究验证。本研究统计结果显示，二尖梅奇酵母仍是当前天津地区养殖中华绒螯蟹的主要流行病原，但检出率呈逐年下降趋势。每年3月6月越冬后的扣蟹、种蟹易感染致病酵母，推测由于越冬期间河蟹长期缺食，抗病力差，从水体及底泥摄食易感染病原，低温环境下蟹体内其它微生物菌群的生长受到抑制27-28，但侵入蟹体的即使少量的病原酵母仍可继续增殖成为优势菌种，春季随着气温升高，河蟹开始摄食，致病酵母的增殖也开始加快3，暂养密度高、池底淤泥较厚、有机质丰富、投饵不足的池塘，河蟹体质差，致病酵母迅速增殖，引起河蟹发病，同类互相残食也可增加交叉感染风险21。已有研究证实，养殖水体、大型溞、卤虫、病死蟹等均可传播二尖梅奇酵母，且该病原在环境胁迫或营养条件缺乏时可有性生殖，形成子囊孢子进而感染动物13,29-30。结合调查结果，推测二尖梅奇酵母可能在环境中以子囊孢子的形式存在于枝角类、卤虫体内，越冬期间被河蟹摄食后，在其体内萌发成新的酵母菌营养细胞，随蟹的血液循环进入各组织，造成全身系统性感染4，再通过被感染病死蟹释放入水体及底泥中，造成恶性循环。本研究虽然在育苗期间的种蟹及其养殖池水体和底泥中均检测到二尖梅奇酵母，但溞状幼体、大眼幼体及其养殖环境，以及后续跟踪监测的仔蟹、扣蟹中均未检出到该病原，推测二尖梅奇酵母不存在垂直传播途径。Jiang等发现，受感染种蟹的卵母细胞及其形成的受精卵、溞状幼体和大眼幼体中的二尖梅奇酵母检测均呈阴性，证实该病原不会直接从母体传播给子代31，这与本研究结果一致，提示可以通过建立无特定病原育苗种场防控河蟹“牛奶病”。水产动物致病性酵母种类及其可侵染的水产动物复杂32-33，侵染不同宿主时的传播途径也不完全相同，但均以水平传播为主13,34。前期研究发现，饲喂、浸浴、注射3种方式均可使河蟹感染二尖梅奇酵母，在适宜温度下，病原菌在河蟹体内大量增殖，导致发病，表明该病原可以通过水流及摄食等方式水平传播4。许文军等研究认为葡萄牙假丝酵母对三疣梭子蟹的感染与其免疫力及水温均有较大关系35。本研究与以上研究结果一致，二尖梅奇酵母是条件致病菌，当宿主健康状况不良或外部环境遭到破坏时，病原菌就会通过水平传播由体表创伤处及肠道侵入体内，导致机体发病或死亡。本研究对河蟹感染二尖梅奇酵母后的养殖情况分析发现，二尖梅奇酵母感染的河蟹，虽未出现大量发病或死亡，但严重影响河蟹养殖的经济效益。动物酵母性疾病的发生与病原丰度、宿主体质及养殖环境密切相关36，在环境良好的水域，河蟹天然饵料丰富、体质较好，推测即使感染致病酵母，也可能通过蜕壳，把侵入鳃及血窦内的病原作为异物排出，但该过程会消耗河蟹能量，造成河蟹生长缓慢37，其中的作用机制尚不明确。严重感染的河蟹则会发病死亡或在蜕壳过程中死亡，但因稻田中河蟹养殖密度低、病死蟹不集中不易被发现，同时稻田养殖环境良好，病原传播机率降低，充足的饵料中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1132又增强了河蟹的抵抗力，有助于河蟹抵抗病原的侵袭，因此未出现大规模发病的情况。综上所述，在实际生产中，防控“牛奶病”的关键在于以下几点：一是严格挑选扣蟹或种蟹并做好消毒工作。选择体质健壮、活力强、无伤残、规格整齐、检疫合格的蟹，并经检测不携带二尖梅奇酵母，再经碘制剂消毒后放入养殖池塘或稻田。二是改善养殖环境，控制放养密度。扣蟹暂养密度不高于25 kg/亩，越冬储养的扣蟹密度不高于800 kg/亩，种蟹越冬池密度不超过3 500只/亩；确保池塘溶解氧不低于5 mg/L，当溶氧量低于3 mg/L时，要及时换水并加注新水；养殖池底需清淤消毒，底泥厚度不超过10 cm，春季扣蟹暂养池塘建议种植水草，便于扣蟹栖息、隐蔽、生长和蜕壳，以提高成活率，减少互相的残食；养殖过程中如发现河蟹出现“牛奶病”症状，捞出水煮后掩埋，防止二尖梅奇酵母在河蟹中的传播。三是增强河蟹对二尖梅奇酵母的抵抗力。春秋季节加强营养投喂，以投喂优质全价配合饲料(蛋白含量约36%)为主，适当添加多维、多糖等免疫增强剂，提高河蟹抗病力；河蟹集中蜕壳时，在饲料中添加脱壳素等物质，促进其顺利蜕壳，提高成活率。采取以上综合性措施，可显著降低河蟹“牛奶病”的发生及传播几率。由于河蟹“牛奶病”是一个慢性发展的过程，加之蟹类自身生活习性的特殊性，当观察到明显“牛奶病”症状时，病情已进入感染后期阶段难以治疗，因此有必要开发高效准确的检测方法38-39。作为真菌类病原，目前尚无有效针对二尖梅奇酵母的治疗药物，亟需开展相关研究40-41。前期研究结果表明，本次天津地区河蟹“牛奶病”病害源于外地引进的已感染病原的扣蟹4，未来还应加强本地河蟹种质资源培育与利用，培育无特定病原的优质扣蟹。本研究为了解中华绒螯蟹“牛奶病”病原的流行规律和传播途径，并为制定该病的有效防控措施提供参考依据。参考文献：王武，李应森.河蟹生态养殖M.北京：中国农业出版社，2010.农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.2022中国渔业统计年鉴M.北京：中国农业出版社，2020.刘建男.蟹源二尖梅奇酵母生物学特性及其致病机制研究D.大连：大连海洋大学，2022.徐晓丽，罗璋，钟文慧，等.中华绒螯蟹“牛奶病”病原及其 致 病 性 研 究 J.中 国 海 洋 大 学 学 报(自 然 科 学 版)，2021，51(12)：23-32.申洪彬.中华绒螯蟹()“牛奶病”病原鉴定、组织病理及防治技术研究D.沈阳：沈阳农业大学,2020.LIU JIAN-NAN,YU JIE-YING,HE JIA-LEI,et al.Diversity ofyeast specie