土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性影响的研究.doc

土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性影响的研究 作者： 日期：17 个人收集整理 勿做商业用途土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性影响的研究一、 课题背景及目的在当代，人类对资源开发利用包括矿业开采等生产活动不断扩大，其作为一种经济增长的一种重要手段，也引起了一系列经济、社会、环境等问题，不利于可持续发展战略.人类活动及随后产生的废气物随意排放，不仅破坏和占用了大量土地资源,同时也带来了一系列的环境问题如空气、地表水、地下水及土壤的质量下降，生态系统和景观受破坏，生物多样性丧失,农作物减产等。这不仅制约了国民经济的发展、加剧了人与自然的矛盾、破坏了人们的身心健康，同时也不利于我国可持续发展战略的实施。本研究目的了解土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性的影响原理;掌握分析土壤理化性质、酶学性质、微生物量的能力。二、 本课题研究的技术文献调研土壤处理基质样本的采集优势植物样本采集理化性质分析酶学性质分析微生物量测定植物适应性评价基质理化性质和生物学性质变化植物与基质性质关系分析植物培养植物样本室内分析三、具体实验步骤1。具体实验操作1.1从农田中取一定重量（50kg）的土壤，可选中一定区域,均匀设置取样点，取土深度保持一致,记录取样地点，时间等；1.2风干后用2mm孔径的筛子进行过筛；1。3对剩余土壤进行称重（此时剩余土壤总重量50kg）；1。4取土壤50kg将土壤平均分成5组；1.5除对照组外,其余4组,分别与不同浓度梯度的CuSO4溶液混匀（Cu2+浓度梯度为0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg），再将混匀后的土壤平均分成5份;1。6将这25份土壤装盆，在室内放置一周，并保持湿润；1.7播种，每个盆中均匀种入油菜种子约30颗；1.8植物生长过程中,保持各组生长条件一致，一定时间进行浇水，等到盆中油菜长出第二片真叶，进行定植，每盆中保留58株植物；在这期间，定期对植物株高、叶片大小进行测量,记下数据；1。9植物生长一个半月后对植物以及土壤中的微生物和酶活性进行测定。2。样本室内分析2.1。土壤中酶活性的测定实验中土壤酶的测定方法如下2.1。1土壤转化酶活性的测定比色法2.1.1.1试剂配制(1）3,5二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL(不超过7天）。(2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠(23。876g磷酸氢二钠。12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾(9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9。5mL即成。（3）8%蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中（4）甲苯（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中,即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL)。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0。5mg/mL)。2。1。1.2操作步骤称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL 8%蔗糖溶液，5mL pH 5。5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中,加3mL3，5二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3氨基-5硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中,并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。2。1。1。3结果计算以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性(Suc）：SucaVn/m式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度(mg/mL）；V为显色液体积(50mL）；n为分取倍数;m为烘干土重（g）.2.1.2土壤过氧化氢酶活性的测定KMnO4滴定法称取5g新鲜土壤于100ml三角瓶中.加甲苯0。5ml，摇匀，于04冰箱放置半小时.取出。立刻加入25ml冰箱储存的含3 H2O2的水溶液。充分摇匀后，再放置0-4冰箱半小时。取出立即加入2N H2SO425ml，摇匀，过滤。取1ml滤液，加1N H2SO44ml，用0.1N KMnO4滴定。按此操作，用不加土壤的基质作对照测定，并根据对照和试样0.1N KMnO4的滴定，求出相当分解的H2O2的量的0。1N KMnO4消耗值。2。1。3土壤脲酶活性测定苯酚次氯酸钠比色法2。1.3.1试剂配制：（1） pH6。7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6。7，并用水稀释至2L。（2） 苯酚钠溶液：称取62。5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18。5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液),保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中.使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用.（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0。9%，溶液稳定。（4） 10尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5） N的标准溶液:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2。1.3。2操作步骤称取5土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15;往瓶中加入5mL10尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(6.7）,仔细混匀。在37恒温箱中培养24.然后用热至38的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上），摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL，然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20后,将混合物稀释至刻度，在波长578处测定吸光值.脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制：称取0.4717g硫酸铵溶于水中，稀释至1L,则得1ml含100ug氮的标准溶液，绘制标准曲线时再稀释10倍使用。分别吸取010ml经稀释的标准溶液于50ml的容量瓶中,用蒸馏水加至10ml。然后加入4ml苯酚钠溶液,立即加入3ml次氯酸钠溶液，充分摇匀，放置20min.显色后稀释至刻度，用1cm液槽，在比色计上于578nm处测定颜色深度。以光密度值,对浓度绘制成标准曲线。2.1.3.3结果计算以24小时后1g土壤中NH3N的质量(mg)表示脲酶活性（Ure）UreaVn/m式中：a为由标准曲线求得的NH3N浓度(mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重(g）。2。2土壤中微生物量和呼吸作用的测定2。2。1微生物量C-熏蒸浸提法将经去除细根、杂质的新鲜土样，放入28恒温培养箱中预培养7天后。称取25g（精确至0.0001）尾矿于培养皿中，将培养皿和盛有50 ml氯仿和50 ml 1 M NaOH的烧杯同时置入干燥器,用真空泵抽至氯仿沸腾并保持2 min，后密封置于28恒温培养箱中熏蒸24h，熏蒸结束后，取出氯仿和 NaOH,用真空泵反复抽气直至土壤无氯仿味后。取出培养皿将土壤转入250ml三角瓶中,加入100ml 0。5molL-1K2SO4在振荡器中振荡0。5h,转速180 rpm.取出迅速用无灰分滤纸过滤,滤液用于微生物量C、N的测定;同时做未熏蒸处理，取25g（精确至0。0001）相同土壤，直接加入100ml 0。5molL1K2SO4在振荡器中振荡0.5h，转速180 rpm。取出迅速用无灰分滤纸过滤,滤液待测。微生物量C的测定方法:取8ml上述滤液,加入0。067M的重铬酸钾2ml,加入70mg氧化汞和浓硫酸、浓磷酸混合液(V硫：V磷=2：1）15ml。在170下回流冷凝0.5h，最后用标定的硫酸亚铁铵溶液来滴定反应液,同时做未熏蒸和蒸馏水空白对照2.2.2呼吸作用的测定-氢氧化钠吸收法称取约30g左右的新鲜尾矿（相当于风干土25g）放入1000ml的广口瓶中，在一离心管中加入25ml 0。1 molL-1NaOH将其吊在光口瓶塞得下方，塞紧瓶塞（注意NaOH不能与尾矿接触），并做几个无土对照。将其一并放入37恒温培养箱培养培养24h，将离心管取出迅速用硼砂标定过的0。1 molL1HCl进行滴定。最后用空白消耗的HCl体积与样品消耗的HCl体积差来计算土壤呼吸作用。2.3。植物中金属含量测定2。3。1 植物金属含量测定待测液的制备：称取磨细烘干的植物样品1.0000g,置于150ml三角瓶中，先用少许水润湿，加入5ml酸混合液（V浓硝酸：V浓硫酸：V高氯酸=8：1：1）浓硫酸浸泡过夜。次日在瓶口放一弯颈漏斗，在电热板上先低温缓慢加热40min后，逐渐提高温度待植物样品大部分变白后高温消煮，待高氯酸分解冒白色浓烟后23min分解完全，此时三角瓶中硫酸冷凝回流，冒缕状白烟，溶液呈亮清色。取下三角瓶，冷却后用10HCl洗涤小漏斗，将洗涤液和消煮液一并转入50ml容量瓶中。待测。测定用ICP进行。四、数据处理油菜在不同浓度的铜离子下的生长情况油菜茎长（平均值）单位:cm样本编号第一个星期第二个星期第三个星期第四个星期第五个星期第六个星期第七个星期0-12.32。42。833.13。13。10-22。22.52。73。13。23。23.2032。32。42.73。23。43.43.40-42.12.32。633。33。43。5052。22.32。53.23。23.33。350-122.22。63。23.43.53。550-22.22。32.53.43。53.53.550-32。32.42。73。33.53.63。65042。22.52.83。43.53.53.550-52.32。42.73。23.43.53。510012。42。62.83.53。63.73.7100-22.32.52.83。43。53。53.510032.22.42.63.33.53。63.610042.42。52。83.23。43。53.610052。32。42.73。33.43。53.5150-12。42。52.73.43.53。53.5150-22.22。42。73。53。53。63.615032。32.42.83.53.53。63。6150-42。32。52.93.23。63。63.6150-52.42.52。93.33.53.63.620012。12。32。53。23.43.53.520022。22。32.63。23.33.33.3200322.12.53.13.23。23.2200-42.22。32.633。23.33。4200-52。12。22.433。13.13.2油菜叶片大小（平均值）单位：cm的平方样本编号第一个星期第二个星期第三个星期第四个星期第五个星期第六个星期第七个星期011。51。82.43。23。944.2021。41。92.43。53。73.84031。522。23.34。14.24。2041。22。12。333。83。93.90-51。42.12。53。63。63。73。850-11。322.43.63。83。8450-21.21。92。33.74.14.14。15031.31.62.13.53.63。73.95041.41。82.13。43.53.84。35051.31.92。33。53。83.84。4100-11。21.92。13.33。63.84.3100-21。42.22。33。43.73。84。2100-31。32.32.43.53.53。94.3100-41.42。22。33。53.63.94。1100-51.522.43。73.83.94。515011.32.12。53。73。73.94.6150-21。21。92。43。844.14。5150-31。21.92.333.64.14。415041.42.12。63。74。14。34.315051。422。73。83。94。44.4200-11.51。82。5444.34.320021。31.92.43。53。73.93.920031。422。53。43.944.1200-41.42。32.63.53。63.73.820051。51.82.53。33。63.83。8随着植物的增长，植物茎长增加植物叶片增大，从数据和图表中并不能明显看出植物在生长过程中受到抑制或是促进生长的作用：在研究土壤重金属的过程中，在该铜离子浓度范围内,土壤中铜离子浓度对植物的生长没有明显的影响土壤含水量测定编号坩埚重（g)坩埚+土样（g）烘干后（g）0113.47130。66226。4790215.70631.43627。4730317。47937.21831.8310415。76438。26332。3140511.99430.40425。93950111.2935.4927。91650217。13539.40532.54450-312.67140。22731.90450413。98429。77326.28550-515.03335.28629.273100115。92534。98929.604100-211。02732。21425。762100317。28140。70833.49100-410。79126.41422。562100510.85535.57627。957150115。04334。81729。512150-219。4140.8134.517150-314.3131.66426。99150-418.72337。3632.115150515.77929。63326.28200-110.98927.48923。222200216。6830.6927.102200313.83127。8324。419200413.39530。00225。203200515.22130.13726.285植物含水量测定编号培养皿重（g）培养皿+植株（g）烘干后（g）植株含水量0135.94938.60136。42382.1267%0-240.96447。10541.84585.65380345。7750.92147。38268。70510-435.41938。03135。84483。7289%0535。59640.59836.38384.266350132。48643.85433。89587.6056%50-234.940。36235.7684。254950342。29147。67443。02986.2902%50435。12240.23935.9284.404950532。44742。7433.88386。0488%100132.57738。94233.49285.6245100232.86638.59233。63886。5176%100328。99643.29731。08985。3647%100445.62953。3446.74685。5142%100538。41348。73239。48689.6017150133.2549。85635。34487.3901150-233。53243.09934。99884.6765150338。65748。94740.03886.5792%150433。26341.69434.46285。7787150531.75338。19732.70385。2576%200-129.28643。55531。32985.6822200230。20851。67432.78587。9950200336.19348。23737.81586.5327%200435。76351.24537。92386。0483200-545.46257。47847.10586.3266%有图表可知：植物生长中因土壤含有一定的重金属，致使植物体内含水量急速增加,但是随着铜离子浓度增长其含水量并不因其增长而发生一定规律的变化,可以知道，一旦土壤中含有重金属，植物吸收到重金属后，改变了植物的生理特性,致使植物生物学结构发生变化，引起植物的蒸腾作用和其他作用发生了改变,造成影响。土壤微生物呼吸作用的测定氢氧化钠吸收法编号土壤鲜重/g滴定消耗盐酸初值/ml滴定消耗盐酸终值/ml差值/ml二氧化碳释放量/mg001.7119.3217。610130.264619。3336.3917。061.210-230.34461。4118.2616.851。6720-330.217618.2834.7816.52.4420430。69510.3116.9916.682.0460530.22410。7517.5516。81.78250003。6921.317.6150-130.9810.7717.3116.542.35450231。7851。3718。7117.340。59450330.690。2317.317。071。18850-430.8290。917。416。52。44250531.3350.8517.6916。841.6941000019。0136.8817.87100129.963916.6132。5815。974。18100230.17412。3218.1515.834。488100329.953918。1833.9815.84.554100430.67190。7116.8916.183。718100530.364817。732。115。45。434150-001。5118。9817。47150129.68580.1915.6815。494。356150230。200815。6930.6514。965。522150330。56110.8416.4915。654.004150431。580516.531.8115.314.752150531。86311.0925。7914。76。094200000.317。3517.05200129。7817.3634.7617.40。77200229。9730。818.1917.390。748200329。71318。235。817。6-1.21200430。1061.218。817。6-1。21200-529。74119.1236.5717.45-0。88有图表可知:随着铜离子浓度发生变化，土壤的二氧化碳释放量变化急剧，甚至铜离子浓度达到一定浓度之后,土壤不再因呼吸作用而释放二氧化碳.表明：在铜离子浓度一定范围内土壤微生物尚且能适应其生活环境，随着铜离子浓度增加后微生物增加其呼吸作用强度以适应其生活环境,但是铜离子浓度达到一定高度后,微生物不能再适应该生活环境,大量死亡。土壤微生物量C测定-熏蒸-浸提法编号硫酸亚铁铵滴定初值/ml硫酸亚铁铵滴定终值/ml差值/ml未00空白1。589.237。65未0128。4235.727.3未0-214.321.617。31未030.67。97。3未0430.738.027。32未0523。530.687.1800空白9。2516.937.680135.7242.656。930-221.6128。46。790-37。314.256。950438。0844.956.87051。27。126。92未500空白20。6928。327。63未50-110.817.957.15未50228。8335.947.11未50-335.9843.257.27未5048.415。597。19未50515。622。87。2500空白28。3336。017.6850136。0442。836.7950217。9824。276.7450-315。2822。056.775041.588.386.85051.438.386。95未1000空白22.9130。687.77未10011。218。647。43未100-215.623.127.52未100330.337。837。53未10040。17.597。49未100515.322.617。31100-0空白30。738。37。610018。6615。596.93100-223。1230。297.17100-337。8345。217.3810047。815。297.49100522。6129.97.29未1500空白32。6940.297。6未15017。9115.257。34未150222。529。757.25未150-366。7144。017。3未15048。1515。427。27未150522。4129.697.281500空白40.3147.757.4415010.787。917。13150-215。2822.497。21150329.7536.76。9515040。958。127.17150515。4522。46.95由图表可知随着土壤重金属含量的增加，土壤中微生物C逐渐较少，可知由于土壤中重金属含量增加，土壤环境越来越不适应于微生物的生存和繁衍，土壤微生物种群数量急剧减少直至,微生物灭绝。转化酶活性的测定编号土壤重量/g吸光度014.9960.1025。0010.077035.0030。0660-44。9880.066054。9990。0635014。9930。0825025。0030。0865034。9970.0775045。0020。07950-54。9980.07910014。9910.068100-24。9960.0810034。9970.08110044。9950.07910054。9920。079150-14.9940。08915024.9920。08715035。0060。103150-45.0060.10915054。990。07620015.0010。12120025.0050.09920034。9910。08520044。9930。0820054.9940.093由表可知:土壤转化酶活性与铜离子浓度成正相关性，不同的铜离子浓度条件下活性具有显著差异，表明随着铜离子浓度增强,转化酶活性增强，即在该铜离子浓度范围内，铜离子浓度对转化酶活性具有一定的促进作用。土壤脲酶活性测定标准曲线：编号135791113数据0.160。250。330.410。50.610。7脲酶吸光度数据 编号土壤重/g吸光度平均值对应氨氮含量脲酶活性（Ure)015。0380.1640.16321。2075892860。600360581025.010.165035.0310。166045。0240.161055.040.1650-15。0910.1620.16581。2656250.62528407950-25.0520。1695035.0230。17150-45.0950。16450-55。040.16310015.0090.1950。1821。6272321430.80635884110025。0280.1910035。0650.18510045。020。176100-55。1030。164150-15.0140。180。17221。4084821430.69815317515025。1070。17150-35.0470。172150-45.0270。17615055.0230。16320015。020。1620。16461。2388392860。61597020920025.010。172200-35。0520.16520044.9990.16420055。0590.16 图表可知:土壤中铜离子浓度对土壤脲酶活性有一定的影响：选取的铜离子浓度在该土壤脲酶的活性范围之内，随着铜离子浓度的增加脲酶活性随之有所增加,但当酶活性达到该其他外界属性包括温度、PH等不变时的最高点时,随着铜离子弄得增加而减少。土壤过氧化氢酶的活性的测定标准曲线浓度1357911吸光度0.120。1560。1920。2310。2620。301编号土壤重/gKMnO4滴定初值/mlKMnO4滴定终值/ml差值/ml0-0003.53。5015.02915。917。81.9025。0871819.221。220-35。02619.2220。351.18045。05620。422.251.75055。05622.2523。11.8550003.56。853.355014.9923。1251。95025.00325.0226.251。235034。93826.2528.32.055045。02528。329.251。955055.08529.2530.61。35100006。85103.1510015.0330。732.251。4510025.01832。2534。62。35100-35.07734。636.21.6100-4536。237.711.5110055.06337.7139.251.59150001013.113.11150-15。06939。2540。61。3515025.09740。642。251。65150-35.08642。3441。7150-45。0464445.31.315055。0145.346.51.2200-0013。1115.92.7920014。99746.547。490.9920024.99847。4948.951.4620035.0241。1542.41。2520045.00642.443。721.3220054.98343.7544.91.15经计算可得:铜离子浓度（mg/kg）过氧化氢酶活性01。92501.6541001。451501.672001。556由图表可知：选取的铜离子浓度仍在该过氧化氢酶活性范围内，当土壤中存在铜离子时，过氧化氢酶活性降低，但随着铜离子浓度的增加,过氧化氢酶活性变化趋势没有显著规律。五、讨论与小结植物生长在重金属污染的环境中，受重金属的胁迫, 植物与重金属接触的界面首先受到影响,并且这种影响随着胁迫时间的延长, 随重金属浓度的升高, 植物的受害亦加剧.植物受重金属的伤害程度、伤害症状与重金属的浓度关系密切。重金属污染严重影响了土壤微生物的种类、生物量、种群结构以及生理生化性质,破坏了微生物的正常组成区系。土壤中含重金属虽然对不同的酶活性影响程度不同，但是随着铜离子浓度的迅速提高，酶活性必大幅度降低，甚至丧失活性。六、实验不足1.经所得结果可得知，选取浓度范围过小，浓度密集不足，同时经自行配置一定铜离子浓度的土壤,误差可能较大。2.实验过程中,因为实验经验不足，一些药品配置过多,造成浪费；一些药品配置不足,重新配置后，因为不是同一次配置造成药品浓度的存在误差。3.实验基础不足,造成实验过程中出现不必要的繁琐和错误方法，对实验结果造成一定影响.4。实验器材准备不充分，一些具有代表性的指标分析不足,所得结果难以说明问题.