牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202210025牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究梁秋韵，孟祥苗，杨可，黄蓓，宋厚辉*，杨杨*(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江 杭州311300)摘要：为探究与人受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌()Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制，本研究通过PCR从DNA中扩增基因片段后构建重组质粒pMN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后，利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中，并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示，重组菌株中出现约55 ku的特异性条带，表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS_ Mb0869c。将MS_Mb0869c株和对照菌株MS_Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1)，通过PI和Annexin/FITC染色，经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，结果显示，MS_Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS_Vec感染组，这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于pLVX-IRES-Puro-3伊Flag中，构建的重组质粒经测序鉴定正确后，转染HEK293T细胞中，利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显示，构建的HEK293T细胞中出现约55 ku的特异性条带，且随着细胞传代次数的增加，蛋白表达量未减少，这表明稳定表达Mb0869c的细胞系HEK293T/Mb0869c正确构建。利用不同浓度的肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)和IAP抑制剂(SM164)作用于HEK293T细胞，通过检测细胞内ATP的含量确定细胞凋亡发生情况。结果显示，100 ng/mLTNF-琢和25 nmol/L SM164在作用细胞24 h后，诱导细胞凋亡的效果最佳。以该浓度分别作用于HEK293T/Mb0869c和对照组HEK293T/Con细胞24 h后，统计细胞的存活率。结果显示前者的存活率极显著高于后者(0.01)，表明Mb0869c能够抑制细胞凋亡。通过PCR扩增人RIPK1的3个结构域片段，并分别克隆至pCMV-Myc中构建真核表达重组质粒并经菌落PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T/Mb0869c细胞，通过免疫共沉淀法(Co-IP)检测RIPK1结构域与Mb0869c的互作。结果显示Mb0869c和RIPK1的激酶结构域(KD)和中间结构域(ID)存在相互作用。上述结果表明，Mb0869c蛋白在抑制细胞凋亡中具有重要的作用，且这种抑制作用是通过RIPK1实现的。本研究为蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡作用机制的研究提供实验依据。关键词：牛分枝杆菌；细胞凋亡；Mb0869c；受体相互作用蛋白激酶1中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0729-08Study onMb0869c inhibitingexogenous apoptosisLIANG Qiu-yun,MENG Xiang-miao,YANG Ke,HUANG Bei,SONG Hou-hui*,YANG Yang*(Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province,Zhejiang Provincial EngineeringResearch Center for Animal Health Diagnostics&Advanced Technology,Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base forVeterinary Medicine and Health Management,China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics,College of AnimalScience and Technology&College of Veterinary Medicine,Hangzhou 311300,China)收稿日期：2022-10-31基金项目：国家自然科学基金资助项目(32272951)；浙江省自然科学基金资助项目(LY21C180001)；浙江省属高校基本科研业务费(2020YQ008)作者简介：梁秋韵(1995-)，女，江苏扬州人，硕士研究生，主要从事兽医公共卫生学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorAbstract:To investigate the mechanism of apoptosis induced by a protein fromthat interacts withreceptor-interacting protein kinase 1(RIPK1),Mb0869c fragment was amplified fromgenomic DNA usingPCR and recombinant plasmid pMN437-Mb0869c was constructed.Subsequently,recombinant plasmids were electrotransformedintoto generate recombinant bacteria expressing Mb0869c protein,and the presence of 55ku specificband was verified by western blot,showing that the recombinant bacteria MS_Mb0869c was successfully constructed.Afterward,THP-1 cells were infected with MS_Mb0869c and control strain MS_Vec,respectively,and the apoptosis was analyzed withAnnexin V/FITC/PI staining flow cytometry.The results showed that the apoptosis rate of MS_Mb0869c infected cells wassignificantly lower than that of MS_Vec infected cells,indicating that Mb0869c could inhibit cell apoptosis induced by.Further,the obtained Mb0869c fragment was inserted into pLVX-IRES-Puro-3伊Flag and transfectedinto HEK293T cells after sequencing verification.The stable cell line expressing Mb0869c was obtained by puromycin selectionand confirmed by western blot analysis.Of note,the expression of Mb0869c in HEK293T did not decrease as cell passageincreased,indicating that a stable cell line expressing Mb0869c,HEK293T/Mb0869c,was successfully constructed.HEK293T cellswere treated with different concentrations of tumor necrosis factor-琢(TNF-琢)and IAP inhibitor(SM164),and the apoptosis wasdetermined by measuring the content of intracellular ATP.This result showed that 100 ng/mL of TNF-琢and 25 nmol/L of SM164had the best effect on inducing cell apoptosis 24 hours after treatment with HEK293T/Mb0869c and HEK293T/Con by measuringcell viability.The cell survival rate of the former was significantly higher than that of the latter,indicating that Mb0869c indeedsuppressed cell apoptosis.Furthermore,three domain fragments of human RIPK1 were amplified by PCR,inserted into thepCMV-Myc plasmid to construct recombinant eukaryotic expression plasmids,and transfected into HEK293T/Mb0869c cells aftercolony PCR and sequencing verification.The interaction between the RIPK1 domain and Mb0869c was detected byCo-immunoprecipitation analysis,and the results validated that Mb0869c interacted with the RIPK1 kinase domain(KD)andintermediate domain(ID).The above results showed that the Mb0869c protein is essential in inhibiting apoptosis by,and RIPK1 achieves this inhibition.This study provides a crucial experimental basis for the mechanism ofprotein regulating cell apoptosis through RIPK1.Key words:;apoptosis;Mb0869c;RIPK1牛分枝杆菌(，)是一种重要的人兽共患病原菌，可引发牛结核病，造成养牛业的经济损失，同时也严重影响人类健康和食品安全1。巨噬细胞是感染的主要宿主细胞，感染后巨噬细胞处于抵抗分枝杆菌免疫反应的最前沿，可以促进免疫细胞从外周血募集到被感染区域，在早期起到清除或阻止病原体的作用2。细胞凋亡是宿主通过细胞凋亡小体隔离细菌和诱导机体适应性免疫反应限制病原感染的一种策略。分枝杆菌可以通过自身进化的一系列逃逸机制延缓细胞凋亡或促进其坏死，以促进其的复制和传播3-5。有研究表明，对细胞凋亡的抑制作用主要与TNF-琢诱导的信号通路有关，但对肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)信号通路的具体调控机制并不清楚6。TNF是一种促炎细胞因子，对组织稳态的协调至关重要。受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TNF receptor associat-ed death domain，TRADD)是TNF信号转导的主要参与者。然而，关于这两种分子对于细胞存活或凋亡控制功能的研究一直存在争议7。本研究室前期研究利用酵母双杂交系统筛选出了与人受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)互作的蛋白Mb0869c、Mb0383c和Mb23148，其中Mb0869c经序列比对，发现其与结核分枝杆菌Rv0846c有高达99.8%的同源性9。因此，本实验以耻垢分枝杆菌(，MS)为模式菌，构建了过表达Mb0869c的重组菌株，探究了Mb0869c对MS诱导的细胞凋亡的影响。通过TNF-琢和IAP抑制剂(SM164)，在HEK293T细胞中构建细胞凋亡模型，探究了Mb0869c对细胞存活的影响。此外，本实验还进一步明确了Mb0869c与RIPK1结构域的互作关系。这为进一步研究相关蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年730表1引物序列引物名称Primer namepLVX-Mb0869c-FpLVX-Mb0869c-RMyc-RIPK1-KD-FMyc-RIPK1-KD-RMyc-RIPK1-ID-FMyc-RIPK1-ID-RMyc-RIPK1-DD-FMyc-RIPK1-DD-RpMN437-HA-Mb0869c-FpMN437-HA-Mb0869c-R引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)ATCAACGGGGAACCCCACAGCACGACCAATCCCAGTGGATTGGTCGTGCTGTGGGGTTCCCCGTTGATTGCCGGAATTCGCATGCAACCAGACATGTCCTTGAATGCGGGGTACCTCATAAATAAAAAGGCCTAAATTTTTCTTCAATGCCAGGCCGGAATTCGCTTAAGTCAATTAGAAGAAAGTGTATAAGAGGACGCGGGGTACCTCACAGACTAGTGGTATTATCAAAGATAGCTTGGTACTCCGGAATTCGCACGGATAAACACCTGGACCCAACGGGGTACCTTAGTTCTGGCTGACGTAAATCAAGCTAAGGAGGTTAATAATGCCCGAGCTGGGGCGTAGTCCGGCACGTCGTCA1材料与方法1.1菌株、质粒及细胞株大肠杆菌DH5琢感受态细胞、MS mc2115、pLVX-IRES-Puro-3伊Flag(之后简写为pLVX)、pCMV-Myc真核表达载体、pMN437原核表达载体、含有RIPK1全长基因片段的真核表达重组质粒(pCMV-Myc-RIPK1-FL)、人胚胎肾细胞293T(HEK293T)和人单核巨噬细胞(THP-1)均由本实验室保存。1.2主要试剂2伊Phanta Max Master Mix、蛋白Marker和DNA Marker均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Golden View核酸染料、质粒小提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自上海惠凌生物技术有限公司；Ligation high Ver.2购自TOYOBO公司；Lipofectamine2000转染试剂、胎牛血清和嘌呤霉素购自ThermoFisher公司；限制性内切酶I、d、R I、I、I均购自NEB公司；兔源HA-Tag单克隆抗体(MAb)购自CST公司；PMA、TNF-琢、IAP抑制剂(SM164)、兔源抗GAPDH MAb和兔源抗Myc MAb均 购 自Sigma公 司；pMS2购 自 优 宝 生 物 公 司；CellTiter-GloR2.0 Cell Viability Assay购自Promega公司；鼠源抗Flag MAb购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP标记的鼠抗兔IgG(IgG-HRP)抗体和羊抗鼠IgG-HRP购自JACKSON公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；兔源GroEL抗体由本实验室自制。1.3引物的设计与合成根据NCBI登录的基因序列(NC_002945.3)及人RIPK1基因序列(8737)，利用SnapGene设计特异性引物(表1)。引物均由浙江擎科生物技术有限公司合成。1.4重组菌株MS_Mb0869c的构建及鉴定以提取的基因组DNA为模板，利用pMN437-HA-Mb0869c-F/R引物经PCR扩增基因并克隆至经I/d双酶切后的pMN437载体中，构建重组原核表达质粒pMN437-Mb0869c，并经菌落PCR和测序鉴定。将pMN437-Mb0869c电转至MS感受态细胞中，同时将pMS2电转进MS感受态细胞中，作为阴性对照。获得的重组菌经超声破碎后，分别以兔源HA-Tag MAb(1颐1 000)和兔源GroEL(1颐1 000)为一抗，鼠抗兔IgG-HRP(1颐20 000)为二抗，经western blot鉴定重组蛋白的表达。挑取单菌落于37、200 r/min培养至OD600nm值为0.60.8，收集菌体沉淀，阳性重组 菌 即 为 过 表 达Mb0869c的 重 组MS，命 名 为MS_Mb0869c，对照菌株命名为MS_Vec。1.5Mb0869c对MS诱导的细胞凋亡影响的检测将THP-1细胞以7伊105个/mL铺于12孔细胞培养板中，用100 ng/mL的PMA刺激24 h后，更换成新鲜培养基继续培养24 h，使THP-1细胞分化成巨噬细胞。分别用MS_Mb0869c和MS_Vec按照MOI 10感染THP-1细胞，4 h后加入含有200滋g/mL庆大霉素的培养基，以杀死细胞外的细菌；2 h后，弃上清，加入含50滋g/mL庆大霉素的培养基，此时时间记为T0；24 h后弃掉细胞上清，用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用4预冷的PBS重悬细胞，再次离心后弃上清并用1伊Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1伊106个/mL；取100滋L的细胞悬液于1.5 mL的离心管中，加入5滋L AnnexinV/FITC混匀后于室温避光孵育5 min；加入5滋L PI及400滋L PBS，立刻使用BD流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。UR与LR象限百分比之和为各组细胞的凋亡率。1.6稳定表达Mb0869c的HEK293T细胞系的构建及鉴 定以基 因 组DNA为 模 板，以pLVX-Mb0869c-F/R为引物经PCR扩增基因并克隆至经R I/I双酶切后的pLVX载体中，构建重组真核表达质粒pLVX-Mb0869c，并经菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒pLVX-Mb0869c转染6孔板中密度达梁秋韵，等.牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究第7期73170%80%的HEK293T细胞中，将空质粒pLVX转染的HEK293T细胞作为阴性对照，同时设HEK293T细胞为空白对照。24 h后加入浓度为1滋g/mL的嘌呤霉素筛选，待空白对照细胞被杀死后，将嘌呤霉素的终浓度减半，将存活的阳性克隆扩大培养、传至p12代、冻存。取p2、p4、p8、p12代的细胞利用细胞裂解液裂解细胞获得其总蛋白，分别以鼠源Flag MAb(1颐1 000)和兔源GAPDH MAb(1颐1 000)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1颐20 000)和鼠抗兔IgG-HRP(1颐20 000)为二抗，通过western blot检测细胞中Mb0869c蛋白表达情况。并将所获得的细 胞株 分别 命名 为HEK293T/Mb0869c和HEK293T/Con。1.7诱导HEK293T细胞凋亡的最适药物浓度与作用时间的筛选利用TNF-琢刺激细胞并作用于细胞膜表面的TNF受体，可以诱导宿主发生Caspase-8介导的外源性细胞凋亡10，通过与IAP抑制剂(SM164)共同作用于HEK293T细胞中建立细胞凋亡的模型。将HEK293T细胞以5伊105个/mL铺于96孔板中，待细胞密度达70%80%，利用不同浓度的TNF-琢和SM164共同作用细胞，设置一组空白对照和6组不同药物浓度的实验组，实验组分别为组1：20 ng/mL TNF-琢+25 nmol/L SM164；组2：20 ng/mL TNF-琢+50 nmol/LSM164；组3：20 ng/mL TNF-琢+100 nmol/L SM164；组4：100 ng/mL TNF-琢+25 nmol/L SM164；组5：100 ng/mL TNF-琢+50 nmol/L SM164；组6：100 ng/mLTNF-琢+100 nmol/L SM164；分别在375%CO2作用12 h和24 h后在每孔中加入与细胞培养基等体积的CellTiter-GloR2.0 Cell Viability Assay试剂盒中的Reagent试剂，置于微孔板摇床震荡2 min，以诱导细胞裂解，将细胞板置于室温孵育10 min，以稳定化学发光信号(CellTiter-GloR2.0 Cell Viability Assay依靠专利的耐热荧光素酶的特性，可产生稳定的“辉光型”发光信号，此信号与ATP存在量呈正比)，将细胞样品转移至不透光的96孔板中，利用酶标仪检测化学发光读数，通过公式(实验组的化学发光读数/对照组化学发光读数的平均值)伊100%以计算细胞存活率。1.8Mb0869c对TNF-琢诱导细胞凋亡影响的检测将构建的HEK293T/Mb0869c细胞和HEK293T/Con细胞以5伊105个/mL的密度铺于96孔板中，待细胞密度达70%80%，利用上述1.7中筛选出的最佳药物浓度与作用时间对细胞处理，利用CellTiter-GloR2.0Cell Viability Assay试剂盒检测细胞的ATP水平，通过1.7的公式计算细胞的存活率，具体步骤参考1.7。1.9Mb0869c 与 RIPK1 3 个 结 构 域 相 互 作 用 的Co-IP试验检测RIPK1包含3个结构域，分别为N端激酶结构域(Kinase domain，KD)、中间结构域(In-termediate domain，ID)和C端死亡结构域(Death do-main，DD)11。利用PCR分别扩增RIPK1 3个结构域的基因片段，并分别克隆至pCMV-Myc载体中，构建真核表达质粒pCMV-Myc-RIPK1-KD、pCMV-Myc-RIPK1-ID及pCMV-Myc-RIPK1-DD，并经菌落PCR及测序鉴定。将真核表达质粒pCMV-Myc-RIPK1-KD、pCMV-Myc-RIPK1-ID及pCMV-Myc-RIPK1-DD分 别 转 染HEK293T/Mb0869c细 胞 中，同 时 设pCMV-Myc-RIPK1-FL转染的HEK293T/Mb0869c细胞为阳性对照，设pCMV-Myc空载体转染的HEK293T/Mb0869c细胞作为阴性对照。转染24 h后，加入300滋L细胞裂解液裂解细胞，离心后，收取上清液，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取60滋L加入4伊loadingbuffer，煮沸5 min作为Input样品；加入结合Flag抗体的protein G磁珠，4翻转孵育过夜，用PBS缓冲液洗5次后，加入1伊loading buffer煮沸5 min，作为IP样品。两份处理后的样品经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后分别以鼠源Flag MAb(1颐1 000)、兔源MycMAb(1颐1 000)和兔源GAPDH MAb(1颐1 000)为一抗，以鼠抗兔IgG-HRP MAb(1颐20 000)和羊抗鼠IgG-HRP(1颐20 000)为二抗，通过western blot检测Mb0869c与RIPK1 3个结构域的互作情况。2结果2.1重组菌MS_Mb0869c的构建及鉴定结果对构建的重组质粒经菌落PCR鉴定，结果显示，获得1 512 bp的目的条带，与预期一致(图1A)。测序结果显示，重组质粒中基因序列与已登录的该基因序列完全相同，表明重组质粒pMN437-Mb0869c正确构建；分别将pMN437-Mb0869c和pMS2电转化MS中获得的重组菌经超声仪破裂菌体后提取蛋白样品，经western blot检测，结果显示，出现53.8 ku的特异性条带，而对照菌株未出现该条带(图1B)。表明Mb0869c可在MS中表达，过表达Mb0869c的重组MS_Mb0869c正确构建，对照菌株命名为MS_Vec。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年732M：DL2000 DNA Marker；1：重组质粒pLVX-Mb0869cM:DL2000 DNA Marker;1:Recombinant plasmicl pLVX-Mb0869c图3重组质粒pLVX-Mb0869c的PCR(A)及HEK293T/Mb0869c细胞系的western blot(B)鉴定结果HEK293T/Mb0869c2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpFlagGAPDH35ku55kup12p8p4p2M1AB梁秋韵，等.牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究第7期733M：DL2000 DNA Marker；12：重组质粒pMN437-Mb0869cM:DL2000 DNA Marker;1-2:pMN437-Mb0869c图1pMN437-Mb0869c重组质粒的PCR鉴定(A)及Mb0869c在MS中表达的western blot鉴定结果(B)2000bp1000bp750bp500bp250bp55ku35kuHAGroELM12AB*:0.05,*:0.01,*:0.001,the same as below.A、B：MS_Vec和MS_Mb0869c感染THP-1细胞后流式细胞术检测细胞凋亡；C：细胞凋亡数据统计分析A,B:Flow cytometry detects apoptosis distribution of THP-1 cells infected with MS_Vec and MS_Mb0869c;C:Statistical analysis of apoptosis data.图2流式细胞术检测Mb0869c对细胞凋亡的影响FITC-AFITC-AMS_VecMS_Mb0869cMS_Mb0869cMS_VecABCUR23.64UL3.67UL2.20UR27.21105LR30.35LR12.101041031020LL40.2410510410310201051041031020LL60.59105104103102060402002.2Mb0869c对MS诱导细胞凋亡影响的检测结果分 别 利 用MS_Mb0869c和MS_Vec以MOI 10感 染THP-1细胞，感染24 h后，采用PI和Annexin V/FITC对细胞染色，并通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果显示，MS_Vec感染细胞后，细胞的凋亡率达到57.56%(图2A)，而MS_Mb0869c感染后细胞凋亡率降至35.74%(图2B)；利用Graphpad Prism做统计 学 分 析 发 现：与MS_Vec感 染 的 细 胞 组 相 比，MS_Mb0869c感染的THP-1细胞凋亡率显著减少(图2C)(0.01)，表明Mb0869c可以抑制MS诱发的细胞凋亡。VecMb0869c2.3稳定表达Mb0869c的HEK293T细胞系的构建及鉴定结果为探究Mb0869c对MS诱发细胞凋亡的抑制作用是依赖于其自身，还是依赖于菌体其它蛋白，本研究通过PCR扩增基因片段并克隆至pLVX载体中，构建重组质粒pLVX-Mb0869c，并经菌落PCR鉴定。结果显示，获得1 599 bp的目的条带，与预期一致(图3A)。测序结果显示，重组质粒中基因序列与已登录的该基因序列完全相同，表明重组质粒pLVX-Mb0869c正确构建；将重组质 粒pLVX-Mb0869c与 对 照 质 粒pLVX分 别 转 染HEK293T细胞中，利用嘌呤霉素筛选。获得的细胞传至p12代，分别收取p2代、p4代、p8代和p12代细胞样品，提取细胞总蛋白，通过western blot检测Mb0869c的 表 达 情 况。结 果 显 示，筛 选 获 得 的HEK293T/Mb0869c细胞经传12代后，细胞中均可检出55 ku的特异性条带，而获得的对照细胞HEK293T/Con中则无相应的条带(图3B)。表明稳定表达Mb0869c的HEK293T细胞系(HEK293T/Mb0869c)正确构建。2.4诱导HEK293T细胞凋亡的最适药物浓度与作用时间的筛选结果将HEK293T细胞以5伊105个/mL铺于96孔板中，过夜培养。使用不同浓度的TNF-琢和SM164共同作用细胞，设置一组空白对照和6组不同药物浓度的实验组，分别在12 h和24 h后加入CellTiter-GloR2.0 Reagent试剂裂解细胞，使用酶标仪检测化学发光读数，并计算各组细胞的存活率。结果显示，与空白对照组相比，在药物作用12 h后，实验组的细胞存活率均在80%左右(图4A)；在药物作用24 h后，20 ng/mL TNF-琢+25 nmol/L SM164处理的细胞存活率约为58%，100 ng/mL TNF-琢+25 nmol/LSM164处理的细胞存活率约为56%，且这组数据重复率较好，此时药物诱导的细胞凋亡效果极显著(0.001)。后续试验采用该组浓度。2.5Mb0869c对TNF-琢诱导细胞凋亡影响的检测结果将上 述构 建 的HEK293T/Mb0869c和HEK293T/Con细胞以5伊105个/mL铺于96孔板中，375%CO2过夜培养。设置一组空白对照组和一组实验组，实验组使用100 ng/mL TNF-琢+25 nmol/L SM164共同作用细胞24 h，使用CellTiter-Glo 2.0 Assay试剂盒检测细胞ATP水平，并通过公式(实验组化学发光读数/对照组化学发光读数的平均值)伊100%以计算细胞存活率。结果显示：空白对照组细胞的存活率均为100%，而实验组中细胞的存活率均显著下降(0.001)，其中HEK293T/Mb0869c细胞的存活率极显著高于HEK293T/Con细胞(0.001)(图5)，表明Mb0869c能够显著抑制细胞凋亡。2.6Mb0869c 与 RIPK1 3 个 结 构 域 相 互 作 用 的Co-IP 试 验 结 果利 用PCR扩 增 得 到RIPK1-KD、RIPK1-ID和RIPK1-DD 3个结构域基因片段并克隆至pCMV-Myc载体中，构建重组质粒pCMV-Myc-RIPK1-KD、pCMV-Myc-RIPK1-ID、pCMV-Myc-RIPK1-DD，经菌落PCR鉴定。结果显示，分别获得942 bp、879 bp、270 bp的目的条带，均与预期一致(图6A)。测序结果显示，重组质粒中KD、ID、DD的基因序列与已登录的相应基因序列完全相同，表明重组质粒pCMV-Myc-RIPK1-KD、pCMV-Myc-RIPK1-ID、pCMV-Myc-RIPK1-DD均正确构建。将重组质粒pCMV-Myc-RIPK1-KD、pCMV-Myc-RIPK1-ID、pCMV-Myc-RIPK1-DD及pCMV-Myc-RIPK1-FL和pCMV-Myc分别转染HEK293T/Mb0869c细胞中，其中pCMV-Myc空载体转染的HEK293T/Mb0869c细胞为阴性对照；pCMV-Myc-RIPK1-FL转染的HEK293T/Mb0869c细胞为阳性对照。转染24 h后提取细胞总蛋白，分别制备Input和IP样品。通过western blot检测。结果显示，在Input样品中，转染RIPK1-FL、RIPK1-KD、RIPK1-ID及RIPK1-DD的HEK293T/Mb0869c细胞与Myc抗体反应后出现了特异性条带，而转染pCMV-Myc空载体的HEK293T/Mb0869c细胞 中无 该 特 异 性 条带；在IP样 品 中，Mb0869c与抗Flag磁珠的结合物可以与RIPK1-FL、RIPK1-KD和RIPK1-ID反应出现特异性条带，而转染RIPK1-DD的HEK293T/Mb0869c细胞中无该特异性条带(图6B)。表明Mb0869c可以与RIPK1的激酶结构域和中间结构域互作。图4检测TNF-琢和SM164作用细胞12 h(A)和24 h(B)后细胞的存活率ng/mLnmol/Lng/mLnmol/LTNF-琢SM-164TNF-琢SM-1641001001005010025201002050202500100100100501002520100205020250014012010080604020014012010080604020012 h24 hAB图5Mb0869c对细胞存活率的影响HEK293T/ConHEK293T/Mb0869c150100500TNF-琢+SM164Mock中 国 预 防 兽 医 学 报2023年734梁秋韵，等.牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究第7期7352000bp1000bp750bp500bp250bpM123AM:DL2000 DNA Marker;1:pCMV-Myc-RIPK1-KD;2:pCMV-Myc-RIPK1-ID;3:pCMV-Myc-RIPK1-DD图6重组质粒的PCR鉴定(A)及Co-IP对Mb0869c与RIPK13个结构域的互作检测结果(B)IB:MycIB:Myc78.5ku34.3ku33.8ku57.2ku78.5ku34.3ku33.8ku57.2ku11.5ku35kuMyc-TagMyc-RIPK1-FLMyc-RIPK1-KDMyc-RIPK1-IDMyc-RIPK1-DDFlag-Mb0869c+-+-+-+-+-+-+-+-+BIB:FlagIB:FlagIB:GAPDHIP:FlagInput3讨论基因组在核苷酸水平上与人结核分枝杆菌有99.95%的同源性12-13，其感染机制也与结核分枝杆菌类似，均进入机体肺脏后感染肺泡巨噬细胞，促使巨噬细胞产生一系列的促炎因子和趋化因子，进一步募集DC、淋巴细胞等免疫细胞到达感染部位，引发机体产生获得性免疫应答14。在巨噬细胞调节的众多机制中，细胞凋亡在抗分枝杆菌感染中起着重要的作用。细胞凋亡可控制分枝杆菌的扩散，减弱包括在内的多种分枝杆菌的活性15-16。外源性细胞凋亡主要是由细胞外的Fas配体和肿瘤坏死因子激活，两者分别可以与细胞膜上的死亡受体家族的Fas受体和TNF受体1(TNFR1)结合，并激活细胞凋亡的信号通路17。通常，TNF通过激活TNF受体(TNFR)传递死亡信号，但是是如何调控TNF通路的信号机制并不清楚。Shao等研究发现大肠杆菌毒力因子NleB可以抑制TNF介导的细胞凋亡。NleB的N端含有一个乙酰氨基葡萄糖转移酶，该酶可以作用于TRADD死亡结构域的精氨酸(Arg235)，使DD糖基化而不能与TNFR1和FADD寡聚化形成凋亡诱导复合物18。另外，最近 有 研究 发现 具有 激 酶 活 性 的RIPK1也是凋亡诱导复合体的成员之一，其C端也含有一个死亡结构域，可通过磷酸化、乙酰化和泛素化过程控制RIPK1-FADD-Caspase-8复合体的形成，并参与Caspase-8依赖性的细胞凋亡过程以及TNFR1的信号识别19-21。RIPK1作为一种多结构域蛋白，在TNF-琢信号通路中起重要作用，决定细胞的存活、凋亡或死亡22。前期研究利用酵母双杂交系统筛选出了与人RIPK1互作的Mb0869c蛋白。由于属于强毒株，必须在生物安全防护三级实验室操作，这使对