kallistatin表达...障碍的关系及其初步机制研究_汪玉.pdf

NJA中华男科学杂志National Journal of AndrologyZhonghua Nan Ke Xue Za Zhi2022，28(11):976 984http:/www androl cn论著Clinical esearch(临床研究)kallistatin 表达水平与男性生精功能障碍的关系及其初步机制研究汪玉，陈鑫月，尚坤，胥琴，李云秀，杜愿，转黎(昆明理工大学附属医院/云南省第一人民医院生殖医学科，云南 昆明 650032)【摘要】目的:探索 kallistatin 基因在男性生精功能中的作用及其可能的作用机制，为临床治疗生精功能障碍提供新的思路。方法:收集诊断为少精子症、非梗阻性无精子症患者和正常男性的精液样本以及睾丸穿刺术后的睾丸组织。首先，检测患者精浆中 kallistatin 表达水平差异;然后，检测睾丸组织中 kallistatin、KLK1、B2、Bcl-2、casepase-3、Bax 等分子在 mNA 和蛋白水平的表达情况;其次，通过 Johnsen 评分观察睾丸生精功能、Masson 染色及天狼猩红染色检测睾丸组织间质纤维化水平;最后，通过相关性分析评价 kallistatin 表达水平与睾丸生精功能、细胞凋亡水平和组织纤维化的关系。结果:kallistatin 高表达于精浆和睾丸组织中，与正常男性相比，非梗阻性无精子症及少精子症患者精浆中的 kallistatin 水平明显降低(P 0 05);少精子症组与非梗阻性无精子症组患者睾丸组织中 kallistatin、KLK1、B2 表达水平显著低于正常对照组(P 0 01)，而正常组、少精子症组及非梗阻性无精子症组各组内 kallistatin、KLK1 两者表达未见明显差异(P 0 05)。少精子症及非梗阻性无精子症组患者睾丸组织中 Bcl-2 表达水平显著低于正常组(P 0 01)，而 Bax 及 Casepase-3 表达水平明显高于正常组(P 0 01)，凋亡水平与 kal-listatin 表达水平呈负相关趋势。Masson 染色和天狼猩红染色结果显示，非梗阻性无精子症及少精子症患者睾丸组织中的纤维化水平及 I/III 型胶原纤维比例显著增加，非梗阻性无精子症组增加程度高于少精子症患者。结论:kallistatin 表达水平降低可能与睾丸生精功能障碍有关，并且其可能通过调控睾丸组织中细胞凋亡水平、纤维化水平对生精功能发挥调控作用，具体机制有待进一步研究证实。【关键词】kallistatin 基因;精子发生;生精功能障碍;男性不育症中图分类号:698文献标志码:Adoi:10 13263/j cnki nja 2022 11 003elationship of the kallistatin gene expression with male spermatogenicdysfunction and its possible mechanismWANG Yu，CHEN Xin-yue，SHANG Kun，XU Qin，LI Yun-xiu，DU Yuan，ZHUAN LiDepartment of eproductive Medicine，The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology/TheFirst Peoples Hospital of Yunnan Province，Kunming，Yunnan 650032，China【Abstract】Objective:To explore the role of the kallistatin gene in male spermatogenesis and its possible mechanism，and pro-vide some new ideas for the clinical treatment of spermatogenic dysfunctionMethods:We collected semen samples from the patients679基金项目:国家自然科学基金项目(82260301，81460234，81760470，81660247);云南省生殖妇产疾病临床医学中心 开放课题(2020LCZXKF-SZ01);云南省卫生健康委员会医学学科带头人培养计划项目(D-2019018，D-2017022);云南省卫生健康委员会医学学科后备人才培养计划项目(H-2017025);云南省科技计划项目-昆医联合专项 2017FE467(-155)作者简介:汪玉(1996-)，女，云南昭通市人，硕士研究生，从事生殖医学与人类辅助生殖技术研究。陈鑫月(1997-)，女，云南昆明市人，硕士研究生，从事生殖医学与人类辅助生殖技术研究。汪玉和陈鑫月对本研究有同等贡献，为共同第一作者。通讯作者:转黎，Email:zhuanli yunnan163 comwith oligospermia(OS)or non-obstructive azoospermia(NOAS)as well as testis tissue from testicular puncture We detected the dif-ferential expression of kallistatin in the seminal plasma and the mNA and protein expression levels of kallistatin，KLK1，B2，Bcl-2，casepase-3，Bax and other molecules in the testis tissue，assessed the testicular spermatogenic function using Johnsens scores，exam-ined the interstitial fibrosis in the testis by Masson and Sirius staining，and analyzed the correlation of the expression level of kallistatinwith spermatogenesis，apoptosis and fibrosisesults:Kallistatin was highly expressed in the seminal plasma and testis tissue Theexpression of kallistatin was significantly decreased in the seminal plasma(P 0 05)and so were those of kallistatin，KLK1 andB2 in the testis tissue of the NOAS and OS patients compared with those in the normal controls(P 0 01)，but no statistically sig-nificant difference was found between the expression levels of kallistatin and KLK1 within the same group(P 0 05)The expressionof Bcl-2 in the testis tissue was significantly lower(P 0 01)and those of Bax and Casepase-3 dramatically higher in the OS andNOAS patients than in the normal males(P 0 01)Cell apoptosis was negatively correlated with the expression of kallistatin Theresults of Masson and Sirius staining showed that the fibrosis of the testis tissue and the ratio of type I/III collagen fibers were markedlyincreased in the OS and NOAS patients in comparison with the normal controls，even more significantly in the NOAS than in the OSgroupConclusion:Decreased expression of kallistatin may be related to spermatogenic dysfunction，and the kallistatin expressionplays a regulatory role in the testicular spermatogenesis，probably by regulating cell apoptosis and fibrosis in the testis tissue，but thespecific mechanism needs to be confirmed by further studies【Keywords】kallistatin gene;spermatogenesis;spermatogenic dysfunction;male infertilitySupported by grants from National Natural Science Foundation of China(82260301，81460234，81760470 and 81660247)，Open Project of Yunnan Pro-vincial Clinical Medical Center of eproduction，Obstetrics and Gynecology(2020LCZXKF-SZ01)，Training Program of Yunan Province Health Commis-sion for High-Level Medical Talents(D-2019018 and D-2017022)，Training Program of Yunan Province Health Commission for eserve Medical Talents(H-2017025)and Joint Foundation of Yunnan Provincial Science and Technology Program and Specialized Project of Kunming Medical University(2017FE467-155)Correspondence to:ZHUAN Li，email:zhuanli yunnan163 comeceived:May 27，2022;accepted:September 15，2022WHO 将不育症定义为男女双方有规律、无保护性生活 1 年后无法成功受孕1。大约 30%不育症是由男性因素导致的，不育症严重影响了 1/20 左右育龄期男性(青春期至 40 岁)生殖健康2-3，其被认为是由遗传因素、有毒化学品和炎症因素及内分泌异常导致的精子参数异常4。研究表明，氧化应激通过调节生殖细胞自噬、衰老、凋亡、微血管生成和组织纤维化对精子发生进行调控5-6。组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)是一种独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂，是激肽释放酶 激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)的重要成员之一，其广泛分布于心血管系统、肾脏、肝脏、子宫、前列腺和阴茎海绵体等组织器官以及血浆、精液、乳汁、羊水、尿液等体液中。kallistatin 由 kallistatin 基因进行编码，其通过活性中心和肝素结合结构域两个结构域在血管舒张、氧化应激、细胞凋亡、细胞衰老、血管生成、组织纤维化、抗炎症和抗肿瘤等多种病理生理过程和信号通路中发挥多重生物学效应7。同属 KKS 的成员之一组织激肽释放酶 1(Kallikrein-1，KLK1)已被用于男性少精子症和弱精子症的临床治疗且已取得较好疗效，KLK1 通过激活细胞外信号调节酶 1/2(extracellular-regulatedkinase 1/2，EK1/2)通路和细胞周期蛋白 Cyclin A和 Cyclin E 促进精原干细胞增殖，从而促进精子发生8。在对机体其他系统的研究中，kallistatin 抗氧化应激的作用已初步展现，但尚无其在生精功能中的作用研究。因此，本研究拟探索 kallistatin 在睾丸生精功能障碍中的作用及其可能的作用机制，为精子发生异常治疗提供新的思路或靶点。1资料与方法1 1主要实验材料实时荧光定量 PC 仪(Ther-mo 公司)，垂直电泳槽(Bio-ad 公司)，荧光显微镜(Nikon 公司)，兔抗大鼠 kallisatatin 多克隆抗体(In-vitroqen，PA5-96636)，HP 标记的羊抗兔 IgG(AB-clonal 公司)，总 NA 提取试剂盒(TaKaa 公司)，逆转录试剂盒、荧光定量 PC 试剂盒(Vazyme 公司)，Human SEPINA4(kallistatin)ELISA Kit(Sig-ma 公司)，计算机辅助精子分析系统(CASA)(SCASCOPE 公司)，Masson 三色染色试剂盒(Solarbio 公司)，兔抗大鼠 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 多克隆抗体(ABclonal 公司)，Bouins 固定液(武汉赛维尔)。1 2研究对象及分组受试者为 2017 年 9 月至2020 年 1 月于云南省第一人民医院生殖医学科就诊的 20 45 岁男性不育症患者，此项研究获云南省第一人民医院人类研究和伦理委员会的批准，所有779中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022患者均对本研究签署知情同意书并同意参加。参照WHO 人类精液实验室检验手册(第五版)，采用CASA系统进行精液分析，根据精子分析参数(精子浓度、前向运动精子百分率、正常精子形态百分率)分为正常组、少精子症组和无精子症组，无精子症再根据后续的生殖激素测定、精浆-葡萄糖苷酶测定、遗传学分析、睾丸穿刺活检等筛选出非梗阻性无精子症患者9:正常对照组(n=200，入组标准:精子浓度15 106/ml、快速前向运动精子百分率32%、正常形态精子百分第4%)。少精子症组(n=200，入组标准:精子浓度 15 106/ml，其余参数正常)。非梗阻性无精子症组(n=200，入组标准:3 次精液 3 000 g 离心 15 min 沉渣中未见精子且通过病史、体格检查、生殖激素测定、精浆-葡萄糖苷酶测定、遗传学分析、睾丸穿刺活检等排除梗阻性无精子症)。1 3精浆样本收集所选受试者禁欲 2 7 d，手淫取精，置干燥无菌量杯内，37 水浴箱中孵育液化，并记录液化时间。采用 CASA 系统进行精液分析测定精子参数后，根据吸取 1 ml 精液样本于离心管中，并在 3 000 r/min 离心 15 min，重复离心 1 3次每次分别取上层液态精浆转移至冻存管中于80 冰箱中保存待测。1 4患者睾丸组织样本收集经伦理委员会的批准和患者知情同意，收集非梗阻性无精子症患者以及拟行 IVF/ICSI 助孕但因女方取卵日因取精失败要求行睾丸穿刺取精术患者睾丸组织，根据前期精子分析参数分为正常对照组(n=60)、非梗阻性无精子症组(n=60)和少精子症组(n=60)。将收集的睾丸组织用生理盐水进行洗涤，然后一部分加入一定量的 Bouins 固定液放置于冻存管中固定进行组织学观察及分析。1 5ELISA 实验检测各组患者精液中 kallistatin基因蛋白表达。稀释并包被抗体蛋白，加封闭液37 水浴 1 5 h，洗涤 3 次拍干后加入待测样品并于37 水浴箱中温育1 5 h。再次洗涤后加入提前稀释好的生物素化抗体工作液，再次于37 水浴箱中温育 1 h。洗涤后加入显色底物，37 水浴箱中避光反应 30 min，待标准品孔显色后加入 2 mol/L硫酸终止反应。将酶标板放置于酶标仪上，450 nm处测定每一孔 OD 值，做出标准曲线并计算样品密度。1 6实时荧光定量 PC(T-PC)将收集的各实验组睾丸组织使用 Tizol 提取总 NA 后，使用HiScript II Q T SuperMix for qPC 试剂盒将总NA 转化为 cDNA。使用 ChamQ Universal SYBqPC Master Mix 扩增 kallistain、KLK1、B2、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 基因(表 1)。扩增程序:预变性95 10 min;循环反应:95 2 min，退火 60 30 s，40 个循环;融解曲线程序为 95 15 s，60 1 min。同时扩增管家基因-actin 以标准化样本NA 的量。基因转录水平的相对定量采用 ct法。表 1检测基因的引物序列Table 1 Primer sequences of the genes used for T-PCGenePrimer sequences-actinF:5-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3:5-GAGCTAAGAGCTGCCTGACG-3kallistatinF:5-CCGTGAGTAACCCCCTGAGA-3:5-ATGCTCAGCGGGGAGAAAAA-3KLK1F:5-CTCACAGCTGCTCATTGCATC 3:5-GCTCTCACTGACATGAACAAACTGG-3B2F:5-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3:5-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3BaxF:5-CGAGTGTCTCCGGCGAATG-3:5-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3Bcl-2F:5-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3:5-CTGCTGGATTGTTCCCGTAG-3Caspase-3F:5-AGCTTCTTCGAGGCGACTA-3:5-GGACACAATACACGGGATCT-31 7Western 印迹各实验组睾丸组织用裂解缓冲液在冰上裂解 20 min。细胞裂解物在 4 下以15 000 g 离心 30 min。收集上清液作为总细胞蛋白提取物。用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将细胞总蛋白样品负载于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶上。分离的蛋白质电泳转移到 PVDF 膜。在含有PBST 和 5%非脂肪乳的封闭缓冲液中封闭 1 h。用抗 kallistatin(1 1 000)、KLK1(11 000)、B2(11 000)、Bcl-2(1 1 000)、Bax(1 1 000)和caspase-3(1500)的一级抗体在 4 条件下孵育过夜。PBST 洗膜 3 次，每次 10 min。再与二级 HP结合抗体常温孵育 2 h 后，用 PBST 洗膜 3 次，用ECL 试剂处理并暴露于 X 射线胶片，每个波段用Image J 软件进行定量分析。18HE 染色和 Johnsen 评分睾丸组织经脱蜡水化后放入苏木精染液中，边染边观察组织的着色情况，然后用酸性乙醇分化 3 min，分化后于伊红溶液中染色，边染边观察伊红的着色情况，伊红染色后，879中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022自来水清洗 3 次，每次 3 min，清洗完成后将片子吹干，将中性树脂滴在组织上盖上载玻片，最后将石蜡切片放置于显微镜下进行观察并采集图像进行分析，通过 Johnsen 评分评价睾丸的生精功能，主要标准为:生精细胞排列规则，精子发生过程完全，可见许多成熟精子细胞(10 分);生精细胞排列紊乱，管腔内可见不成熟精子细胞和许多精子细胞(9 分);管腔内精子数少于 5 个(8 分);无精子，但有许多精母细胞(7 分);无精子，有少量早期精子细胞(6分);无精子，可见许多精原细胞，生精细胞排列不规则(5 分);无精子细胞，有精原细胞和少量精母细胞(4 分);仅可见精原细胞和支持细胞存在(3 分);无生精细胞，管腔内仅可见支持细胞(2 分);小管切面无细胞(1 分)。1 9免疫组化染色石蜡包埋穿刺睾丸组织切片(4 m)脱蜡、再水化，脱蜡和复水切片在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中进行微波抗原修复 10 min，然后在 1%过氧化氢溶液中淬火 10 min。用 2%BSA 封闭缓冲液封闭非特异性结合，并用抗 kallistatin(1500)、B2(1500)和 KLK1(1500)抗体染色，在 4 条件下孵育过夜，染色切片进一步与过氧化物酶结合的二抗常温条件下孵育 1 h。使用 DAB 底物制备载玻片，然后在封片前用苏木精复染。在 15个等效高倍视野(400)中对组织进行拍照观察。免疫组化染色的定量分析用 Image J 测量，并以积分光密度值表示。1 10Masson 染色和天狼猩红染色石蜡包埋穿刺得到的睾丸组织切片(4 m)经 Masson 染色和天狼猩红染色观察睾丸组织纤维化的程度。睾丸组织切片(4 m)经脱蜡、水化后用 Masson 三色染色试剂盒染色，中性树脂封片，依次由低倍视野到高倍视野(100，200，400)对组织进行拍照观察。天狼猩红染色是将切片经脱蜡、水化后放入含有天狼猩红染色液的溶液中染色 8 10 min，再将其放入含有无水乙醇溶液脱水两次，然后将切片放入含有干净的二甲苯液中透明 5 10 min，再用中性树胶进行封片处理，在偏振光下采集图像进行分析。1 11统计学分析相关性分析主要采用 SPSS 200软件进行 Pearson 相关性参数测定，其中 Pearson 系数的大小，表示相关性的高与低。计量资料表示为x s，由3 个独立实验计算得出。两组间采用 t 检验进行比较。采用单因素方差分析，P0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1kallistatin 蛋白在精浆中的表达水平ELISA测定 kallistatin 在少精子症和非梗阻性无精子症患者精浆中的蛋白水平结果显示(图 1)，少精子症、非梗阻性无精子症患者精浆中 kallistatin 浓度显著低于正常组，且非梗阻性无精子症表达最低(P 0001)。结果提示，kallistatin 在睾丸中的表达水平与精子发生存在相关性且有望成为精子发生异常的预测指标。图 1精浆中 kallistatin 的蛋白表达水平(ELISA 法)与正常对照组相比，*:P 005，:P 001Figure 1 Expression of the kallistatin protein the seminal plas-ma of the men in different groups*:P 005，:P 001 versus normal control group2 2kallistatin 在生精功能障碍患者睾丸组织中的表达水平及与生精功能的相关性分析通过 HE 染色，如图 2 所示，正常对照组管腔内各级生精细胞排列整齐，支持细胞数量正常，形态饱满，管腔可见大量形态正常的精子(Johnsen 评分 9 10 分)。非梗阻性无精子症组管腔内细胞数目和层次明显减少，排列紊乱，管腔细胞呈现淡红的玻璃样改变，管腔内未见精子细胞(Johnsen 评分 2 3 分)。少精子症组管腔内各级生精细胞数量减少，见空泡，排列略混乱，管腔内可见少许形态正常的成熟精子(Johnsen评分8 9 分)。然后，通过对 kallistatin 在 mNA 和蛋白水平进行表达检测，如图 3 所示，kallistatin、B2 和 KLK1 表达于睾丸精原细胞和精母细胞中，且在非梗阻性无精子症和少精子症组中的表达水平显著低于正常组，且表达水平依次为正常组 少精子症组 非梗阻性无精子症组(P 0 01)，而在正常组中 kallistatin 与 KLK1 的表达水平相当且无明显差异，在少精子症组及非梗阻性无精子症组中也有相同现象，即同一个组中 kallistatin 与 KLK1 表达水平无显著差异(P 0 05)。kallistatin 在不同患者睾丸中的蛋白表达与之对应的Johnsen评分进行979中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022Pearson 相关性分析，发现 kallistatin 和生精功能具有正相关性(P 0 05)，相关系数为 0 9183(图 4)。因此，推测 kallistatin 可能与睾丸生精功能相关并参与了睾丸生殖力的调控。图 2不育症患者睾丸组织 HE 染色及 Johnsen 评分a:正常对照组(Johnsen 评分 9 10 分);b:非梗阻性无精子症组(Johnsen 评分为 2 3 分);c:少精子症组(Johnsen 评分 8 9 分)。评分以 20个生精小管分值为准。Figure 2 HE staining images of the testis tissue of the men in different groupsa:Normal control，Johnsens score 9 10;b:Non-obstructive azoospermia，Johnsens score 2 3;c:Oligospermia，Johnsens score 8 9 The scoreswere based on the values of 20 seminiferous tubules图 3不同患者睾丸组织中 kallistatin、KLK1 和 B2 的表达水平检测(T-PC、免疫组化和 Western 印迹检测)a:正常对照组;b:非梗阻性无精子症组;c:少精子症组;免疫组化结果中(100 )，目的蛋白 kallistatin 表达呈棕褐色，细胞核呈蓝色，蛋白表达越高棕褐色越深。与正常组相比，*:P 0 05，:P 001。Figure 3 Expressions of kallistatin，KLK1 and B2 in the testis tissue of the men in different groups by immunohistochemistry(100)and Western blota:Normal control;b:Non-obstructive azoospermia;c:Oligospermia Brown indicates the expression of the target protein kallistatin，the darker the col-or，the higher the expression Blue indicates the nuclei*:P 005，:P 001 versus the normal control089中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022图 4不育患者睾丸生精功能与 kallistatin 表达水平之间的关系图中 2值表示相关性系数，该系数越接近 1 表示相关性越强。Figure 4 Correlation of Johnsens score with the expression thekallistatin in the infertile patientsThe 2value represents the correlation coefficient，the closer to 1，thestronger the correlation2 3生精功能障碍不育症患者睾丸组织中的细胞凋亡水平及与 kallistatin 的相关性通过实时荧光定量 PC 和 Western 印迹技术检测细胞凋亡因子(Bcl-2、Bax、caspase3)在睾丸组织中表达水平(图5)，少精子症及非梗阻性无精子症组患者睾丸组织中抗细胞凋亡蛋白 Bcl-2 的表达水平显著低于正常组，表达水平依次为正常组 少精子症组 非梗阻性无精子症组(P 0 01)，而促细胞凋亡蛋白 Bax、Casepase-3 表达水平以及 Bax/Bcl2 显著高于正常组，表达水平依次为非梗阻性无精子症组 少精子症组 正常组(P 0 01)。相关性分析显示(图 6)，Bcl-2 与 kallistatin 表达水平呈正相关趋势(2=0 961)，Bax、Bax/Bcl-2 和 caspase3 与 kallistatin 表达水平呈负相关趋势(2分别为 0 787、0 948 和0 783)。提示 kallistatin 可能通过下调睾丸生精细胞所遭受到外源性或内源性因素的细胞凋亡作用而调控睾丸生精功能，但具体机制有待于进一步研究。图 5细胞凋亡因子在睾丸组织中的表达水平(T-PC 和 Western 印迹检测)与正常组相比，*:P 005，:P 001。Figure 5 Expressions of the apoptosis factors in the testis tissue of the men in different groups by Western blot and T-PC*:P 0 05，:P 0 01 versus the normal control189中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022图 6睾丸 kallistatin 表达水平与细胞凋亡水平之间的相关性Figure 6 Correlation of the expression of kallistatin with cell ap-optosis in the testis tissue of the patients2 4在睾丸组织中 kallistatin 表达水平与纤维化程度的相关性通过 Masson 染色和天狼猩红染色法检测睾丸组织中睾丸间质纤维化水平、I 型胶原纤维和 III 型胶原纤维的表达水平及 I/III 型胶原纤维比例，同时，探索 kallistatin 在睾丸组织中的表达水平与睾丸间质纤维化水平之间的相关性。Masson染色和天狼猩红染色结果显示(图 7)，与正常对照组相比，少精子症组与非梗阻性无精子症组睾丸组织中 I/III 型胶原纤维比例明显增加，而与少精子症组相比，非梗阻性无精子症患者中 I/III 型胶原纤维比例增加更为显著。结果表明，睾丸组织中 kallista-tin 蛋白表达水平与睾丸间质纤维化水平之间具有相关性且呈负相关趋势。图 7Masson 染色和天狼猩红染色检测睾丸间质纤维化水平(200)A:Masson 染色，胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核蓝紫色;B:天狼猩红染色，在偏振光显微镜下，型胶原纤维呈强橙黄色或亮红色，型胶原纤维呈绿色。图中 a:正常对照组;b:非梗阻性无精子症组;c:少精子症组。Figure 7 Fibrosis of the testis interstitial tissues of the men in different groups by Masson and Sirus staining(200)A:Images of Masson staining，blue indicating collagen fibers，mucus and cartilage，red indicating cytoplasm，muscle，cellulose and glial，and purple-blue indicating nuclei B:Images of Sirius scarlet staining under the polarized light microscope，strong orange or bright red indicating type-I and green in-dicating type-III collagen fibers a:Normal control;b:Non-obstructive azoospermia;c:Oligospermia3讨论哺乳动物的精子发生是精原干细胞经过细胞增殖、减数分裂和细胞分化转变成为成熟单倍体带鞭毛的精子的高度有序且复杂的一个细胞分化过程10。在正常生理条件中，雄性哺乳动物约 75%以上的生精细胞在发育过程通过细胞凋亡控制生殖细胞间自我更新和分化的动态平衡，从而维系正常的精子发生过程和确保遗传信息的正确传递11。研究表明，精原干细胞自我更新和分化能力失衡、精原细胞凋亡异常和细胞外质特化结构完整性破坏是精子发生异常的重要病理生理学机制12-14。细胞自噬在维持细胞在缺血缺氧等应激状态下存活发挥着重要作用，而持续性的自噬激活可最终导致细胞289中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl，Vol 28，No 11，November 2022发生自噬程序性细胞死亡15-16。睾丸微血管由微动脉、小动脉分支、毛细血管和微静脉组成，其通过连接邻近的 Leydig 细胞簇和生精小管将精子发生所需营养物质从睾丸间质分配运输至邻近生精小管，微血管密度降低或功能障碍可直接影响精子发生过程，导致精子生成减少17-18。kallistatin 被鉴定为人体组织激肽释放酶结合蛋白，抑制组织激肽释放酶对激肽原和三肽底物的活性19。kallistatin 通过活性中心和肝素结合结构域两个结构域在血管舒张、氧化应激、细胞凋亡、细胞衰老、血管生成、组织纤维化、抗炎症和抗肿瘤等多种病理生理过程和信号通路发挥多重生物学效应7，20-21。kallistatin 一方面通过活性中心结构域抑制 Let-7g 介导的 mi-34a/SIT1/eNOS 通路，增加抗氧化应激防御系统成员过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)等阻断 OS 合成，另一方面可通过肝素结合结构域阻断肿瘤坏死因子-(TNF-)或过氧化氢(H2O2)调节的 NADPH氧化酶活性而减少 OS 生成，从而保护受损和衰老器官7，20。课题组前期研究发现，在阴茎海绵体组织中，同属 KKS 成员且与 kallistatin 具有类似作用机制的人组织激肽释放酶 1(hKLK1)通过激活PI3K/Akt/mTO 通路，上调阴茎海绵体细胞自噬水平，改善老龄大鼠的勃起功能22-23。为探讨 kallistatin 在男性睾丸中的表达水平与睾丸生精功能的相关性，我们检测了 kallistatin 在非梗阻性无精子症和少精子症患者中精浆中的表达水平，发现与正常患者相比，非梗阻性无精子症和少精子症患者精浆中 kallistatin 表达水平降低，其中非梗阻性无精子症患者表达水平最低;然后通过 T-PC 和 Western 印迹检测 kallistatin 在非梗阻性无精子症和少精子症患者睾丸组织中的表达情况，同时进行 Johnsen 评分，相关性分析结果显示，kallista-tin 在男性睾丸中的表达水平与睾丸生精功能呈正相关性;最后我们又检测了不同患者睾丸组织中的细胞凋亡情况和组织纤维化水平，相关性分析结果显示发现 kallistatin 表达水平与