奶牛亚临床酮病血液生化指标分析及糖皮质激素影响肝细胞糖异生作用分子机制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211047奶牛亚临床酮病血液生化指标分析及糖皮质激素影响肝细胞糖异生作用分子机制的研究陈灰*，李松建，杜蕊，徐子萱，李薛强(内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)摘要：为探究围产期奶牛亚临床酮病血清中生化指标的变化特征，本研究选取24胎次荷斯坦围产期奶牛45头，分别在分娩前7 d、分娩当天晨饲前经尾根静脉采血，以血酮检测值1.2 mmol/L为健康组，逸1.2 mmol/L为酮病组。采用ELISA试剂盒测定分娩前7 d、分娩当天、分娩后7 d、14 d健康组和酮病组奶牛血液中的生化指标。结果显示，酮病组奶牛分娩前7 d和分娩当天血清中皮质醇含量显著高于健康组(0.05)；并且酮病组奶牛分娩前7 d血清中茁-羟丁酸(BHBA)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量显著高于健康组(0.05)；酮病组奶牛分娩前后血清中葡萄糖(Glu)、甘油三脂(TG)、极低密度脂蛋白(VLDL-C)、游离脂肪酸(FFA)含量较健康组虽无显著差异，但均高于健康组。分别以0、1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L浓度的糖皮质激素(GC)刺激原代分离培养的犊牛肝细胞，作用0、1 h、3 h、6 h、24 h后采用荧光定量PCR检测肝细胞中糖异生相关受体及其相关酶编码基因的相对转录水平，并以皮尔森相关系数对糖异生相关受体及其相关酶编码基因的转录水平进行相关性分析。qPCR结果显示：高浓度GC促进原代犊牛肝细胞中糖皮质激素受体(GR)NR3CI的转录水平，低浓度GC促进盐皮质激素受体(MR)NR3C2的转录水平。糖异生相关限速酶PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2编码基因的相对转录水平随GC浓度和其作用时间而变化。皮尔森(Pearson)相关性分析结果显示：PC、PCK2、11茁-HSD1基因的相对转录水平与NR3C1极显著相关(0.01)，PEPCK-C、11茁-HSD1、11茁-HSD2与NR3C2的相对转录水平显著相关(0.05)。上述结果表明酮病奶牛分娩前GC水平升高，而GC可能通过结合其受体GR/MR提高奶牛肝细胞中糖异生关键酶PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1和11茁-HSD2编码基因mRNA的转录，从而促进糖异生作用。本研究为酮病奶牛体内糖脂代谢相关激素GC的内分泌调节作用及其分子机制和GC的临床应用奠定实验基础。关键词：奶牛酮病；糖皮质激素；糖异生；糖皮质激素受体；盐皮质激素受体中图分类号：S852.2文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0959-09Analysis of blood biochemical parameters of subclinical ketosis andglucocorticoid-stimulated hepatocyte gluconeogenesis in dairy cattlestudy on the molecular mechanismCHEN Hui*,LI Song-jian,DU Rui,XU Zi-xuan,LI Xue-qiang(Inner Mongolia Agricultural University,College of Veterinary Medicine,Hohhot 010018,China)Abstract:The aim of this study was to explore the changes of serum biochemical indexes of perinatal dairy cows with收稿日期：2022-11-25基金项目：内蒙古自然科学基金面上项目(2019MS03056)；内蒙古自然科学基金博士基金项目(2019BS03017)；内蒙古农业大学高层次人才科研启动项目(NDYB2018-10)作者简介：陈灰(1985-)，女，山东菏泽人，讲师，博士，主要从事反刍动物营养代谢病研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorsubclinical ketosis,analyze the changes of the level of glucocorticoid cortisol(Cor),and to investigate the molecular mechanism ofsynthetic glucocorticoid(GC)regulating gluconeogenesis in liver cells of dairy cows by primary isolation of calf hepatocytes.45Holstein perinatal cows of 2-4 parities were selected,and blood was collected from the anterior caudal vein 7 days before deliveryand in the morning of delivery.The BHBCheck Plus Blood Ketone blood ketone test value 1.2 mmol/L was used as the healthygroup,and those value逸1.2 mmol/L were used as the ketosis group.ELISA method was used to measure biochemical indexes inthe blood of cows in the healthy group and ketosis group at 0 and 7 days before delivery,7 days and 14 days after delivery,respectively.The results showed that the serum cortisol content in the ketosis group was significantly higher than that in the healthygroup 7 days before delivery and on the day of delivery(0.05).The contents of茁-hydroxybutyric(BHBA)and high-densitylipoprotein(HDL-C)in the serum of cows in the ketosis group 7 days before delivery were significantly higher than those in thehealthy group(0.05).The levels of glucose(Glu),triglycerides(TG),extremely low density lipoprotein(VLDL-C)and free fattyacids(FFA)in the serum of cows with ketosis before and after delivery were not significantly different from those in healthy group,but were all higher than those in healthy group.The primary cultured calf hepatocytes were further stimulated by glucocorticoids atconcentrations of 0,1伊10-7mmol/L,1伊10-8mmol/L and 1伊10-9mmol/L,respectively.After 0,1 hours,3 hours,6 hours and 24 hours,the relative transcription levels of gluconeogenic receptors and genes in hepatocytes were detected by qPCR method,and thecorrelation between the expression levels of gluconeogenic receptors and genes was analyzed by Pearson correlation coefficient.The results showed that high concentrations of GC promoted the expression of glucocorticoid receptor(GR)NR3CI,while lowconcentrations of GC promoted the expression of mineralocorticoid receptor(MR)NR3C2.Gluconeogenesis related rate-limitingenzymes pyruvate carboxylase(PC),phosphoenolpyruvate carboxylkinase(PEPCK-C),phosphoenolpyruvate carboxylkinase 2(PCK2),11茁Hydroxysteroid Dehydrogenase1(11茁-HSD1),11茁Hydroxysteroid Dehydrogenase2(11茁-HSD2).The relativeexpression level varied with GC concentration and time,and Pearson correlation analysis results showed that the relative expressionlevels of PC,PCK2 and 11茁-HSD1 were significantly correlated with NR3C1(0.01),and the relative transcription levels ofPEPCK-C,11茁-HSD1 and 11茁-HSD2 were significantly correlated with NR3C2(0.05).To sums up,the results of this studyindicate that the level of GC in ketosis dairy cows increases before delivery,and GC may enhance the mRNA transcription of thekey gluconeogenic enzymes PC,PEPCK-C,PCK2,11茁-HSD1 and 11茁-HSD2 in cow hepatocytes by binding to its receptorGR/MR,thus promoting its gluconeogenesis.It laid a theoretical foundation for the endocrine regulation and molecular mechanismof glucose-lipid metabolism related hormone GC in ketosis cows and the clinical application of GC.Key words:dairy cattle ketosis;cortisol;gluconeogenesis;glucocorticoid receptor(GR);mineralocorticoid receptor(MR)病原侵入机体时肝脏能够起到过滤抗原、清除和诱导免疫耐受性，同时通过吞噬作用清除、过滤异源物质和调节免疫反应的作用；另外，肝脏也是参与三大营养物质新陈代谢的重要器官1-3。奶牛主要靠体内消化和降解挥发性脂肪酸作为主要能量来源，如乙酸、丙酸、丁酸，丙酸大部分用于合成乳糖，而作为生酮先质的乙酸、丁酸和动员脂肪代谢的游离脂肪酸，通过3种不同形式在肝脏内转换：第一，以草酰乙酸为原料经三羧酸循环产生能量；第二，参与葡萄糖代谢转化成脂肪；第三，无草酰乙酸参与的则生成酮体4。不同个体对糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)的反应并不完全一致，有些个体对GC治疗敏感，而有些个体对GC的敏感性下降，甚至抵抗。由于体内影响GC发挥作用的因素很多，因此抵抗GC的具体机制至今仍未完全阐明。GC主要通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)结合发挥作用，GR是核受体家族的一员，而与其同为核受体家族成员的盐皮质激素受体(Mineralo-corticoid receptor，MR)与其结构非常相似，也能够在体内与GC相互作用5。GC通过增加肝糖异生，抑制胰岛素降糖效应发挥拮抗胰岛素的作用。组织中的GC活化受体水平受11茁 羟 类 固 醇 脱 氢 酶1型(11茁-HSD1)调 节，而11茁-HSD1的活化依赖于海藻糖6磷酸脱氢酶(Hex-ose-6-phosphate Dehydrogenase，H6PDH)提供烟酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸(Nicotinamide adenine dinu-cleotide phosphate oxidase，NADPH)，并且H6PDH和11茁-HSD1相互调节在糖异生途径机制中的作用尚不中 国 预 防 兽 医 学 报2023年960清楚6。H6PDH和11茁-HSD1可能诱导糖尿病患者的糖异生关键酶异常激活，进而增强糖异生作用。有研究通过构建H6PDH和11茁-HSDl siRNA干扰质粒，在细胞水平验证了H6PDH siRNA和11茁-HSD1 siRNA可以互相抑制蛋白的表达及活性7。皮质醇是奶牛体内生理状态的GC，它具有调节蛋白质、脂肪、糖类合成和代谢的作用，同时它有非常重要的药理作用，可以调节机体的免疫反应和抗炎症反应8。NR3C1(核受体亚科3，C组，成员1)是GR家族中的重要成员，NR3C2(核受体亚科3，C组，成员2)是MR家族中的重要成员9，研究表明，NR3C1和NR3C2的6个单核苷酸多态性位点rs6191、rs6196、rs10482614、rs1512325、rs1512342和rs2070951与肾病治疗预后有着重要关系10。还有研究表明，重度抑郁症患者的下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypo-thalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)存在异常，而GC和MR在HPA轴稳态中发挥着不可替代的作用11。此外，陈杨等证明，NR3C1在肾透明细胞癌中显著高表达，并与肾透明细胞癌的预后相关12。可见GC和MR是酮病和其他疾病诊断和治疗的潜在靶点。为研究奶牛酮病中GC在肝脏中的调控机制，本实验探究了围产期亚临床酮病奶牛血清生化指标的变化规律，并基于肝细胞分析GC调控奶牛肝细胞糖异生途径的分子机制，为今后奶牛酮病的激素诊断与治疗奠定基础。1材料与方法1.1主要实验材料45头2胎次以上且体重大于800 kg临产前7 d的奶牛，分别来自内蒙古呼和浩特市和林格尔县某奶牛场。Check plus blood ketone血酮检测仪及检测试纸条购自德国拜耳公司；皮质醇(Cor)、茁-羟丁酸(BH-BA)、葡萄糖(Glu)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、极低密度脂蛋白(VLDL-C)、游离脂肪酸(FFA)ELISA试剂盒均购自南京建成生物科技公司；GC购自Sigma公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；SYBR Green试剂盒购自诺唯赞生物科技有限责任公司。1.2实验设计将45头围产期奶牛于临产前7 d、0、产后7 d、产后14 d晨饲前经尾根静脉分别采血，使用BHBCheck Plus Blood ketone血酮仪检测分娩前7 d及分娩当天奶牛抗凝血中的血酮，选取血酮值逸1.2 mmol/L的10头奶牛为酮病组，1.2 mmol/L的10头奶牛为健康组；采集的血液4 000 r/min离心获得血清，利用ELISA试剂盒检测奶牛血清中Cor、BHBA、Glu、TG、HDL-C、VLDL-C、FFA的含量。1.3奶牛原代肝细胞的分离培养及GC添加试验奶牛酮病的发生与转归和奶牛肝脏糖代谢的相关激素密切相关，为进一步研究血酮升高后血清蛋白对肝脏的影响，根据1.2检测结果，本研究选择皮质醇，即生理状态下的GC，刺激原代奶牛肝细胞研究其糖异生的分子机制。采用改良的两步灌流法来分离培养奶牛原代肝细胞：犊牛麻醉后经颈静脉放血剖杀，无菌采集肝脏尾状突，胶原酶灌流肝组织至肝组织软化后剖开组织，分离肝细胞，按每孔1伊106个细胞铺于6孔板，每孔2 mL，在5%CO2和37条件下培养，细胞贴壁后换液继续培养72 h。对制备的原代奶牛肝细胞分别加入不同浓度0(对照)、1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L GC，每个浓度设置6个重复，分别作用0、1 h、3 h、6 h、24 h，提取各时间点肝细胞的总RNA，采用凝胶电泳测定提取的RNA的纯度及完整性，采用反转录试剂盒得到cDNA。1.4奶牛肝细胞中糖异生相关受体及其相关酶编码基因相对转录水平的测定参照GeneBank中登录的GAPDH、NR3C1、NR3C2、丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK-C)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶2(PCK2)、11茁-HSD1、11茁-HSD2编码基因序列，采用primier5软件设计引物序列，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。以1.3中获得的肝细胞cDNA为模板，采用上述引物，分别经荧光定量PCR检测糖异生相关受体基因的相对转录水平。扩增条件：9530 s；955 s；6030 s，40个循环；9515 s；6030 s；9530 s。实验以GAPDH为内参基因。1.5数据的统计与分析利用SPSS 23软件处理各组实验数据，实验结果以“平均值依标准差”表示，采用One-way ANOVA单因素方差分析各组数据之间的差异性。0.05为差异显著，0.01为差异极显著；采用SPSS中的皮尔森相关系数分析法分析糖异生相关受体及其相关酶编码基因转录水平间相关性，时间和浓度两个连续变量(X、Y)的皮尔森相关陈灰，等.奶牛亚临床酮病血液生化指标特征分析及糖皮质激素影响肝细胞糖异生作用分子机制的研究第9期961性系数(Px、y)等于它们之间的协方差cov(X、Y)除以它们各自标准差的乘积(滓X、滓Y)。系数的取值在-1.01.0，接近0的变量为无相关性，接近1或者-1的变量为具有强相关性，其公式为：2结果2.1血酮仪对分娩前7 d及分娩当天奶牛血液中血酮含量的检测结果检测分娩前7 d(-7 d)及分娩当天(0)奶牛血液中的血酮含量，根据血酮仪的读数筛选出健康组和酮病组奶牛，结果详见表2。表明各组奶牛血酮指标满足本实验要求，可用于后续试验。2.2亚临床酮病奶牛分娩前后血液中生化指标的检测结果采用相应ELISA试剂盒检测各组奶牛血清中Cor、BHBA、Glu、TG、HDL-C、VLDL-C、FFA的含量，结果显示：分娩前后健康组奶牛血清中的Cor含量无显著差异；酮病组奶牛血清中Cor含量分娩前7 d时显著高于对照组(0.05)，而酮病组奶牛分娩前7 d血清中的BHBA含量显著高于健康组(0.01)，且分娩前奶牛血清中BHBA的含量显著高于分娩后14 d(0.05)。酮病组奶牛分娩前7 d血清中HDL-C含量显著高于健康组(0.05)，但均高于健康组(图1)。表明亚临床酮病主要引起奶牛血清中Cor、BHBA、HDL-C含量变化，但对Glu、TG、VLDL-C、FFA含量无影响。2.3GC对肝细胞表面糖异生相关受体转录水平影响的qPCR检测结果根据2.2结果，本研究选取GC刺激肝细胞后，采用荧光定量PCR检测各组肝细胞表面糖异生相关受体NR3C1、NR3C2的转录水平，分析酮病对肝脏的影响。结果显示，与对照组相比，添加1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/LGC刺激肝细胞，均上调NR3C1和NR3C2在肝细胞中的相对转录水平。当添加1伊10-7mmol/L GC时，较添加0、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L浓度GC组肝细胞中NR3C1和NR3C2的上调更为显著(0.05)，且NR3C1的相对转录水平随着GC添加时间的延长而升高；当添加1伊10-9mmol/L GC时，肝细胞中NR3C2相对转录水平极显著高于其它实验组(0.01)，添加1 h时添加1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L浓度GC组较对照组均有升高趋势，虽然添加后3 h时较1 h时各实验组肝细胞中NR3C2的相对转录水平降低，但6 h、24 h时呈上升趋势(图2)。表明GC浓表2分娩前7 d及分娩当天奶牛血液中血酮含量的测定结果分组Group健康组Health group酮病组Ketosis group奶牛编号Dairy cow numberB515214739346490A102798455461554325887459500058500/1A60139C603207058655457A5128469877283508013165130分娩前 7 d7 days before delivery0.80.90.50.70.80.40.60.70.61.11.31.31.41.51.61.51.31.41.2分娩当天Day of delivery10.60.60.70.80.60.90.80.91.61.51.41.61.41.51.61.41.61.3血酮仪检测值(mmol/L)Blood ketone test values(mmol/L)中 国 预 防 兽 医 学 报2023年962表1引物序列及信息GAPDHNR3C1NR3C2PCPEPCK-CPCK211茁-HSD111茁-HSD2F:AAGTTCAACGGCACAGTCAAGR:ACATACTCAGCACCAGCATCAF:AGGCAGCAATGGTCTCAGAAR:ACGCACTGTTGGAATGAAGAGF:CAGGCTATGACGGCTCCAAR:TGACGACAGACACATCCAAGAF:TCCAACACCTACGGCTTCCR:CGATGAACTTCTCCACGAACAF:TCCAACACCTACGGCTTCCR:CGATGAACTTCTCCACGAACAF:CAAGGAAGTGCTGGCTGAACR:AGAGGATGAGAGTGTTGTTAAGTTGF:ATTCTCAACCACATCCACTACACR:TGCTCAGGACCACATAACTCAF:CACTGCTGCGTCGTTCAAGR:GGCTGGATGATGCTGACCTTGeneBank登录号GeneBankaccession numberNM_001034034.2NM_001206634.1NM_001191349.2BC114135.1AY145503.1NM_001205594.1NM_001123032.1NM_174642.2基因Genes引物序列Primier sequences(5-3)陈灰，等.奶牛亚临床酮病血液生化指标特征分析及糖皮质激素影响肝细胞糖异生作用分子机制的研究第9期963图2不同浓度GC对肝细胞糖皮质激素受体NR3C1和NR3C2转录水平影响的qPCR检测结果1伊10-9mmol/L1伊10-8mmol/L1伊10-7mmol/L0Time/hour2463101.51.00.50Time/hour2463101.21.11.00.90.8度越高，上调肝脏中NR3C1的相对转录水平越显著，且低浓度的GC更能上调NR3C2的相对转录水平。2.4GC对肝细胞内糖异生相关酶转录水平影响的qPCR检测采用荧光定量PCR检测肝细胞表面糖异生相关酶的相对转录水平，结果显示，与对照组相比，以GC 1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L刺激肝细胞6 h、24 h后均可显著上调PC、PEPCK-C的相对转录水平(0.05)，其中以1伊10-9mmol/L刺激24 h时上调肝细胞中PC相对转录水平最显著(0.01)，以1伊10-7mmol/L刺激6 h、24 h时上调PEPCK-C相对转录水平最显著(0.01)；以1伊10-7mmol/L GC刺激肝 细 胞1 h后 显 著 上 调PCK2的 相 对 转 录 水 平(0.05)，3 h后PCK2的 相 对 转 录 水 平 显 著 升 高(0.01)；以1伊10-7mmol/L GC刺激肝细胞3 h后可显著上调11茁-HSD1的相对转录水平(0.05)，6 h后11茁-HSD1的相对转录水平与时间和浓度呈正相关；以1伊10-7mmol/L、1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L GC刺激肝细胞1 h后极显著上调11茁-HSD2的相对转录水平(0.01)，3 h、6 h后11茁-HSD2相对转录水平显著上调(0.05)，24 h后，以1伊10-8mmol/L、1伊10-9mmol/L浓度刺激肝细胞显著上调11茁-HSD2相对转录水平(0.05)(图3)。表 明 肝 细 胞 糖 异 生 相 关 酶PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2的转录水平变化与GC的浓度和刺激时间密切相关。2.5GC刺激奶牛肝细胞糖异生相关受体及其相关酶编码基因的相关性分析经皮尔森相关系数计算糖异生受体NR3CI、NR3C2与肝细胞糖异生限速酶PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2转录注：*0.05，表示差异显著；*0.01，表示差异极显著。下同。Note:*0.05,indicates significant difference;*0.01,indicates highly significant difference.The same as below.图1亚临床酮病奶牛分娩前7 d至分娩后14 d血清中各生化指标的检测结果120010008006001400120010008006006055504540350.30.20.10Days after cow delivery-10-5051015-10-5051015-10-5051015-10-5051015Ketosis groupHealth group-10-5051015-10-5051015-10-505101564208642010008006004002000Days after cow deliveryDays after cow deliveryDays after cow deliveryDays after cow deliveryDays after cow deliveryDays after cow delivery水平，结果显示，NR3CI的相对转录水平与PC、PEEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1的相对转录水平有强正相关性(0.01)，与11茁-HSD2的相对转录水平无相关性(表3)；NR3C2的相对转录水平与11茁-HSD1、11茁-HSD2相对转录水平有强正相关性(0.01)，与PEPCK-C的相对转录水平有显著正相关性(0.05)(表4)。PC的 相 对 转 录 水 平 与PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1的相对转录水平有强正相关性(0.01)，与11茁-HSD2的相对转录水平无相关性；PEPCK-C的相对转录水平与PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2的相对转录水平有强正相关性(0.01)；PCK2相对转录水平与11茁-HSD1、11茁-HSD2的相对转录水平有强正相关性(0.01)；11茁-HSD1相对转录水平与11茁-HSD2的相对转录水平有强正相关性(0.01)(表3、表4)。表明在GC的作用下，肝细胞糖异生受体与肝细胞糖异生限速酶的转录水平呈正相关性。表3肝细胞GC受体NR3CI与糖异生限速酶转录水平相关性的分析注：*：0.05，显著相关；*：0.01，极显著相关。下表同。Note:*:There is a significant correlation at the0.05 level(bilateral);*:There was a significant correlation at the0.01 level(bilateral).Thesame as the following table.NR3C11600.357*0.005600.438*0600.468*0600.442*0600.1580.22960PC0.357*0.005601600.699*0600.625*0600.448*0600.2260.08360PEPCK-C0.438*0600.699*0601600.800*0600.642*0600.348*0.00660PCK20.468*0600.625*0600.800*0601600.765*0600.514*06011茁-HSD10.442*0600.448*0600.642*0600.765*0601600.632*06011茁-HSD20.1580.229600.2260.083600.348*0.006600.514*0600.632*060160NR3C1PCPEPCK-CPCK211茁-HSD111茁-HSD2相关性CorrelationPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量N中 国 预 防 兽 医 学 报2023年9642463102463101.51.00.50Time/hourTime/hour1.51.00.50246310Time/hour1.51.00.501.51.00.50246310Time/hour1.51.00.50246310Time/hour1伊10-9mmol/L1伊10-8mmol/L1伊10-7mmol/L0图3不同浓度GC对肝细胞糖异生相关限速酶转录水平影响的qPCR检测结果表4肝细胞MR NR3C2与糖异生限速酶酶转录水平的相关性分析NR3C21600.1810.166600.263*0.043600.2180.094600.334*0.009600.402*0.00160PC0.1810.166601600.699*0600.625*0600.448*0600.2260.08360PEPCK-C0.263*0.043600.699*0601600.800*0600.642*0600.348*0.00660PCK20.2180.094600.625*0600.800*0601600.765*0600.514*06011茁-HSD10.334*0.009600.448*0600.642*0600.765*0601600.632*06011茁-HSD20.402*0.001600.2260.083600.348*0.006600.514*0600.632*060160NR3C2PCPEPCK-CPCK211茁-HSD111茁-HSD2相关性CorrelationcPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量NPearson相关性Pearson correlation显著性(双侧)Significance(Bilateral)样本数量N陈灰，等.奶牛亚临床酮病血液生化指标特征分析及糖皮质激素影响肝细胞糖异生作用分子机制的研究第9期9652.6奶牛肝细胞糖异生相关受体及其相关酶编码基因可能存在的代谢通路皮质醇是生理状态的GC，本研究中奶牛患亚临床酮病时茁-羟丁酸、皮质醇、高密度脂蛋白均高于健康组，这可能是由GC升高，影响奶牛体内三羧酸循环途径、磷酸戊糖途径、脂肪动员途径，并且基于奶牛原代肝细胞，本研究检测了GC水平的变化在不同程度上影响着GR和MR的转录水平，同时也影响着糖异生途径限速酶(PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2)的转录水平，并且得出了肝细胞GR、MR与糖异生限速酶(PC、PEPCK-C、PCK2、11茁-HSD1、11茁-HSD2)的转录水平具有显著正相关性的结论。因此根据皮尔森相关性结果推测，肝细胞糖异生受体与肝细胞糖异生限速酶之间可能存在如图4所示的代谢通路。此外，肝细胞糖异生限速酶之间也可能存在着一定的正相关性。注：Glucose：葡萄糖；Amino acid：氨基酸；Activation of adipogenesis：脂肪形成的激活；GC：糖皮质激素；GR：糖皮质激素受体；MR：盐皮质激素受体；Cortisone：皮质酮；Fatty acids acetyation：脂肪酸乙酰化反应；Amino acids nucleotides：氨基酸核苷酸氨基酸核苷酸；Glutamine：谷氨酰胺；Acetyl-CoA：乙酰辅酶A；pyruvate：丙酮酸；Alanine：丙氨酸。实线表示已有的代谢通路，虚线表示本研究鉴定的代谢通路The solid line represents the existing metabolic pathways,while the dashed line represents the metabolic pathways validated in this study图4肝细胞GR及糖异生相关基因的代谢通路图GlutamineLactate H+Acetyl-CoAcitAmino acidsOAAOAAGlucoseMalNADHGCGR,MRNADHNAD+AspTCACycleFADH2G6PFBPF6PG3PPEPCortisoneAlanine