酶联免疫法测定甘精胰岛素中单链前体残留研究.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3290DOI:10.19803/j.1672-8629.20230404 中图分类号：R917文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）03-0290-05基金项目：国家重点研发计划（2021YFF0600804）。作者简介：张孝明，女，博士，助理研究员，生物技术药物质量控制。*通信作者：梁成罡，男，博士，研究员，激素及生物技术药物质量控制。E-mail:#为共同通信作者。甘精胰岛素为目前应用最多的长效胰岛素衍生物为蛋白类生物制品。其通过基因重组技术生产，与胰岛素相比 A 链的 21 位由甘氨酸代替天门冬酰胺，B 链 C 末端的第 31 位和 32 位增加了2 个精氨酸1-2。氨基酸的替换使得甘精胰岛素等电点发生改变，在生理条件下的溶解度降低，降糖作用得到延长3。胰岛素原又称单链前体，是重组人胰岛素生产中的工艺杂质之一，其序列由N端信号肽或前导肽、胰岛素 B 链、C 肽及胰岛素 A 链构成4。中酶联免疫法测定甘精胰岛素中单链前体残留研究张孝明，吕萍，胡馨月，丁晓丽，李晶#，梁成罡*（中国食品药品检定研究院化学药品检定所，国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629）摘要:目的建立酶联免疫法检测甘精胰岛素中单链前体残留，为甘精胰岛素药物质量控制和安全性评价提供新方法。方法采用双抗夹心酶联免疫法，以甘精胰岛素原为标准品，建立单链前体残留检测方法，验证方法的重复性、准确度、范围和精密度，并应用该方法检测 9 批甘精胰岛素原料药。结果在 0.15610.00 ngmL-1浓度范围内，对甘精胰岛素原标准品进行四参数曲线拟合，曲线相关系数 R2大于 0.99，方法准确度较高、重复性良好。重复检测 3 批甘精胰岛素原料药，平均加标回收率在104%113%范围内，RSD%小于10%，方法精密度良好。9 批样品中单链前体残留量均小于1 ngmg-1。结论建立的酶联免疫法可用于甘精胰岛素及其他重组人胰岛素类似物中单链前体残留量的质量控制和安全性评价。关键词：酶联免疫法；甘精胰岛素；单链前体；C 肽；质量控制；方法学验证；安全性；回收率Detection of single-chain precursor residues in insulin glargine by ELISAZHANG Xiaoming,LYU Ping,HU Xinyue,DING Xiaoli,LI Jing#,LIANG Chenggang*(Institute for Chemical Drug Control,National Institutes for Food and Drug Control,NHC Key Laboratory of Research on Quality and Standardization of Biotech Products,Beijing 102629,China)Abstract:Objective To establish an enzyme-linked immunoassay for the detection of single-chain precursor residues in insulin glargine so as to recommend a new method for quality control and safety evaluation of insulin glargine.Methods An enzyme-linked immunoassay based on double antibody sandwich was established by using proinsulin glargine as the standard.The repeatability,accuracy,scope and precision of the method were verified,and nine batches of insulin glargine drug substances were tested using this method.Results Four-parameter curve fitting was performed using the proinsulin glargine standard at concentrations ranging from 0.156 to 10.00 ngmL-1,and the correlation coefficient of the curve exceeded 0.99.This method was highly accurate and repeatable.Three batches of insulin glargine drug substances were repeatedly detected.The average recovery ranged from 104%to 113%,and the RSD%was less than 10%,suggesting the good precision of this method.The single-chain precursor residues in all the nine batches were less than 1 ngmg-1.Conclusion The enzyme-linked immunoassay established in this study can be used for quality control and safety evaluation of single-chain precursor residues in insulin glargine and other recombinant human insulin analogues.Keywords:enzyme linked immunosorbent assay(ELISA);insulin glargine;single-chain precursor;C peptide;quality control;method validation;safety;recovery rate 华人民共和国药典（2020 版）（第三部）（简称“中国药典”）新增了甘精胰岛素各论，明确要求：“工艺中如有单链前体，应采用经批准的方法及限度进行控制”5。美国药典 2022 版（简称“USP-NF2022”）和欧洲药典第11 版（简称“EP11”）也要求对甘精胰岛素单链前体残留量进行控制，USP-NF2022 还规定了单链前体残留限度不得过 10 ngmg-16-7。由于不同厂家的生产工艺不同8，胰岛素原残留的检测方法也就很难统一，各国药典也均未规定测定方法。目前各生产企业采用的方法不尽相同，主要为酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）9和反相液相色谱检测法（reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC）。RP-HPLC 具有较高的精密度和准确性，中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3291但对仪器设备要求较高10。ELISA方法基于抗原抗体特异结合反应，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求低、测定成本低等优点。双抗体夹心法是目前主要的单链前体检测 ELISA方法11。研究中发现，企业标准 ELISA法存在以下问题：部分生产企业以 C 肽作为对照品，以 C 肽 ELSIA定量检测试剂盒或抗 C 肽抗体检测单链前体残留，抗 C 肽抗体能否识别单链前体尚未可知，而以 C 肽作为对照品计算单链前体残留量结果不准确；部分生产企业虽然采用胰岛素原作为对照品进行 ELISA检测，但使用的包被抗体为能同时识别胰岛素原和 C肽的多克隆抗体，且检测抗体为抗胰岛素抗体，方法的特异性不高；多未设置回收率检测，方法准确性有待商榷。解决上述方法专属性低、准确度差的问题，应使用能特异识别单链前体的抗体，用单链前体作为对照品进行检测，并对方法进行验证。人胰岛素原定量检测 ELISA 试剂盒含有能特异性识别人胰岛素原的抗体，已被开发用于血清和血浆中的胰岛素原的定量检测研究。试剂盒包含的抗人胰岛素原捕获抗体偶联有标签，抗人胰岛素原检测抗体偶联有辣根过氧化物酶，酶标板包被有抗标签的抗体。检测时，胰岛素原与检测抗体及捕获抗体形成抗原-抗体复合物，酶标板上的抗标签抗体可以结合捕获抗体上偶联的标签，通过洗涤的方法可去除未结合的抗体及待测物。加入 3,3,5,5-四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB）显色底物后，TMB 底物被结合在酶标板上的辣根过氧化物酶催化产生黄色产物，通过检测 450 nm 处的吸收值可定量检测黄色产物量，从而确定样品中单链前体残留量。由于试剂盒配套的重组单抗能识别以 C 肽为连接肽的胰岛素原，但不识别 C 肽和人胰岛素，用该试剂盒检测单链前体残留量能解决企业方法特异性低、准确度差的问题。本研究对胰岛素类生物制品质量控制和用药安全具有重要意义。1 材料与方法1.1 试剂甘精胰岛素原标准品（本室留存，批号：RS0723，规格：每支4.48 mg）；C 肽标准品（本室留存，批号：H00808-PS-01，规格：每支20 mg）；重组人胰岛素标准品（中国食品药品检定研究院，批号：140633-201907，27.2 IUmg-1）；甘精胰岛素标准品（中国食品药品检定研究院，批号：140701-202004，26.3 U mg-1）；甘精胰岛素原料药（本室留存，生产企业 S 3 批，批号：W669-1、W681-1、W663-1；生产企业 W 3 批，批号：202109C01、202109C02、202109C03；生产企业L 3批，批号：D184148、D184149、D184150）。人胰岛素原 SimpleStep ELISA试剂盒（英国Abcam，批号：GR3437081-1，包含人胰岛素原标准品、已包被的酶标板、捕获抗体、检测抗体、抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、TMB显色底物、终止液）。1.2 仪器 涡旋振荡仪（德国 IKA 公司，型号：Vortex2）；多功能酶标仪（美国 Biotek 公司，型号：EoN）；微孔板振荡器（德国 Eppendorf 公司，型号：5385000075）；Softmax Pro 软件（美国 Molecular Devices 公司，软件版本 7.1）。1.3 甘精胰岛素单链前体测定操作步骤分别取甘精胰岛素原标准品、供试品、加标回收样品和样品稀释液（空白对照）各50 L 平行 3 复孔加入酶标板中，每孔再分别加入 50 L 抗体混合液（含40 L 抗体稀释液、5 L 捕获抗体及 5 L 检测抗体，临用前制备，根据试验孔的数量扩大各组分体积）。室温（242）下400 rpm 振荡孵育1 h，倒去溶液后每孔加 350 L 清洗液彻底洗涤 3 次，每次洗涤停留1 min。每孔加100 L TMB显色底物，室温孵育3 min，不要振荡，加入 100 L 终止液终止显色，读取 450 nm 处的吸光值，计算单链前体含量。1.4 数据分析利用 Softmax Pro 软件分析试验数据，标准品浓度取以10 为底的对数作为横坐标，对应的 3 复孔孔吸光度平均值作为纵坐标，拟合四参数回归标准曲线，将样品吸光度值扣去空白孔吸光度值代入标准曲线计算单链前体含量。计算公式如下：回收率（%）=（加标测定值-0.5样品测定值）/理论值100%。单链前体残留量（ngmg-1）=样品测定值稀释倍数/样品浓度。1.5 标准曲线的建立用样品稀释液将甘精胰岛素原标准品配制成1.00 mgmL-1浓度，再用样品稀释液分别稀释至10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156 ngmL-1共计 7 个浓度点做标准曲线。1.6 样品前处理探索用10 mol L-1 NaOH 调节样品稀释液 pH至 9.0、9.5、10.0，取 3 家生产企业各1批甘精胰岛素，用样品稀释液配制成1.00 mgmL-1浓度的供试品溶液，同时制备甘精胰岛素原标准品溶液，并在供试品中等体中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3292积加入浓度为1.25 ng mL-1的甘精胰岛素原标准品，制成加标回收样品，按甘精胰岛素单链前体测定操作步骤进行加标回收率检测，计算结果的相对标准偏差。1.7 方法学验证参考 中国药典 通则 9012和ICH Q2（R1）进行方法学验证。将 C 肽标准品、重组人胰岛素标准品、甘精胰岛素标准品分别用样品稀释液溶解并稀释成浓度为1.00 mgmL-1的溶液，按甘精胰岛素单链前体测定操作步骤进行检测，验证方法的专属性。用样品稀释液将甘精胰岛素原标准品稀释至理论值为10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156 ng mL-1，按甘精胰岛素单链前体测定操作步骤在 3 个不同日期重复测定 3 次，验证方法的重复性、准确度和范围。取 3 厂家甘精胰岛素各1 批，分别用 pH 为 9.5 的样品稀释液制成浓度为 1.00 mgmL-1的溶液，等体积加入1.25 ngmL-1的甘精胰岛素原标准品，制成甘精胰岛素原终浓度为 0.625 ngmL-1的加标回收样品，每批样品及加标回收样品重复测定 3 次，计算 3 次结果的几何平均值和相对标准偏差，考察方法的精密度。1.8 方法的应用分别将 3 家生产企业共 9 批甘精胰岛素用 pH为 9.5 的样品稀释液制成浓度为1.00 mgmL-1的溶液，并制备甘精胰岛素原标准品终浓度为 0.625 ngmL-1的加标回收样品，依照甘精胰岛素单链前体测定操作步骤进行检测。2 结果2.1 标准曲线的建立在0.156 210.00 ngmL-1浓度范围内，标准曲线符合四参数回归曲线（图1），相关系数 R2均大于 0.99。品中有 1 批加标回收率为 75.52%，低于 80%，另外2 批样品加标回收率分别为 82.10%和 100.96%。pH为 9.5 和 10.0 的样品稀释液溶解的样品加标回收率均在 80%120%，在残留量检验的接受范围内12，且 pH 为 9.5 的样品稀释液制备的 3 家生产企业的3 批样品加标回收率相对标准偏差更低。因此，选用pH 为 9.5 的样品稀释液复溶供试品进行测定。-1.0-0.50.00.51.01.50123Proinsulin glargine concentration/log(C/ngmL-1)A450 nm图1 甘精胰岛素原典型四参数曲线Figure 1 Typical standard curve of insulin glargine表1 pH 值对甘精胰岛素中单链前体残留检测的影响Table 1 Effects of pH on single-stranded precursor analysis of insulin glargine样品稀释液 pH供试品生产企业样品浓度/mgmL-1加标理论值/ngmL-1加标回收率/%相对标准偏差/%9.0W1.000.62582.1015.32S1.000.62575.52L1.000.625100.969.5W1.000.62599.233.67S1.000.625105.52L1.000.625106.0810.0W1.000.625106.4910.04S1.000.625120.00L1.000.62598.482.2 样品前处理探索3 家生产企业的甘精胰岛素加标回收样品测定结果（表 1）表明，pH 为 9.0 的样品稀释液溶解的样2.3 方法验证 2.3.1 专属性 检测 C 肽标准品、重组人胰岛素标准品、甘精胰岛素标准品各孔吸光度值与空白孔相近，表明试剂盒所使用的抗体与 C 肽、人胰岛素及甘精胰岛素均无交叉反应，该方法专属性较好。2.3.2 重复性、准确度和范围 理论浓度为10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156 ngmL-1的甘精胰岛素原标准品测定结果（表 2）显示，平均回收率在 80%120%，分 别为 83.40%、90.72%、97.44%、96.88%、98.67%、97.17%、105.39%，RSD%均 小 于6.00%。表明方法在 0.15610.0 ngmL-1浓度范围内检测结果准确，方法重复性高。2.3.3 精密度 来自3 个不同生产企业的 3 批供试品分别重复检测 3 次（表 3），回收率平均值分别为104.10%、113.19%、105.45%，RSD%分别为 9.08%、2.56%、7.28%，均小于15%，表明方法精密度良好。3 家生产企业甘精胰岛素单链前体残留量平均值分别为 0.078、0.010、0.013 ngmg-1。由于样品中单链前体残留量低，导致残留量 RSD%较大，分别为52.65%、11.84%、9.51%。2.3.4 方法的应用 3 家生产企业 9批甘精胰岛素样品检测结果见表 4，9 批样品中单链前体残留量均小于1 ng mg-1，加标回收样品的回收率均在 80%120%，表明方法可以用于甘精胰岛素单链前体残留量检测。3 讨论胰岛素是机体内一种重要的降低血糖的激素，中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3293能同时促进糖原、脂肪和蛋白质合成。重组人胰岛素是世界上第一个通过基因重组技术生产的蛋白药物，是治疗糖尿病的重要药物13-14。重组人胰岛素的合成策略主要有 2 种15-16：1种是将人胰岛素原基因导入大肠杆菌，表达的人胰岛素原往往形成包涵体，要通过复性和酶切等过程才能得到有活性的胰岛素；表 2 甘精胰岛素原标准品重复性、准确度和范围检测结果Table 2 Results of repeatability,accuracy and range determination using proinsulin glargine as the standard标准品理论值/ngmL-1检测次数测定值/ngmL-1回收率/%平均回收率/%相对标准偏差/%10.018.29482.9483.402.79 28.13481.3438.59285.925.0014.62992.5890.722.33 24.55891.1634.42188.422.5012.36994.7697.442.65 22.49899.9232.44197.641.2511.14891.8496.885.61 21.20296.1631.283102.640.62510.60196.1698.672.99 20.61297.9230.637101.920.31210.30497.2897.172.47 20.29694.7230.31199.520.15610.159101.76105.394.48 20.162103.6830.173110.72表 3 甘精胰岛素单链前体残留量检测精密度结果Table 3 Precision results of single-stranded precursor analysis供试品生产企业检测次数单链前体残留量/ngmL-1单链前体残留量/RSD%回收率/%回收率/RSD%W10.23652.6595.549.0820.114102.5230.092114.24S10.07811.84110.722.5620.098112.4630.084116.38L10.1199.5197.447.2820.144106.1630.134112.75表 4 9 批甘精胰岛素中单链前体残留检测结果Table 4 Detection results of single-stranded precursors in 9 batches of insulin glargine序号标准品理论浓度/ngmL-1加标供试品测定值/ngmL-1供试品测定值/ngmL-1单链前体残留量/ngmL-1加标回收率/%10.6250.7230.1240.124105.7620.6250.680.0630.063103.7630.6250.6240.0790.07993.5240.6250.7040.1560.156100.1650.6250.7180.0910.091107.660.6250.650.1480.14892.1670.6250.6470.0470.04799.7680.6250.6330.0820.08294.7290.6250.7350.0740.074111.68另1 种是在酵母菌中分泌表达人胰岛素原，再经过酶切、纯化等步骤得到有活性的胰岛素。为提高表达效率及蛋白稳定性，不同生产企业通过不同策略对人胰岛素原基因进行了改造，包括将 C 肽改短或者替换为其他氨基酸序列、改造 N 端信号肽序列或前导肽序列，在前导肽与胰岛素 B 链之间增加连接肽等17。改造后的胰岛素原与天然人胰岛素原序列不同，进入体液属于免疫原性分子，可能诱发机体产生有害的免疫反应18。此外，单链前体可以刺激纤溶酶原激活剂抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor,PAI-1）分泌，阻断纤维蛋白溶解，从而增加 II 型糖尿病患者心血管疾病发生率19。单链前体水平异常还可能导致动脉粥样硬化20，细胞功能障碍21。因此，人胰岛素及其类似物生产中必须严格控制单链前体残留量，并采用适当的方法对控制效果进行分析。针对单链前体分子结构建立特异性强的检测方法，对胰岛素类生物制品质量控制和用药安全具有参考意义22。由于胰岛素原蛋白结构和序列的差异性，各国监管机构实际并未规定统一的单链前体检测方法，需要按照实际产品进行分别控制。本研究用人胰岛素原 ELISA 检测试剂盒建立了测定甘精胰岛素单链前体残留的方法。本文所述方法的优势主要体现在 3 方面：方法采用的捕获抗体和检测抗体均为抗人胰岛素原抗体，而非识别 C 肽的抗体或者抗胰岛素抗体，因此，方法的特异性更高。方法仅需一步即在溶液中形成抗体-分析物夹心复合物，通过1 次孵育和 1 次清洗即可完成检测。与传统的夹心ELISA 法相比，本方法操作更简便、耗时短，适用于大规模高通量检测。方法使用的抗体为重组单抗，抗体一致性高，方法重复性良好。方法线性范围为0.156 210.00 ngmL-1，满足单链前体残留量不得过10 ngmg-1的标准限度检测要求，可作为单链前体的质控方法，用于过程控制和终产品的放行检验。中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3294由于胰岛素是含硫多肽，在中性 pH 溶液中不能完全溶解，本研究探索了不同 pH 值的样品稀释液对方法的影响，发现不同生产企业的甘精胰岛素溶解性不同。本研究使用 3 个不同生产企业的甘精胰岛素均能溶解于 pH 为 9.5和10.0 的样品稀释液中，测定的加标回收率均在 80%120%范围内，且 pH为 9.5 的样品稀释液制备 3 家生产企业的 3 批样品加标回收率相对标准偏差更低。当 pH 为 9.0 时，仅2 个生产企业的样品能完全溶解，加标回收率分别为 82.10%和 100.96%，而1 个生产企业的样品不能完全溶解，加标回收率低于 80%，导致检测的 3 批样品相对标准偏差高于15%。这说明 pH 值对单链前体测定有重要影响，在保证准确度的前提下，为提高方法的通用性，本研究选取了pH 为 9.5 的样品稀释液制备供试品。未来在使用此方法测定其他生产企业甘精胰岛素中单链前体残留时，还需探索适宜的样品稀释液 pH 值。本研究所述方法测定甘精胰岛素中单链前体含量结果准确度高、精密度好、重复性强。以C 肽为连接肽的人胰岛素原及赖脯胰岛素原在本文所述方法条件下也能得到有效识别，本文所述方法同样也适用于以 C 肽为连接肽的人胰岛素和赖脯胰岛素中单链前体残留检测。因此，本研究对胰岛素及其类似物的质量控制和用药安全具有参考意义。参考文献1 SEBASTIAN SA,CO EL,MEHENDALE M,et al.Insulin analogs in the treatment of type II diabetes and future perspectivesJ.Dis Mon,2023,69(3):1-11.2 KABRA UD,JASTROCH M.Mitochondrial dynamics and insulin secretionJ.Int J Mol Sci,2023,24(18):2-19.3 VARGAS-URICOECHEA H.Current state and principles of basal insulin therapy in type 2 diabetesJ.J Clin Med Res,2022,14(1):8-21.4 LE TKC,DAO XD,NGUYEN DV,et al.Insulin signaling and its applicationJ.Front EndocrinolJ,2023,8(14):1-9.5 Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People s Republic of China,Volume 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