牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202301010牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究王天硕，于思雯，毕栏，赵鹏宇，蒋凯，肖佳薇，郭东华*(黑龙江八一农垦大学动物科技学院 农业农村部东北寒区牛病防治重点实验室，黑龙江 大庆 163000)摘要：为探究牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)增殖和自噬的影响，本研究将牛坏死杆菌A25株以MOI 10感染RAW264.7细胞作为实验组，以未感染的RAW264.7细胞作为对照组。分别于感染后1 h、2 h、4 h收集细胞，采用EdU和MDC染色法观察细胞荧光，并计算各组细胞增殖率及细胞自噬小体的数量。EdU染色法观察可见，各实验组随着感染时间的延长，绿色荧光的量逐渐减少，对照细胞绿色荧光的量基本无变化，且与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组细胞增殖率均极显著降低(0.05)；MDC染色法观察结果可见，与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组细胞中的绿色荧光逐渐增强，且随着感染时间的延长，细胞中自噬小体的数量与对照组相比均极显著增多(0.01)。上述结果表明，牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后抑制细胞的增殖，并且诱导该细胞发生自噬。分别采用荧光定量PCR(RT-qPCR)和western blot检测上述各组细胞中自噬基因Beclin-1和P62 mRNA的相对转录水平及自噬蛋白LC3和P62的相对表达水平。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，感染1 h后RAW264.7细胞中Beclin-1基因mRNA的相对转录水平无显著变化；感染2 h和4 h时该基因mRNA的相对转录水平极显著升高(0.01)，P62基因mRNA的相对转录水平在不同感染时间均极显著降低(0.001)；western blot结果显示，与对照组相比，各实验组细胞中LC3-蛋白的表达量于不同感染时间均极显著升高(0.01)，P62蛋白的表达量于不同感染时间均极显著降低(0.001)。上述结果从自噬相关基因mRNA转录水平和其蛋白表达水平均证明牛坏死杆菌诱导RAW264.7细胞发生了自噬，首次证实牛坏死杆菌可以诱导RAW264.7细胞发生自噬，并且抑制该细胞的增殖，本研究为进一步探究牛坏死杆菌的感染机制奠定实验基础。关键词：牛坏死杆菌；小鼠巨噬细胞；自噬中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0936-06Preliminary exploration on the effect ofon the proliferation and autophagy to mouse macrophagesWANG Tian-shuo,YU Si-wen,BI Lan,ZHAO Peng-yu,JIANG Kai,XIAO Jia-wei,GUO Dong-hua*(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Key Laboratory of Bovine Disease Control in Northeast China Ministry of Agriculture and Rural affairs,Daqing 163000,China)Abstract:To investigate the effects ofon the proliferation and autophagy of mouse macrophagecell lines(RAW264.7 cells),the RAW264.7 cells were infected with(strain A25)at a multiplicity ofinfection(MOI)of 10 for 1 hour,2 hours and 4 hours as experimental group,RAW264.7 cells without any treatment were used asthe control group.The cell fluorescence was observed by EdU and MDC staining,and the cell proliferation rate and the number of收稿日期：2023-01-12基金项目：黑龙江省重点研发计划(GA21B004)作者简介：王天硕(1998-)，男，黑龙江绥化人，硕士研究生，主要从事牛坏死杆菌病发病机制及疫苗研究.*通信作者：E-mail：dh_*Corresponding authorautophagosomes in each group were calculated.EdU staining showed that the amount of green fluorescence decreased graduallywith the prolongation of infection time,but control cells green fluorescence did not change.Compared with the control group,thecell proliferation rate of the infection group significantly reduced with the prolongation of infection time(0.05).The results ofMDC staining showed that compared with the control group,the green fluorescence gradually increased with the prolongation ofinfection time in the infection group,and the number of autophagosomes increased significantly with the prolongation of infectiontime compared with the control group.The above results showed that the infection of RAW264.7 cells byinhibited its proliferation and induced autophagy.The transcription levels of autophagy genes Beclin-1 and P62 andthe relative expression levels of autophagy proteins LC3 and P62 in the above groups were detected by fluorescence quantitativePCR(RT-qPCR)and western blot.RT-qPCR results showed no significant change in the relative mRNA transcription level of theBeclin-1 gene at 1 hour after infection compared with the control group.The relative mRNA transcription level of this geneincreased significantly at 2 hours and 4 hours after infection(0.01),and the relative mRNA transcription level of P62 gene wassignificantly down-regulated at different infection times(0.001).Western blot results showed that compared with the controlgroup,the expression of LC3-protein was significantly increased at different infection times(0.01),and the expression of P62protein was significantly decreased at different infection times(0.001).The above results further demonstrated thatinducedautophagyinRAW264.7cellsatthemRNAandproteinexpressionlevelsofautophagy-related genes.This is also the first time thatcan induce autophagy in RAW264.7 cells.This study provides an experimental basis for exploring the infection mechanism of.Key words:;RAW264.7;autophagy坏死杆菌(，Fn)是一种革兰阴性，严格厌氧的多形性细菌，多呈杆状和长丝状1，主要分为两个亚种，.和.2。坏死杆菌可以引起犊牛的坏死性口炎3，牛、羊等反刍动物的肝脓肿和腐蹄病4-5。坏死杆菌还可以引起人的莱 米 尔 综 合 征(Lemierres syndrome，LS)，主要表现为咽炎和发热等临床症状6。自噬是一种由溶酶体介导的程序性细胞死亡方式，是细胞在损伤状态下自我分解细胞组分，以回收蛋白维持细胞所必须能量的一种保守过程。自噬是一种控制蛋白质和细胞器降解的保守进化过程，对细胞的生存、发展和体内的平衡至关重要7。通过该过程，在双层膜囊泡内包裹的物质会被运送到溶酶体并降解，这种与溶酶体结合的双层囊泡被称为自噬小体8。根据溶酶体降解底物的不同，细胞自噬被分为3种，包括大自噬、小自噬、分子伴侣自噬。大自噬是通过将细胞质中的可溶性蛋白质、完整的细胞器吞噬到自噬小体内，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，被溶酶体内的蛋白水解酶降解，大自噬在营养缺乏时被激活，在饥饿时，它是能量的主要来源；小自噬是通过溶酶体膜内陷将细胞质成分包裹，并被溶酶体内的蛋白水解酶降解；与大自噬和小自噬相比，分子伴侣自噬则是将底物蛋白直接通过溶酶体膜转运到溶酶体内，底物蛋白与伴侣蛋白形成分子伴侣复合物后被溶酶体膜蛋白识别，进而进入溶酶体内，并被溶酶体内的蛋白水解酶降解9。已有研究证实与Fn同菌属的具核梭杆菌通过激活苄氯素1(Beclin-1)诱导细胞自噬10-11。幽门螺杆菌通过调节氨基酸平衡，抑制mTOR复合物1(mTORC1)的活性，激活自噬相关蛋白1(ATG1)，从而诱导细胞自噬12。铜绿假单胞菌通过激活自噬相关蛋白5(ATG5)和自噬相关蛋白7(ATG7)诱导细胞自噬13。嗜肺军团菌通过自噬相关蛋白7(ATG7)与自噬相关蛋白LC3结合形成军团菌液泡后与内质网的囊泡结合，从而诱导细胞自噬14。但关于牛坏死杆菌是否能够诱导细胞自噬目前尚未见报道。因此，为了探究牛坏死杆菌感染后对细胞增殖的影响及是否会引起细胞自噬，本研究将牛坏死杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7后，分别通过EdU染色法和MDC染色法检测Fn感染细胞的增殖率和自噬，通过RT-qPCR和western blot分别检测自噬相关基因及蛋白的表达水平，为进一步开展坏死杆菌在细胞内的增殖及其自噬机制的相关研究提供参考依据。王天硕，等.牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究第9期9371材料与方法1.1主要实验材料牛坏死杆菌A25株购自美国ATCC公司；小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)细胞由黑龙江八一农垦大学兽医分子病理学实验室保存；DMEM高糖培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自WISENT公 司；BCA蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒 购 自Biosharp生 物 公 司；5-乙 炔 基-2-脱 氧 尿 苷(BeyoClickTMEdU-488)细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；单丹磺酰尸胺(MDC)细胞自噬染色检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗鼠LC3-多克隆抗体(pAb)、兔抗鼠P62单克隆抗体(MAb)、兔抗鼠GAPDH MAb、HRP标记的山羊抗兔IgG(IgG-HRP)、山羊抗鼠IgG-HRP均购自武汉三鹰生物科技有限公司。1.2牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞增殖率的EdU染色法检测将RAW264.7细胞于37、5%CO2培养至对数生长期时铺于24孔板内，将牛坏死杆菌以MOI 10感染细胞，分别于感染后1 h、2 h、4 h弃去培养基，PBS清洗3次，分别加入10滋mol/L的EdU工作液孵育2 h，采用4%的多聚甲醛固定细胞后PBS洗3次，加入反应液避光30 min，加入DAPI染核后封片，采用荧光显微镜观察增殖细胞(细胞核出现绿色荧光的细胞)。实验设未处理的RAW264.7细胞为对照组。采用Image J统计增殖的细胞和未增殖的细胞数(细胞核染成蓝色的细胞)，通过公式：增殖的细胞核数量/总细胞核的数量(未增殖的细胞核数量+增殖的细胞核数量)伊100%，计算细胞增殖率。1.3牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬的MDC染色法检测取1.2中分别感染1 h、2 h和4 h后的细胞，弃去培养基，1伊Wash buffer清洗3次，加入10滋L MDC染色液室温避光染色30 min，弃去染色液，1伊Wash buffer清洗3次，滴入抗荧光淬灭剂封片后采用荧光显微镜观察细胞自噬小体(出现绿色荧光的细胞)。实验设未处理的RAW264.7细胞为对照组。利用Image j软件统计自噬小体的数量。1.4牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬基因mRNA转录水平的RT-qPCR检测根据GenBank登录的自噬基因Beclin-1(56208)及P62(18412)由北京擎科生物公司设计并合成相应引物(表1)。分别收集上述牛坏死杆菌感染后1 h、2 h、4 h的RAW264.7细胞，采用试剂盒提取总RNA，反转为cDNA后作为模板，采用RT-qPCR检测细胞自噬基因Beclin-1和P62 mRNA的转录水平，以GAPDH基因作为内参。反应条件为9530 s，955 s，6030 s，40个循环；以2-驻驻CT法计算各基因的相对转录水平，引物序列见表1。1.5牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬蛋白LC3-II和P62表达水平的western blot 检测分别收 集 上 述 牛 坏 死 杆 菌 感 染 后1 h、2 h、4 h的RAW264.7细胞，加入适量的NP40裂解细胞，收集细胞裂解液至1.5 mL离心管中，4孵育30 min后，412 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度后，分别以兔抗鼠LC3-IIpAb(1颐1000)、兔抗鼠P62 MAb(1颐10 000)、兔抗鼠GAPDH MAb(1颐80 000)为一抗，分别以山羊抗兔IgG-HRP(1颐8 000)、山羊抗鼠IgG-HRP(1颐8 000)为二抗，经western blot检测细胞自噬蛋白LC3-II和P62的表达水平。1.6统计学分析所有试验结果均以3次独立试验的平均值依标准方差(依)表示，采用GraphPad Prism 8分析各组实验数据。并采用GraphPad Prism 8中的Two-way ANOVA进行统计学分析，*：0.05表示差异显著；*：0.01、*：0.001均表示差异极显著。2结果2.1牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞增殖率的 EdU 染 色 法 检 测 结 果为 研 究 牛 坏 死 杆 菌 对RAW264.7细胞增殖的影响，将其感染RAW264.7细胞1 h、2 h、4 h后，分别采用EdU染色法检测细胞增殖率，结果显示，随着感染时间的延长，感染细胞中绿色荧光的量逐渐减少，对照组细胞绿色荧光的量基本无变化(图1A)；通过公式计算细胞的增殖率，结果显示，随着感染时间的延长，感染细胞的增殖率均极显著低于对照组细胞(0.01)(图1B)。表明牛坏死杆菌抑制RAW264.7细胞的增殖。表1引物序列引物名称Primer nameBeclin-1P62GAPDH上游引物序列(5-3)Forward primer sequenceAGGCAGTGGCGGCTCCTATTCCAACTCCGACTCCTGACCCTCGTGCCTGGAGAAACCTG下游引物序列(5-3)Reverse primer sequenceTGAGGACACCCAGGCAAGACCCCTGGCTCTGATGTGTCATTTCTAGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG中 国 预 防 兽 医 学 报2023年9382.2牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬的MDC染色法检 测结果为了研究牛坏死 杆 菌 对RAW264.7细胞自噬的影响，通过MDC染色法检测各时间点感染细胞，结果显示，与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组细胞中的绿色荧光逐渐增强，荧光数量逐渐增多，细胞质内形成了自噬小体(图2A)；利用Image J统计自噬小体的数量，结果显示，随着感染时间的延长，感染组细胞中自噬小体的数量逐渐增多，且与对照组相比差异均极显著(0.05)，感染2h和4 h时Beclin-1 mRNA的相对转录水平均极显著升高(0.01)(图3A)；感染后RAW264.7细胞中不同时间P62基因mRNA的相对转录水平均极显著降低(0.001)，其中感染后2 h P62基因mRNA的相对转录水平最低(图3B)。进一步表明牛坏死杆菌诱导RAW264.7细胞发生了自噬。王天硕，等.牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究第9期939Compared with the control group,*:0.05;*:0.01.The same as below.图1牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后EdU染色的荧光观察(A)及细胞增殖率的统计结果(B)1 hour2 hours4 hoursControl group Infection groupA6040200421Time/hourControl groupInfection groupBBA20151050*:0.001,the same as below.Time/hourControl1 hour2 hours4 hours图3牛坏死杆菌感染后RAW264.7细胞自噬基因Beclin-1(A)及P62(B)转录水平的RT-qPCR检测结果Time/hourTime/hourControl124Control1242.01.51.00.501.51.00.50ABA：MDC染色后细胞自噬的荧光观察；B：自噬小体数量的统计结果A:Autophagy was detected by MDC;B:Statistical results of the number of autophagosomes图2牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬的MDC染色法检测结果2.4牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后细胞自噬蛋白LC3-II与P62表达水平的western blot检测结果裂解感染后不同时间点的RAW264.7细胞并离心后，取上清利用western blot检测自噬蛋白LC3-II和P62蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，感染组细胞中LC3-II蛋白的表达量随感染时间的延长均极显著升高(0.01)，而LC3-I蛋白仅在感染后4 h才有表达(图4A、图4B)；P62蛋白的表达量则随感染时间的延长均极显著降低(0.001)(图4A、图4C)。进一步从蛋白水平表明牛坏死杆菌诱导RAW264.7细胞发生了自噬。3讨论坏死杆菌是一种革兰染色呈阴性的多形性厌氧杆菌，主要引起机体坏死性以及化脓性感染，当病原菌感染后，自噬作为宿主细胞抵抗病原菌的第一道防线，与其的天然免疫系统协同作用，共同抵御细菌的侵入。另外，当病原菌感染时还可以通过细胞自噬促进细菌的增殖或抑制细胞的增殖。研究发现绵羊肺炎支原体可诱导小鼠肺脏上皮细胞发生自噬，并清除绵羊肺炎支原体15。金黄色葡萄球菌通过阻断自噬小体与溶酶体的融合在细胞内增殖16，沙门氏菌感染后诱导的细胞自噬既能将其清除，又能促进其的增殖加重感染17。布鲁氏菌感染时诱导的细胞自噬能够杀灭部分布鲁氏菌，但不能完全将布鲁氏菌清除18。但关于牛坏死杆菌诱导细胞自噬的相关研究尚无报道。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可以将增殖的细胞核染成绿色，而DAPI可将未增殖的细胞核染成蓝色，通过增殖的细胞核数量/总细胞核数量伊100%即可以计算细胞增殖率19。因此，本研究采用EdU染色法检测牛Fn感染RAW264.7细胞后不同时间细胞的增殖情况，结果显示，Fn以时间依赖性抑制RAW264.7细胞的增殖。MDC是一种嗜酸性的荧光染色剂，是检测细胞自噬的常用标记染色剂20，本研究采用MDC染色法检测细胞的自噬，结果与对照组相比，随着感染时间的延长，感染牛坏死杆菌细胞的绿色荧光逐渐增强，且自噬小体的数量逐渐增多。表明牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后诱导了细胞自噬。LC3蛋白是一种泛素化蛋白，起初以一种非加工的形式(LC3前体)合成，在合成后会被自噬相关蛋白4(ATG4)加工处理为LC3-I，随后LC3-I会在自噬相关 蛋 白 的 作 用 下 与 磷 脂 酰 乙 醇 胺(PE)结 合 形 成LC3-II。LC3-II是唯一与自噬小体相关的蛋白标志物21。当细胞发生自噬时，自噬相关蛋白LC3-II表达量上调22。另一种被广泛使用的自噬标记物SQSTM1/P62，简称为P62。P62蛋白通过与LC3蛋白的相互结合后完整的进入自噬小体，并在自噬溶酶体内降解。当细胞自噬被抑制时，p62的表达量增加，而当细胞发生自噬时，p62的表达量降低22。Beclin-1是一种自噬相关基因，在自噬过程中起核心作用，参与自噬的起始23。自噬发生时该基因转录水平上调22。因此通A：自噬蛋白LC3-II与P62表达的western blot鉴定；B：自噬蛋白LC3-II与P62的灰度值分析A:Identification for the expression of autophagy protein LC3-II andP62 by western blot;B:Greyscale value analysis of autophagy proteins LC3-II and P62图4牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后自噬蛋白LC3-II与P62表达水平的western blot 检测结果Time/hourTime/hourControl124Control 1240.80.60.40.201.51.00.50Control1 hour2 hours4 hours18ku14ku62ku36kuLC3-ILC3-IIP62GAPDHABC*中 国 预 防 兽 医 学 报2023年940123456789101112131415161718王天硕，等.牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究第9期941过检测LC3与P62基因mRNA的转录和蛋白表达量的变化可以了解细胞自噬的情况。细胞发生自噬时，自噬相关蛋白在控制病原菌感染的过程中发挥重要作用24-25。因此，本研究从上述自噬相关基因mRNA和蛋白水平进一步验证牛坏死杆菌诱导细胞发生了自噬。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，感染后1 h Beclin-1基因mRNA的相对转录水平无显著变化；感染2 h和4 h时Beclin-1基因mRNA的相对转录水平极显著上升，P62 mRNA基因的相对转录水平在不同感染时间均极显著降低。Western blot结果显示，与对照组相比，LC3-II蛋白的表达量在不同感染时间均极显著升高，虽然在牛坏死杆菌感染后4 h细胞中LC3-I蛋白也有表达，但此时LC3-II的表达量仍极显著多于对照组。P62蛋白的表达量在不同感染时间点均极显著降低。本研究结果进一步印证了先前关于自噬的研究结果21-25。提示牛坏死杆菌感染诱导RAW264.7细胞发生了大自噬。自噬是机体免疫反应的一把“双刃剑”，一方面自噬作为机体免疫反应的一部分对多种病原菌具有清除作用，即大部分病原菌能够通过自噬直接杀灭或通过机体的先天免疫反应被间接杀灭，另一方面有一些病原菌则是通过细胞自噬逃避宿主的免疫反应26。本研究上述结果表明牛坏死杆菌可以诱导RAW264.7细胞发生自噬，那么牛坏死杆菌是通过细胞自噬逃避宿主的免疫反应还是通过自噬清除有待深入研究。综上所述，本研究结果表明牛坏死杆菌能够抑制RAW264.7细胞的增殖且诱导该细胞自噬，为牛坏死杆菌感染机制的研究提供实验数据，为厌氧菌感染的防控提供新思路。参考文献：LANGWORTH B F.:its character-istics and role as an animal pathogen J.Bacteriol Rev,1977,41(2):373-390.SHINJO T,FUJISAWA T,MITSUOKA T.Proposal of two sub-species of(Fl俟gge)Moore andHoldeman:.nov,nom.rev.(ex Fl俟gge 1886),and.nov,nom.rev.(exHall佴 1898)J.Syst Bacteriol,1991,41(3):395-397.ZHOU HUI-TONG,DOBBINSON S,HICKFORD J G.variants present on the hooves of lame pigs J.Vet Microbiol,2010,141(3-4):390.TADEPALLI S,NARAYANAN S K,STEWART G C,et al.:a ruminal bacterium that invadesliver to cause abscesses in cattle J.Anaerobe,2009,15(1-2):36-43.SHANTHALINGAM 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