绒毛用羊毛囊干细胞研究进展.pdf

宋亚丽，卢曾奎，袁超，等.绒毛用羊毛囊干细胞研究进展J.中国草食动物科学，2024，44（2）：73-76DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2024.00.009绒毛用羊毛囊干细胞研究进展宋亚丽1，卢曾奎1,2,3，袁超1,2,3，杨博辉1,2,3，刘建斌1,2,3，郭婷婷1,2,3（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州730050；2.中国农业科学院羊育种工程技术研究中心，兰州730050；3.农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，兰州730050）摘要：产毛（绒）量是绒毛用羊主要的经济性状，毛（绒）的质量和产量受毛囊发育的影响。众所周知，毛囊控制羊毛（绒）的生长，而毛囊干细胞决定着毛囊形态的发生。因此，文章从绒毛用羊毛囊干细胞的分离培养方法、鉴定、增殖与分化等方面的相关研究进展进行了综合阐述，为进一步开展毛囊生长发育的分子调控机制研究、选育绒毛性状优良的绒毛生产用羊提供参考资料。关键词：羊；羊绒；羊毛；毛囊；毛囊干细胞中图分类号：S827文献标识码：A文章编号：2095-3887（2024）02-0073-04Research Progress on Wool Follicle Stem Cells of Wool Sheep and Cashmere GoatSONG Yali1,LU Zengkui1,2,3,YUAN Chao1,2,3,YANG Bohui1,2,3,LIU Jianbin1,2,3,GUO Tingting1,2,3(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730050,China;2.Sheep Breeding Engineering Technology Research Center of Chinese Academy of AgriculturalSciences,Lanzhou 730050,China;3.Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding on Tibetan Plateau,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Lanzhou 730050,China)Abstract:Wool or cashmere production is one of the main economic traits of wool sheep or cashmere goat,and itsquality and yield are influenced by the development of hair follicles.Hair follicles control wool or cashmere growth,andhair follicle stem cells determine the morphogenesis of wool follicles.This paper reviewed the research progress ofisolation and culture methods,identification,proliferation and differentiation of follicle stem cells,in order to guide forresearch the molecular regulation mechanism of hair follicle growth,breeding sheep and goat with excellent wool/cashmere characteristics.Keywords:sheep or goat;cashmere;wool;hair follicle;hair follicle stem cells羊绒、羊毛与人们的日常生活息息相关。众所周知，羊毛（绒）与皮肤毛囊形态的发生密切相关，毛囊性状直接影响羊毛的产量和品质。毛囊（Hair follicle，HF）是哺乳动物最大的器官之一，其独特而复杂的发生发育机制控制着毛（绒）的生长。毛囊的生长发育涉及多种生理过程，包括细胞生长、间充质细胞与上皮细胞的相互作用、上皮细胞的分化和激素调节分泌等。毛囊主要由毛乳头（Dermal papilla）、内毛根鞘（IRS）和外毛根鞘（ORS）组成。依据毛囊形态发生时间及特征，分为初级毛囊（Primary follicles，PF）和次级毛囊（Secondary follicles，SF）。初级毛囊产生有髓粗毛，次级毛囊产生细毛1。毛囊具有周期循环的特点，随季节变化反复经历生长期（Anagen）、退行期（Catagen）和休止期（Telogen）3个阶段。研究发现，毛囊的发育起始于毛囊干细胞（Hair follicle stem cells，HFSCs）的活化，而HFSCs起源于毛囊的隆突部，具有分化成多种细胞的潜能。体外研究表明，毛囊干细胞具有很高的克隆能力和良好的再生潜能2，可以分化成神经细胞、平收稿日期：2023-09-14基金项目：甘肃省自然科学基金（21JR7RA028）；国家现代农业产业技术体系（CARS-39-02）；中国农业科学院科技创新工程（25-LZIHPS-07）作者简介：宋亚丽（1997-），女，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖通信作者：郭婷婷（1984-），女，副研究员，博士，研究方向为绵羊育种技术与方法-732024年第44卷第2期中国草食动物科学Vol.44 No.2 2024China Herbivore Science滑肌细胞、上皮细胞、皮脂腺、汗腺、毛囊和表皮等3-4。研究影响羊HFSCs增殖和凋亡的有关因子和具体作用机制，可以为提高羊毛生产和市场经济效益作出重要贡献。为此，本文对绒毛用羊的毛囊干细胞研究进展作一综述，以期为深入开展毛囊生长发育的分子调控机制研究提供参考。1毛囊干细胞的分离培养绒毛用羊毛囊干细胞的分离培养借鉴医学上的方法，目前常采用显微操作法、酶消化法以及两种方法相结合的方法。1986年，Withers等成功实现了绵羊毛囊真皮乳头细胞的分离培养。1994年，Bond采用显微操作技术，从美利奴羊皮肤中成功分离获得毛囊，并将其置于Williams 培养基E中培养，毛囊维持完整的形态可长达 7 d，表明细毛羊毛囊在体外分离培养获得成功。在细毛羊上，郭婷婷等5采用两步酶消化法、机械分离法和两步酶消化法+机械分离法分别对细毛羊的毛囊干细胞进行了分离培养，并通过测定其数量、克隆形成率及增殖能力等对种培养方法进行综合评估，发现两步酶消化法+机械分离法获得毛囊干细胞体外培养的效果最优。Mengqi等6采用立体显微镜从敖汉细毛羊组织中解剖到毛囊，将其放至含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中37培养，可获得敖汉细毛羊的毛囊干细胞。Quan等7在构建大鼠毛囊干细胞系时，用中性蛋白酶和型胶原酶消化后切取毛囊隆凸区培养，结果表明，利用型胶原酶吸附后可获得纯化后的毛囊干细胞，此方法培养获得的毛囊干细胞活力和增殖能力较强，吸附能力和集落形成能力均较好，说明毛囊干细胞可作为皮肤毛囊等组织工程的细胞源。Zhu等8通过显微操作技术分离了内蒙古绒山羊的初级毛囊与次级毛囊，采用型胶原酶消化后机械剥离获得真皮乳头并进行了培养，发现真皮乳头细胞均在培养第 21 天时达到最大密度。Lin等9使用杜氏改良培养基连续培养真皮乳头细胞并传代，发现培养后的真皮乳头细胞数量明显增加，形成的聚集区和细胞团形似完整毛囊，培养至6代时培养的真皮乳头细胞变大并失去了聚集行为和分化能力。乃门塔娜10研究发现，通过组织贴壁法和IV型胶原快速贴壁法均可获得较高纯度的阿尔巴斯绒山羊的毛囊干细胞。闫海龙11研究发现，在基础培养基中添加生长因子、EGF、氢化可的松和胰岛素，可成功分离和培养绒山羊的毛囊干细胞。2毛囊干细胞的鉴定毛囊干细胞的鉴定包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。研究发现，绒毛用羊的毛囊干细胞具有最典型的皮肤干细胞形态特征，呈鹅卵石样铺路生长，立体形态聚集似巢，细胞较小，细胞核圆而集中，有2个以上的核仁，细胞核质较大，核质比高。毛囊干细胞标记物可用于HFSCs的分离和鉴定。常用的鉴定标记分子有Krt15、Krt19、CD200、CD34、IGF1 和 EpCAM/Ber-EP4等。郭婷婷等5研究证实，细毛羊中Krt19和IGF1呈阳性表达。在陕北白绒山羊中，CD34、ITG1、Krt15均呈细胞阳性表达11-12。在阿尔巴斯绒山羊中，Krt14、Krt15、Krt19、CD34和IGF1均呈阳性表达10，13。李东江等14研究发现，在云南半细毛羊中 CK14、CK19 和IGF1 表现为阳性，同时，在成纤维细胞中检测到CK19和IGF1呈阳性，因此，认为CK14可以作为鉴定云南半细毛羊毛囊干细胞的表面标记物之一。3毛囊干细胞的增殖与分化毛囊干细胞受多种细胞来源的调控，最显著的是位于毛芽下方的真皮乳头间充质细胞，其他潜在的微环境细胞包括毛囊终分化上皮细胞、脂肪细胞和神经纤维等。毛囊的生长经历生长期、退化期和休眠期3个阶段，并不断循环。当毛芽中被激活的毛囊干细胞接收到可能来自毛乳头细胞的增殖信号，并分化为过渡性放大细胞时，生长期就开始了。过渡性放大细胞形成一种基质结构，并最终产生构成毛囊的分化细胞15。Greco等16认为，毛芽毛囊干细胞首先通过增殖促进毛囊再生，而隆突部毛囊干细胞则相对滞后。毛芽细胞在毛囊发育后期开始增殖，并导致基质的形成。隆突部毛囊干细胞在发育后期和之间增殖，在后期V时处于静止。毛囊干细胞增殖过程中，受多种体内因素的干扰，其中 Sonic Hedgehog（SHH）信号通路上调了隆突部毛囊干细胞的活性。Demetrios等17研究发现，过渡性放大细胞独特地分泌SHH，进而激活了毛囊干细胞长期再生所需的静态隆突部毛囊干细胞。毛芽中的毛囊干细胞被启动后，对毛乳头信号作出反应并开始产生过渡性放大细胞，向位于隆突部静息的毛囊干细胞发出信号并激活，从而促使毛乳头细胞产生Noggin 和Fgf7，专向分化成再生毛囊的鳞片层、皮质层、髓质层、鞘小皮、赫胥黎氏层、利氏层18-20和伴侣层21。隆突内毛囊干细胞被激活后，增殖分化为再生毛囊的外根鞘，旧隆突保存的毛囊干细胞不再参与新一轮的毛囊再生循环19。为获得大量毛囊干细胞，并使其能够长期传代、快速生长和维持干细胞，在干细胞培养过程中添加表皮生长因子（EGF），可促进毛囊细胞的增殖22-23。闫海龙11研究发现，将陕-74宋亚丽，卢曾奎，袁超，等.绒毛用羊毛囊干细胞研究进展J.中国草食动物科学，2024，44（2）：73-76北白绒山羊的毛囊干细胞与毛乳头细胞（DPCs）共培养可诱导毛囊干细胞的分化。毛乳头细毛来源的外泌体（DPC-Exos）通过参与细胞信号转导、脂肪酸表达调控和细胞通讯基因调控毛囊干细胞的增殖和分化。毛囊干细胞原代细胞培养中的一个主要挑战是实现细胞的高效生长，同时保持干性，以实现高产量。目前，几种相关支持干细胞的增殖和/或干细胞的维持的生长因子已经被发现。Rho 相关蛋白激酶抑制剂 Y-27632、白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和维生素C都被证明可支持干细胞的增殖和/或干细胞的维持。Y-27632是Rho激酶（ROCK）的特异性抑制剂，在调节细胞生长和分化方面发挥关键作用，如维持干细胞的分化潜能，参与调节神经节细胞生长周期、细胞黏附、外分泌、迁移等活动24-25。Yan等26在陕北白绒山羊上研究发现，Y-27632和bFGF相结合可为毛囊干细胞提供最佳的体外培养条件。许甜甜等27研究发现，陕北白绒山羊毛囊诱导期（E66）和分化期（E120）皮肤组织差异表达基因Foxq1能够激活Wnt/-catenin信号通路，从而促进HFSCs的增殖。王蒙28通过构建Foxq1腺病毒过表达体系并成功浸染毛囊干细胞后其活力显著增强，说明过表达能够显著促进抗氧化应激基因GSR和SOD2的表达，抑制凋亡相关基因 BCL2的表达。Ito29研究发现，毛囊干细胞静止时糖酵解是毛囊干细胞的主要代谢方式，而生长期糖酵解产生的能量已经不足以供应毛囊干细胞活动，主要由其他代谢途径供能，这一结果在绒山羊中也得到了证实30。冯云奎等31在长江三角洲白山羊优质毛性状的分子形成机制研究中发现，miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1，上调MAP3K1表达水平，进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡。张卫东12研究发现，Lnc552能够促进BMP2下游关键蛋白 SMAD1磷酸化，并影响下游分化相关基因 RUNX2的表达。Lnc552能够显著抑制绒山羊毛囊干细胞的聚集，影响其细胞周期，抑制细胞增殖。Lnc552显著抑制毛囊干细胞中多能性标记蛋白 NANOG、OCT4、KRT15 的表达，并通过提高脂肪形成蛋白 PPAR 及ADIPOQ的表达来促进绒山羊HFSCs向脂肪细胞的分化。同时发现褪黑素能够削弱 Lnc552对绒山羊 HFSCs的诱导分化。Rahman等32研究发现，生长信号转导蛋白激酶的编码蛋白Raf主要调节MAPK/Erk1/2信号通路，进而影响毛囊干细胞的分裂、分化和凋亡。于梦琪等33在敖汉细毛羊中发现，干扰B-Raf基因表达可显著抑制毛囊干细胞增殖并促进其凋亡，并推测可能是通过MAPK/Erk1/2通路进行的。张宁宁34利用褪黑素刺激内蒙古白绒山羊的毛囊干细胞，结果发现毛囊干细胞中Notch信号通路起分化作用的主效受体为MTLR2。4结语羊毛（绒）由绒毛用羊毛囊产生，而毛囊干细胞决定着毛囊的命运。毛囊干细胞的分离培养和条件优化为研究毛囊生物学提供了重要的研究模型。深入开展绒毛用羊毛囊的形态发生及毛囊干细胞的增殖分化研究对于揭示羊毛（绒）发生的分子遗传学机制具有重要意义。毛囊干细胞也已经成为例如基因编辑等功能研究必不可少的工具细胞之一。但既要扩大毛囊干细胞数量，同时保持毛囊干细胞的干性，是非模式动物中分离培养并建立毛囊干细胞系的主要障碍之一，需要以后进一步深入研究。参考文献1 ROGERS G E.Biology of the wool follicle：an excursion into a uniquetissue interaction system waiting to be re-discovered J.Exp Dermatol，2006，15（12）：931-949.2 ROCHAT A，KOBAYASHI K，BARRANDON Y.Location of stemcells of human hair follicles by clonal analysisJ.Cell，1994，76：1063-1073.3 TAYLOR G，LEHRER M S，JENSEN P J，et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermisJ.Cell，2000，102：451-461.4 YU H，FANG D，KUMAR S M，et al.Isolation of a novel populationof multipotent adult stem cells from human hair follicles J.AmericanJournal of Pathology，2006，168（6）：1879-1888.5 郭婷婷，张世栋，牛春娥，等.细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究 J.中国畜牧兽医，2013，40（7）：148-152.6 YU M，LI L，LIU M，et al.miR-27a targeting PIK3R3 regulates theproliferation and apoptosis of sheep hair follicle stem cells J.Animals（Basel），2023，13：1-15.7 QUAN R，ZHANG X，NI Y，et al.Culture and characterization of rathair follicle stem cells J.Cytotechnology，2016，68（4）：621-628.8 ZHU B，XU T，YUAN J L，et al.Transcriptome sequencing revealsdifferences between primary and secondary hair follicle-derived dermal papilla cells of the cashmere goat（Capra hircus）J.PLoS One，2013，8（9）：e76282.9 LIN C M，LIU Y，HUANG K，et al.Long noncoding RNA expressionin dermal papilla cells contributes to hairy gene regulationJ.Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，453（3）：508-514.10乃门塔娜.阿尔巴斯绒山羊毛囊干细胞的分离鉴定及转录因子Sox9对其作用机理的研究 D.呼和浩特：内蒙古大学，2016.-752024年第44卷第2期中国草食动物科学Vol.44 No.2 2024China Herbivore Science11闫海龙.陕北白绒山羊毛囊干细胞增殖分化相关miRNA的鉴定及功能研究 D.杨凌：西北农林科技大学，2019.12张卫东.褪黑素和lnc552调控绒山羊毛囊干细胞增殖和分化的研究 D.杨凌：西北农林科技大学，2022.13HE N，DONG Z G，TAO L，et al.Isolation and characterization ofhair follicle stem cells from Arbas Cashmere goat J.Cytotechnology，2016，68（6）：2579-2588.14李东江，权国波，杨红远，等.云南半细毛羊毛囊干细胞表面标记物的鉴定 J.中国草食动物科学，2014，34（1）：5-7.15SOLANAS G，BENITAH S A.Regenerating the skin：a task for theheterogeneous stem cell pool and surrounding niche J.Nat Rev MolCell Biol，2013，14（11）：737-748.16GRECO V，CHEN T，RENDL M，et al.A two-step mechanism forstem cell activation during hair regenerationJ.Cell Stem Cell，2009，4（2）：155-169.17DEMETRIOS K，DAVID T S.Tic-TACs：refreshing hair growth J.Cell，2014，157（4）：769-770.18JOOST S，ANNUSVER K，JACOB T，et al.The molecular anatomy ofmouse skin during hair growth and rest J.Cell Stem Cell，2020，26（3）：441-457.19HSU Y C，LI L，FUCHS E.Transit-amplifying cells orchestrate stemcell activity and tissue regenerationJ.Cell，2014，157（4）：935-949.20YANG H，ADAM R C，GE Y，et al.Epithelial-mesenchymal micro-niches govern stem cell lineage choicesJ.Cell，2017，169（3）：483-496.21VENIAMINOVA N A，VAGNOZZI A N，KOPINKE D，et al.Keratin79 identifies a novel population of migratory epithelial cells that initiates hair canal morphogenesis and regeneration J.Development，2013，140（24）：4870-4880.22MAK K K L，CHAN S Y.Epidermal growth factor as a biologic switchin hair growth cycle J.Journal of Biological Chemistry，2003，278（28）：26120-26126.23BAI T T，LIU F L，ZOU F，et al.Epidermal growth factor inducesproliferation of hair follicle-derived Mesenchymal stem cells throughepidermal growth factor receptor-mediated activation of ERK andAKT signaling pathways associated with upregulation of cyclin D1 andDownregulation of p16J.Stem Cells and Development，2017，26（2）：113-122.24JI Y T，CHEN D Y，JIANG S L，et al.Effect of fasudil hydrochlorideon the post-thaw viability of cryopreserved porcine adipose-derivedstem cells J.Cryo Letters，2014，35（5）：356-360.25NAKAMURA K，YOSHIMURA A，KANEKO T，et al.ROCK inhibitor Y-27632 maintains the proliferation of confluent human mesenchymal stem cells J.J Periodontal Res，2014，49（3）：363-370.26LI Y，JIN M H，GAO Y W，et al.Efficient establishment of an optimized culture condition for cashmere goat primary hair follicle stemcells J.Journal of Animal Science，2023，101：1-9.27许甜甜，张彤彤，王蒙，等.转录因子Foxq1通过WNT/-catenin信号通路影响绒山羊毛囊干细胞增殖的研究 J.畜牧兽医学报，2023，54（6）：2653-2661.28王蒙.转录因子Foxq1在绒山羊毛囊干细胞中的功能及其调控机制研究 D.杨凌：西北农林科技大学，2023.29ITO K.Metabolism and the control of cell fate decisions and stem cellrenewal J.Annu Rev Cell Dev Biol，2016，32：399-409.30王笑冰.绒山羊毛囊干细胞周期性发育机制的蛋白质组学分析D.呼和浩特：内蒙古农业大学，2023.31冯云奎，王健，马金亮，等.miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响 J.中国农业科学，2021，54（23）：5132-5143.32RAHMAN M A，SALAJEGHEH A，SMITH R A，et al.B-Raf mutation：a key player in molecular biology of cancer J.Exp Mol Pathol，2013，95（3）：336-342.33于梦琪，李兰兰，吕长慧，等.干扰B-Raf基因对绵羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响 J.中国畜牧杂志，2023，59（12）：155-161.34张宁宁.褪黑素刺激对内蒙古白绒山羊毛囊干细胞Notch信号通路相关基因表达的影响 D.呼和浩特：内蒙古农业大学，2017.-76