低盐度处理水养殖对草鱼生长与肉质的影响_刘鼎瑞.pdf

书书书第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2023 01 15基金项目:广州市科技计划项目(202103000005)第一作者:刘鼎瑞，男，湖北武汉人，在读硕士研究生，研究方向为水生经济动物繁殖与育种。通信作者:张勇，男，江西抚州人，教授，博士，博士生导师，研究方向为水生经济动物繁殖与育种。低盐度处理水养殖对草鱼生长与肉质的影响刘鼎瑞1a，b，张卓为1a，b，杨佳雨1a，b，赵丹丹2，宋义昆1a，b，李美惠1a，b，林浩然1a，b，张勇1a，b(1 中山大学 a 生命科学学院;b 广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广州 510275;2 广州市诚一水产养殖有限公司，广州 510000)摘要:通过 2 ngL1和 0(CK)盐度处理养殖对草鱼(Ctenopharyngodon idella)生长与肉质的影响进行研究，结果显示，与 CK 相比，2 ngL1盐度处理水养殖对草鱼生长无显著影响，但草鱼肌肉硬度等品质指标显著上升。对草鱼肌肉进行转录组测序分析，得到 112 个差异表达基因，其中 18 个基因表达上调，94 个基因表达下调。GO 数据库富集分析发现细胞骨架相关条目被富集，KEGG 数据库富集分析发现细胞外基质相关 KEGG 通路被富集。结合差异表达基因分析，在 2 ngL1盐度水处理下养殖的草鱼细胞外基质相关通路表达上调，胶原蛋白等细胞外基质合成增加，肌动蛋白等细胞骨架与细胞外基质的连接更加紧密，使草鱼肌肉强度韧性提升。Myod 和 myog 基因在咸淡水环境下表达上升，激活下游 myhc-4 等相关基因转录表达，提升了肌肉硬度，使肌肉更加紧致。关键词:草鱼;盐度;生长;肉质;转录组中图分类号:S917 4文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0001 09DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 010引言草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)雅罗鱼亚科(Leuciscinae)草鱼属(Ctenopharyngodon)，是我国养殖量最大的鱼类，也是国民消费量最大的鱼类1。2021 年，我国草鱼养殖产量达到 575 5 万 t2。但长期以来，由于养殖不规范，草鱼产业存在草鱼肠炎普遍、体型肥胖、味道差等问题3。随着人民生活水平的提高，对优质的草鱼需求越来越强烈。人们发现，投喂蚕豆可以使草鱼肉质更加紧实，这种方式养殖出的草鱼被称为脆肉鲩4。然而，长时间投喂蚕豆会导致草鱼肠道产生炎症，生长性能下降5，影响草鱼经济效益。因此，亟须探索更加可持续的方法来提升草鱼品质。养殖环境的盐度会影响鱼类的肉质和生长。适宜的盐度可以提升乌鳢(Channa argus)的肌肉品质，使乌鳢肌肉营养成分增加6。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)在适宜盐度下养殖 8 周后，其生长速度相对于淡水养殖更优而且肌肉品质得到提升 7，肌肉中氨基酸及不饱和脂肪酸含量与盐度呈正相关关系 8。研究发现，在草鱼上市前移入盐水中暂养一段时间，可有效地提升草鱼的品质。但在较高盐度(10 ngL1)下养殖会使草鱼肌肉水分含量显著增加，粗蛋白含量降低，增重率大幅下降9。鱼类在等渗点养殖时外界压力最小，摄食量最大，生长和转化效率最好，可将更多的能量转化为生长。广州市南沙区咸淡水交汇，养殖条件得天独厚，利用南沙天然生态滨海湿地因涨退潮产生的天然咸淡水，在海水和淡水反复变化的环境中，水体总体保持 2 ngL1的咸度，这样养出来的鲩鱼肉质鲜美紧实、没有泥尘味，深受大众喜爱。因此，本研究选择 2 ngL1盐度处理水养殖条件下对草鱼生长性能和肌肉品质，以及草鱼肌肉品质的分子机制进行转录组分析，研究结果为草鱼咸淡水养殖以及草鱼肌肉品质提升提供参考。1第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报1 材料与方法1 1 材料本试验中草鱼来自广州市诚一水产养殖有限公司。选取体质健康、规格相同的草鱼幼鱼放到暂养养殖池中，初始体质量为(46 14 1 66)g，平均体长为(13 87 0 86)cm。草鱼幼鱼暂养期间与后期养殖实验期间的养殖用水均为经过静置消毒过滤的水体。温度为 29 32。使用多参数水质检测仪(PT 001B)监测水质，并将其保持在合适的溶解氧，pH，总氨氮浓度，亚硝酸盐浓度。试验通过淡水和天然日晒海盐(中国莱州中翔盐业有限公司)混合配制成盐度的水体。草鱼幼鱼正常投喂，每天 2 次(07:00 和18:00)，投喂至明显饱足。1 2 方法1 2 1 试验处理将草鱼在直径1 5 m，桶深1 m 的养殖桶中养殖8 周，每个桶养殖30 条幼鱼，设置0(CK)和2 ngL1两种盐度处理，分别设置 3 个重复。试验期间监测每个水箱的水质，每天将养殖桶中 2/3 的水体用同等盐度的水体替换，保持水质稳定。每天 2 次(07:00 和 18:00)投喂商业颗粒饲料至明显饱足。养殖结束后，将草鱼幼鱼禁食 12 h 再进行取样。从每个养殖桶中选取 6 条鱼，使用 MS-222 麻醉并测量体质量，将草鱼背部皮肤剥开后使用质构仪检测肉质指标，剖取内脏团、肝脏、腹腔脂肪并称重。迅速取背部肌肉于冻存管中放入液氮，并于采样结束后转入 80 冰箱用于后续试验。1 2 2 数据统计草鱼生长数据指标需要公式进行计算，其计算公式为RSG=(ln mt ln m0)/t 100%，IVS=(mi/mt)100%，IHS=(ml/mt)100%，TFB=(mf/mt)100%，ICF=(mf/L3)100%，其中:RSG表示特定生长率，IVS表示脏体比，IHS表示肝体比，TFB表示脂体比，ICF表示肥满度;mt和 m0分别表示草鱼幼鱼的终末体质量和初始体质量(g)，t 为摄食持续时间(d)，L 为草鱼幼鱼体长(cm)，mi为内脏质量(g)，ml为肝脏质量(g)，mf为腹腔脂肪质量(g)。统计分析采用 SPSS for windows(release 21 0)软件，试验数据以平均值 标准差(mean SD)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)比较不同实验组间各参数的差异，采用 Duncan s 多重比较法检验试验组间的差异显著性，显著性水平为 0 05(P 0 05)。1 2 3 肉质指标测定使用 TA XT Express Connect 质构仪(texture technologies corp，美国)检测盐度为0 与2 ngL1组草鱼肌肉肉质指标。检测前将鱼击晕，将每尾鱼侧线上方鳃盖后缘至背鳍基部的鱼皮剥离，选取 5 个点进行检测。每组各随机抽取 6 尾鱼进行测试，取测试的平均值进行数据分析。1 2 4 cDNA 文库构建与转录组测序使用 TRIzol 法提取肌肉总 RNA。检测 RNA 质量与纯度，确定 RNA 质量合格后使用 NEBNext Ul-traTMRNA Library Prep Kit for Illumina 试剂盒构建 cDNA 文库，交由北京诺禾致源科技股份有限公司使用 Illumina Novaseq 平台进行测序。1 2 5 数据分析与功能注释测序完成后获得原始数据(raw reads)。对原始数据使用 in-house Perl 脚本进行质量控制，以获得干净数据(clean reads)。使用 Hisat2 v2 0 5 建立索引，并将 clean reads 与参考基因组进行比对。按照 Pertea等10 的方法，使用 StringTie(v1 3 3b)来组装比对后的数据。使用 DESeq2 R 包(1 16 1)分析差异表达基因(DEGs)。使用 Benjamini 和 Hochberg 方法调整 P 值以获得明显的差异性表达。使用 Cluster Profiler R2刘鼎瑞等:低盐度处理水养殖对草鱼生长与肉质的影响2023 年第 2 期包进行京都基因与基因组百科全书(KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和基因本体(GO:Gene Ontology)富集分析。1 2 6 实时荧光定量 PCR 检测选取 6 个差异表达基因(4 个上调，2 个下调)验证转录组测序数据的可靠性。使用引物设计软件Primer premier 5 设计特定引物，表 1 为用于实时荧光定量 PCR(qPCR)的引物，分别选择成肌分化抗原(myod)，肌细胞生成素(myog)，生肌调节因子(mrf-4)，肌球蛋白重链-7(myhc-7)，肌球蛋白重链-4(myhc-4)和肌肉生长抑制素(mstn)等进行引物设计，其扩增效率均为 90%100%。使用 TRIzol 法提取 1 2 1 中获得的草鱼肌肉总 RNA。确定 RNA 质量合格后使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit(TOYOBO)合成第一链 cDNA。按照说明书使用 SYBR Green IMaster Mix(Roche)，在 Roche LightCycler 480 实时 PCR 系统上进行实时定量 PCR(qPCR)分析。PCR 条件如下:95 10 min，再进行 40 个循环，95 10 s，60 20 s，72 20 s。选择-actin 作为内参基因，使用2 CT法计算基因的相对表达量。表 1引物序列基因引物序列(5 3)myod-FTTCTACGACGACCCTTGCmyod-RGTCAGCGTTGGTTGTTTTmyog-FACGAAGGCGGCGATAACTmyog-RTGCTGCTGCTCCTGGTGAmrf4-FTCGCTCCTGTATTGATGTTGATGAmrf4-RGCTCCTGTCTCGCATTCGTTMyhc4-FCCCAGAGTGAAGGTCGGAAATMyhc4-RTACGGACAACCATCCACAAGAAMyhc7-FTATCGCATCTTAAACCCTMyhc7-RCTCTGCTCCTTTCTTGCTmstn-FTGTGGTCCAGTGGGTAATmstn-RGTTTGAGTCGGAGTTTGC-actin-FGGCTGTGCTGTCCCTGTA-actin-RGGGCATAACCCTCGTAGAT2 结果与分析2 1 生长结果在不同盐度(0，2 ngL1)下养殖 8 周后，测量草鱼体质量，剖取内脏团、肝脏、腹腔脂肪并称重(图1)。CK 组的草鱼末体质量为(113 06 29 23)g，在处理组(2 ngL1)下养殖的草鱼末体质量为(110 48 27 68)g。处理组(2 ngL1)与 CK 组草鱼相比，末体质量无显著性差异(P 0 05)。如图 2所示，CK 组草鱼的肥满度为 1 90 0 11，肝体比为 1 47 0 20，脏体比为 7 23 0 58，脂体比为 1 20 0 32，特定生长率为 1 71 0 06。处理组(2 ngL1)草鱼的肥满度为 1 90 0 09，肝体比为 1 51 0 23，脏体比为 6 85 0 74，脂体比为 1 18 0 40，特定生长率为 1 64 0 11。处理组(2 ngL1)与 CK组草鱼相比，各生长数据无显著性差异(P 0 05)。结果表明，草鱼可以适应 2 ngL1盐度水养殖，草鱼的生长性能不会受到显著影响。3第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报150末均体质量/g100500CK2 ng L-1处理肥满度肝体比脏体比脂体比 特定生长率处理生长数据/%10864202 ng L-1CK图 1对照组与处理组草鱼末均体质量对比图 2对照组与处理组草鱼生长数据比较2 2 肉质指标结果使用质构仪对处理组与 CK 组草鱼的肌肉进行检测。如图 3 显示，在处理组(2 ngL1)下养殖 2 个月后，草鱼肌肉的粘度显著下降(P 0 05)，弹性显著下降(P 0 01)。而处理组草鱼肌肉的黏性(P 0 001)，粘结性(P 0 01)，硬度(P 0 01)和咀嚼度(P 0 001)则显著高于 CK 组草鱼。2 ng L-12 ng L-1处理CK处理CK粘度/（gf mm）黏性/gf10864201 0008006004002000(a)对照组与处理组草鱼肌肉粘度对比(b)对照组与处理组草鱼肌肉粘性对比粘结性/N0.80.60.40.20硬度/gf1 5001 0005000处理CK2 ng L-1处理CK2 ng L-1(c)对照组与处理组草鱼肌肉粘结性对比(d)对照组与处理组草鱼肌肉硬度对比处理CK处理CK2 ng L-12 ng L-1弹性/mm2.52.01.51.00.50咀嚼度/gf0200400600800(e)对照组与处理组草鱼肌肉弹性对比(d)对照组与处理组草鱼肌肉咀嚼度对比*表示 P 0 05;表示 P 0 01;表示 P 0 001。图 3对照组与处理组草鱼肌肉品质比较注:使用非配对 t 检验统计显著性差异。4刘鼎瑞等:低盐度处理水养殖对草鱼生长与肉质的影响2023 年第 2 期2 3 差异表达基因(DEGs)结果转录组测序数据使用 R 包 deseq2 获得 CK 组与处理组草鱼肌肉的差异表达基因(DEGs)。以差异表达倍数(FC，记为 FC)的对数值|log2FC|2 和 Padj0 05(Padj表示修正过的 P 值)为筛选条件选择表达差异显著的基因。如图 4 显示，处理组与 CK 组相比，共有 112 个差异表达基因。相较于 CK 组，处理组草鱼肌肉共有 18 个基因表达上调，94 个基因表达下调。上调基因（18 个）下调基因（94 个）未改变基因（23 997 个）-24-13-1 110221.3012468-lg（Padi）log2FC图 4对照组与处理组草鱼肌肉的差异表达基因火山图2 4 差异表达基因 GO 功能富集结果使用基因本体(GO:Gene ontology)数据库对处理组与 CK 组草鱼肌肉的差异表达基因进行富集分析。差异表达基因被富集至细胞组分(Cellular component，CC)以及分子功能(Molecular function，MF)2 个类别(图 5)。在细胞组分类别中，细胞骨架(GO:0005856)、无膜细胞器(GO:0043228)、肌动蛋白骨架(GO:0015629)等条目被富集。在分子功能类别中，嘌呤核酸结合(GO:0017076)、蛋白质结合(GO:0005515)、水解酶活性(GO:0016787)、焦磷酸酶活性(GO:0016462)等条目被富集。5第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报0.40.30.20.10细胞骨架无膜细胞器胞内无膜细胞器细胞器胞内细胞器细胞内部分细胞内细胞细胞部分肥肉动蛋白细胞骨架分子结构活性ATP结合腺嘌呤核苷酸结合腺嘌呤核糖核苷酸结合药物结合嘌呤核苷酸结合核糖核苷酸结合嘌呤核糖核苷酸结合嘌呤核糖核苷三磷酸结合核苷酸结合GO 条目22222222211111111111-lg（Padi）柱形图上数字为差异表达基因数量。图 5对照组与处理组草鱼肌肉的 GO 富集结果2 5 差异表达基因 KEGG 数据库注释结果使用京都基因与基因组百科全书(KEGG:Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库对处理组与CK 组草鱼肌肉的差异表达基因进行富集分析。KEGG 共富集得到 54 条通路(图 6)。细胞外基质 受体交互、黏着斑、精氨酸的生物合成等 KEGG 通路被富集。其中细胞外基质 受体交互被显著富集。1.51.00.50ECM-受体相互作用2-lg（Padi）氮素代谢黏着斑精氨酸生物合成氨基酸生物合成乙醛酸和二羧酸代谢淀粉和蔗糖代谢果糖和露糖代谢精氨和脯氨酸代谢MAPK信号通路脂肪细胞因子信号通路Tol一样受体信号通路戊糖磷酸途径半乳糖代谢用于lgA产生的肠道免疫网络C型凝集素受体信号通路碳代谢卟啉和叶绿素代谢心肌收缩丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢GO 条目5623222252211122211柱形图上数字为差异表达基因数量。图 6对照组与处理组草鱼肌肉的 KEGG 富集结果6刘鼎瑞等:低盐度处理水养殖对草鱼生长与肉质的影响2023 年第 2 期2 6 实时荧光定量 PCR 结果为验证转录组测序结果，选择草鱼肌肉的成肌分化抗原(myod)，肌细胞生成素(myog)，肌肉调节因子(mrf-4)，肌球蛋白重链-7(myhc-7)，肌球蛋白重链-4(myhc-4)和肌肉生长抑制素(mstn)的基因进行实时荧光定量 PCR 验证。结果显示，CK 组与处理组样品实时荧光定量 PCR 表达趋势与转录组测序结果一致(图 7)，表明转录组测序结果准确可靠。5差异倍数105-5-10基因名称myodmyhc-7myogmstnmrf-4myhc-4qPCRRNA-Seq图 7DEGs 的 qPCR 结果3 讨论盐度是一种重要的环境因子，水体中盐度的变化会对鱼类的渗透压调节，生理生化以及生长造成影响11。盐度也会影响鱼类的肉质，大口黑鲈(Micropterus salmoides)在一定盐度下(0，0 3 ngL1，0 9 ngL1)养殖 10 周后，肌肉的系水力，硬度和咀嚼度上升，肌肉品质得到提升12。但李小勤等13 发现，在 10 ngL1的半咸水环境下养殖草鱼会使草鱼的生长性能下降且肌肉水分含量显著增加，粗蛋白含量降低。鱼体的生长受到生长激素(GH)/类胰岛素生长因子(IGF)轴的调控14，外界环境因素会影响鱼类生长激素分泌15。本研究发现，在 2 ngL1盐度水环境下，草鱼的末体质量与淡水养殖相比无显著性差异，而且肥满度，肝体比，脏体比，脂体比和特定生长率均无显著差异，说明低盐度咸淡水养殖草鱼不会影响其生长性能。硬度等质构数值是评价鱼类品质的关键指标16。与淡水养殖草鱼相比，低盐度咸淡水养殖草鱼肌肉的硬度显著高于淡水养殖草鱼，且咀嚼度，粘结性等均得到显著提升，表明低盐度咸淡水养殖下草鱼品质得到提升。低盐度咸淡水养殖与淡水养殖草鱼相比，肌肉共有 112 个基因差异表达。低盐度组草鱼肌肉共有 18 个基因表达上调，94 个基因表达下调。使用 GO 数据库富集分析发现，细胞骨架，肌动蛋白骨架等细胞骨架相关条目被富集。使用 KEGG 数据库富集分析，细胞外基质 受体交互、黏着斑等细胞外基质相关 KEGG 通路被富集，其中细胞外基质 受体交互被显著富集。结果表明，在低盐度咸淡水养殖后，草鱼肌肉的细胞外基质与受体的交互更加紧密，草鱼肌肉细胞外基质含量增加。鱼的骨骼肌是鱼类的主要食用部位，由多条肌纤维组合成束形成，肌纤维间存在结缔组织填充17。结缔组织中的主要成分为胶原蛋白，是细胞外基质(ECM)中一种重要的结构蛋白，具有很高的拉伸强度，为细胞外基质附于强度和韧性18。研究表明，胶原蛋白与鱼类肌肉硬度呈正相关关系19。黏着斑即细胞外基质与细胞的肌动蛋白细胞骨架形成的连接，可以在细胞面对机械力时维持细胞形态，稳定细胞结构20。KEGG 富集结果显示草鱼在低盐度养殖下肌肉细胞外基质 受体交互、黏着斑等细胞外基质相关7第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报KEGG 通路被富集，其中细胞外基质 受体交互被显著富集。结果说明低盐度养殖使草鱼的胶原合成增加，肌肉细胞连接紧密，黏着斑增加，细胞与细胞外基质之间的连接加强，为肌肉带来更高强度与韧性，从而反映在低盐度养殖草鱼肌肉硬度增加，肉质紧实。myhc 基因家族的表达与鱼类的肉质密切相关，myhc-7 的表达与肌肉硬度呈负相关，myhc-4 的表达与肌肉硬度呈正相关21。在低盐度咸淡水养殖中，肌球蛋白重链-4(myhc-4)表达上调，肌球蛋白重链-7(myhc-7)表达下调，这与前人的研究结果一致22。肌分化抗原(myod)和肌细胞生成素(myog)的表达上调，myhc 基因家族的表达受 myod 和 myog 的调控23，myod 可通过激活 myhc-4 的转录。myog 基因与肌管的生长和融合密切相关24，参与肌肉纤维肥大25。本研究结果表明，在咸淡水养殖环境中，草鱼肌肉中myog 与 myod 基因表达上调激活下游相应 myhc 家族基因的转录使得草鱼肌纤维肥大，使草鱼肌肉硬度增加。参考文献:1张四明，邓怀，汪登强，等 长江水系鲢和草鱼遗传结构及变异性的 RAPD 研究 J 水生生物学报，2001(4):324 2国家大宗淡水鱼产业技术体系 草鱼产业发展报告 J 中国水产，2021(2):27 3关磊，朱瑞俊，李小勤，等 普通草鱼与脆化草鱼的肌肉特性比较 J 上海海洋大学学报，2011(5):748 4肖调义，刘建波，陈清华，等 脆肉鲩肌肉营养特性分析 J 淡水渔业，2004(3):28 5吴康，黄晓声，金洁南，等 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P S Function of the myogenic regulatory factors Myf5，MyoD，Myogenin and MRF4 in skeletal muscle，satellite cellsandregenerative myogenesis J Seminars in cell developmental biology，2017(72):19 25EKMARK M，RANA Z A，STEWERT G，et al Dephosphorylation of MyoD is linking nerve-evoked activity to fast myosinheavychain expression in rodent adult skeletal muscle J The Journal of physiology，2007(584):37(责任编辑:白净)Effects of Low Salinity Treatment Water on Growth andMeat Quality of Grass CarpLIU Dingrui1a，b，ZHANG Zhuowei1a，b，YANG Jiayu1a，b，ZHAO Dandan2，SONG Yikun1a，b，LI Meihui1a，b，LIN Haoran1a，b，ZHANG Yong1a，b(1 a School of Life Sciences;b Guangdong Provincial Key Laboratory forAquatic Economic Animals，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China;2 Guangzhou Chengyi Aquaculture Co Ltd，Guangzhou 510000，China)Abstract:The effects of 2 ngL1and 0(CK)water on the growth and meat quality of grass carp(Ctenopharyngodon idella)andtheir mechanism were investigated The results showed that there was no significant difference of the effect on the growth betweengrass carp from CK and 2 ngL1 However，the muscle quality indexes such as muscle hardness of grass carp cultured in 2 ngL1increased significantly Transcriptome sequencing analysis of grass carp muscle yielded 112 different expression genes(DEGs)，ofwhich 18 genes were up-regulated and 94 genes were down-regulated GO database enrichment analysis revealed that cytoskeleton-re-lated entries were enriched，and KEGG database enrichment analysis revealed that extracellular matrix-related KEGG pathway was en-riched Combined with the DEGs，the expression of extracellular matrix-related pathways was up-regulated in grass carp cultured inbrackish water，and the synthesis of extracellular matrix such as collagen was increased Meanwhile，the connection between cytoskele-ton and extracellular matrix such as actin was tightened，as a result，muscle hardness was enhanced and the muscle was firmer Theexpression of myod and myog genes in grass carp was up-regulated in low salinity brackish water and freshwater，which activated thetranscriptional expression of downstream myhc-4 and other related genes，resulting in enhanced muscle hardness in grass carpKeywords:grass carp;salinity;growth;flesh quality;transcriptome9