我国传统猪丹毒疫苗及流行株灭活疫苗的免疫保护效力评估.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211051我国传统猪丹毒疫苗及流行株灭活疫苗的免疫保护效力评估詹鹏飞1，裴世璇1，宋吉健1，韩忆侬1，关丽君1，薛云1，司丽芳1,2，赵战勤1,2*(1.河南科技大学 动物科技学院/兽医生物制品工程实验室，河南 洛阳471003；2.河南科技大学 动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室，河南 洛阳471003)摘要：为评估我国传统猪丹毒灭活疫苗(C43-5株，2型)及其衍生的猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)对当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4(1a型)的免疫保护效力，本研究将2种猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)分别经皮下注射免疫小鼠，14 d后采用ELISA方法检测小鼠血清中的抗体水平，免疫后15 d，以10 LD50/只分别经腹腔注射攻击传统疫苗检验株C43-6、C43-8，当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4菌液并观察、记录各组小鼠的临床症状和死亡情况，共观察14 d。死亡小鼠立即剖检，采集心、肺、肝等组织进行细菌的分离与鉴定。结果显示，2种活疫苗均能刺激小鼠产生较高的抗体水平，且极显著高于PBS对照组(0.05)；攻毒结果显示，分别对应GC42株和G4T10株的6个攻毒组小鼠均无任何临床症状，且均获得100%的保护率；对照组小鼠攻毒后24 h出现相应发病症状，5 d内全部死亡；死亡小鼠各组织器官主要出现败血症的剖检病变；从死亡小鼠的心血、肺、肝等脏器均能分离到猪丹毒丝菌。将我国传统猪丹毒灭活疫苗株C43-5及其检验株C43-6和C43-8，以及当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4分别制备灭活疫苗免疫小鼠2次(间隔21 d)，于首免后20 d和35 d分别采用ELISA方法检测抗体水平；小鼠首免后35 d，按上述方法攻毒，并检测相应指标。结果显示，上述7种灭活疫苗免疫小鼠20 d后，均诱导小鼠产生了极显著高于对照组的IgG抗体水平(0.05)；首免后35 d与首免后20 d相比，7种灭活疫苗免疫组小鼠的IgG抗体水平虽有所升高，但均无显著差异(0.05)。攻毒结果显示，C43-5、C43-6、C43-8和HG-1株灭活疫苗免疫组小鼠均获得80%(4/5)及以上的保护率，Er-2、Er-3和Er-4株的灭活疫苗仅能对小鼠提供20%60%(1/53/5)的保护率，6个菌株攻击的对照组小鼠均于攻毒后24 h开始发病，5 d内全部死亡。本研究首次将我国3种传统猪丹毒疫苗对当前流行菌株的免疫保护效力进行综合评估，结果表明我国传统猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)和灭活疫苗(C43-5株)针对当前流行的猪丹毒丝菌仍具有良好的免疫保护效力。为我国当前猪丹毒疫苗的防控应用提供了借鉴。关键词：猪丹毒丝菌；传统疫苗；小鼠；保护效力中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0716-06Immune protective efficacy of Chinas traditional vaccines againstthe prevalent strains ofZHAN Peng-fei1,PEI Shi-xuan1,SONG Ji-jian1,HAN Yi-nong1,GUAN Li-jun1,XUE Yun1,SI Li-fang1,2,ZHAO Zhan-qin1,2*(1.Laboratory of Veterinary biologics Engineering,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,收稿日期：2022-11-29基金项目：国家自然科学基金项目(31672530、U1704117)作者简介：詹鹏飞(1994-)，男，河南邓州人，硕士研究生，主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorLuoyang 471003,China;2.Key-Disciplines Lab of safety of environment and Animal Product,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)Abstract:To evaluate the immune protective efficacy of Chinese traditional swine erysipelas inactivated vaccine(C43-5strain,type 2)and its derived live vaccines(GC42 and G4T10),against the current prevalentstrainsHG-1,Er-2,Er-3 and Er-4(type 1a).In this study,two live swine erysipelas vaccines(GC42 strain and G4T10 strain)wereinjected subcutaneously immunized mice and 14 days later,the serum antibody levels of the mice were detected by ELISA method.Fifteen days after immunization,the conventional vaccine test strains C43-6 and C43-8,as well as the currently prevalent strainsHG-1,Er-2,Er-3 and Er-4,were challenged intraperitoneally to immunized mice at a dose of 10LD50,respectively.The clinicalsymptoms and death of mice in each group were observed for 14 days.The dead mice were immediately dissected,and the heart,lung,liver and other tissues were collected for bacteria isolation and identification.The results showed that both kinds of livevaccines could stimulate mice to produce higher antibody level,which was significantly higher than that of PBS control group(0.05).The challenge results showed thatthe 6 challenge groups of mice corresponding to GC42 strain and G4T10 strain had no clinical symptoms,and all obtained 100%protection rate.The mice in the control group began to show corresponding symptoms 24 hours after the challenge,and all diedwithin 5 days.The autopsy of the dead mice mainly showed septic pathological changes characterized by bleeding of varioustissues and organs.can be isolated from the heart,blood,lungs,liver and other organ tissues of dead mice.Theinactivated Chinese traditional swine erysipelas vaccine strain C43-5,its test strains C43-6 and C43-8,and the current epidemicstrains HG-1,Er-2,Er-3 and Er-4 were prepared and immunized mice twice(at an interval of 21 days),and the antibody levelswere detected by ELISA at 20 and 35 days after the first immunization,respectively.35 days after the first immunization,the micewere challenged by the above methods,and the corresponding indexes were detected.The results showed that after immunizing themice with the seven inactivated vaccines for 20 days,the IgG antibody level of the mice was significantly higher than that of thecontrol group(0.05).Compared with 21days after first immunization,IgG antibody levels of mice immunized with 7 kinds of inactivated vaccines were increased at 35days after first immunization,but there was no significant difference(0.05).The results of challenge showed that the inactivatedvaccines of C43-5,C43-6,C43-8 and HG-1 strains obtained 80%(4/5)or above protection rate,while the inactivated vaccines ofEr-2,Er-3 and Er-4 strains could only provide 20%-60%(1/5-3/5)protection rate for mice.The control mice challenged by 6strains all began to develop disease 24 hours after the challenge,and all died within 5 days.In this study,for the first time,theimmune protection efficacy of three traditional Chinese swine erysipelas vaccines against the current epidemic strains wascomprehensively evaluated.The results showed that the traditional Chinese live swine erysipelas vaccines(GC42 strains andG4T10 strains)and inactivated vaccines(C43-5 strains)still had good immune protection efficacy against the current endemicswine.This study provides reference for the prevention and control of swine erysipelas in China.Key words:;traditional vaccines;mice;protective efficacy猪丹毒是猪的一种急性、热性传染病，临床表现为急性败血型、亚急性疹块型和慢性心内膜型，该病在世界范围内广泛流行。在20世纪5080年代，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病(猪瘟、猪丹毒、猪肺疫)之一1。20世纪90年代至21世纪初很少有猪丹毒病例的报道，曾一度认为该病在我国已经消失，但2010年以来，猪丹毒又在我国多个省份发生2-3。因此，该病是一种典型的“老病新发”性细菌传染病。猪丹毒丝菌(，)是丹毒丝菌科丹毒丝菌属()的一种革兰阳性的纤细小杆菌。根据菌体胞壁抗原的差异，通过琼脂扩散试验可将猪丹毒丝菌分为28个血清型(1a、1b、226及N型)。不同血清型菌株之间毒力差异较大，其中1a和1b型的毒力较强4。在20世纪5080年代，我国流行的血清型主要为1a型及少量2型，但2010年以来的临床分离株均为1a型3,5。然而，我国使用的仍是20世纪中期研制的猪丹毒灭活疫苗(C43-5株，2型)及其衍生的猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)6。前者是1955年由中国兽医药品监察所研制的猪丹毒氢氧化铝菌詹鹏飞，等.我国传统猪丹毒疫苗及流行株灭活疫苗的免疫保护效力评估第7期717苗7，后者是1965年哈尔滨兽医研究所将强毒株C43-5接种豚鼠连续传370代获得G370株，再将G370株通过雏鸡传42代后获得的GC42株8；以及由江苏省农业科学院在G370株基础上，经不同浓度的吖啶黄培养基中多次传代获得了G4T10株9。在我国，3种疫苗均曾得到广泛应用，且取得了较好的防疫效果。因此，客观评估其针对当前猪丹毒丝菌流行株的免疫保护效果具有重要意义。本研究以我国传统猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)及制备的7种猪丹毒灭活疫苗(传统灭活疫苗株C43-5及其检验株C43-6和C43-8，以及当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4)分别免疫小鼠，测定各组小鼠血清抗体水平，并采用传统疫苗检验株C43-6、C43-8和当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4经腹腔攻毒，统计并分析各疫苗对小鼠的免疫保护效果，为当前猪丹毒的防控及其疫苗的研发提供参考依据。1材料与方法1.1菌株、疫苗与实验动物传统猪丹毒灭活疫苗株C43-5(2型)及疫苗检验株C43-6和C43-8由本实验室保存；猪丹毒丝菌1a型分离株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4由河南科技大学兽医生物制品工程实验室分离、鉴定及保存10-11(表1)。2种传统猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)分别购自辽宁益康生物股份有限公司和中牧实业股份有限公司(2种活疫苗的标准检验菌株均为C43-6和C43-8)；使用前，按照活疫苗对小鼠效力的检验标准，采用20%铝胶生理盐水将这两种活疫苗稀释成1/10使用剂量，使活菌含量分别为7.0伊107cfu/mL和5.0伊107cfu/mL6。6周龄7周龄、9周龄10周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.2主要试剂胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)培养基为美国BD公司产品；无支原体新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；氯化钠等常规化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；MontanideTMGEL02PR水溶性(简称GEL)佐剂购自赛彼科特殊化学品(上海)有限公司；间接酶联免疫吸附试验(ELISA)相关试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.3灭活疫苗的制备根据参考文献10-12分别制备C43-5株(2型)及 其 疫 苗 检 验 株C43-6株(2型)、C43-8株(1a型)、1a型猪丹毒丝菌临床分离株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4灭活疫苗(MontanideTMGEL02PR佐剂)，灭活前疫苗中细菌的含量均为3.0伊109cfu/mL。根据 中华人民共和国兽用生物制品规程 中猪丹毒灭活疫苗的成品检测方法进行性状、无菌和安全性检验。1.4猪丹毒活疫苗的小鼠免疫保护试验将90只9周龄10周龄BALB/c小鼠随机均分为3组。第1组和第2组小鼠分别经背部皮下注射猪丹毒活疫苗(GC42株)和G4T10株0.2 mL(0.02头份/只，即GC42株1.4伊107cfu/只、G4T10株1.0伊107cfu/只)13，第3组皮下注射无菌PBS(0.2 mL/只)作为对照组。分别于免疫前和免疫后14 d从每组中各取5只小鼠经尾静脉采血分离血清，以HG-1株灭活菌体为包被抗原的间接ELISA方法14测定各组小鼠血清中的抗体水平。免疫后15 d(此时小鼠为11周龄12周龄)，将每组小鼠进一步均分为6个小组，以10 LD50/只(50%lethal dose)分别经腹腔注射传统疫苗检验株C43-6、C43-8，当前流行株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4菌液(表1)。攻毒后观察、记录各组小鼠的临床症状和死亡情况，共观察14 d。死亡小鼠立即剖检，无菌采集心、肺、肝等组织脏器进行细菌的分离鉴定。1.5猪丹毒灭活疫苗的小鼠免疫保护试验将240只6周龄7周龄BALB/c小鼠随机均分为8组。17组分别经背部皮下注射免疫上述1.3中制备的猪丹毒表1本研究使用的猪丹毒丝菌相关信息菌株StrainC43-5C43-6C43-8HG-1Er-2Er-3Er-4血清型Serotypes221a1a1a1a1a年份Years1951195219532018201120132016菌株来源Origin德国Germany四川Sichuan湖南Hunan广东Guangdong河南Henan河南Henan河南Henan分离部位Separation site-脾脏spleen-心脏heart肺脏lung肺脏lung肺脏lung用途Usage疫苗生产株Vaccine production strain疫苗检验株Vaccine test strain疫苗检验株Vaccine test strain临床分离株Clinical isolate临床分离株Clinical isolate临床分离株Clinical isolate临床分离株Clinical isolateLD50(cfu/mL)9112492218112120103注：根据Reed-Muench法13测定1112周龄SPF级雌性BALB/c小鼠的LD50(50%lethal dose)。-：无确定信息。Note:The LD50(50%lethal dose)of SPF female BALB/c mice aged11-12 weeks was measured according to the Reed-Muench method13;-indicates no definite information.中 国 预 防 兽 医 学 报2023年718丝菌C43-5、C43-6、C43-8、HG-1、Er-2、Er-3和Er-4株灭活疫苗(0.2 mL/只)；8组为对照组，注射无菌PBS(0.2 mL/只)；21后采用相同的方法和剂量二免。分别于免疫前、首免后20 d、35 d于每组中各取5只小鼠经尾静脉采血分离血清，按1.4的ELISA方法14测定各组小鼠血清中的抗体水平。按照1.4中的方法攻毒后统计各组小鼠的免疫保护率。1.6数据的统计分析通过SPSS 20.0软件对各组实验数据进行统计学分析，采用检验(Students ttest)和单因素方差分析(One-way ANOVA)(采用Dun-can氏法进行多重比较)比较各组小鼠抗体水平的差异性(0.05表示差异显著，0.01及0.001均表示差异极显著)。2结果2.1灭活疫苗的基本性状和安全性检验将制备的C43-5株、C43-6株、C43-8株、HG-1株、Er-2株、Er-3株和Er-4株灭活疫苗涂板培养，结果显示无细菌生长，表明疫苗中的细菌完全灭活。放置3个月后外观、性状均无明显变化、无分层现象，表明疫苗基本性状稳定。将制备的C43-5株、C43-6株、C43-8株、HG-1株、Er-2株、Er-3株和Er-4株灭活疫苗分别免疫小鼠后未出现明显不良反应，饮食、精神状态和运动等功能均无异常，且均无死亡，表明灭活疫苗制备合格且对小鼠是安全的。2.2免疫猪丹毒活疫苗后小鼠抗体水平的检测结果将2种猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)分别经皮下注射免疫小鼠，于免疫前、免疫后14 d从每组中各取5只小鼠采血，经间接ELISA14检测各组小鼠IgG抗体水平。结果显 示，猪丹毒活疫苗GC42株和G4T10株免疫小鼠14 d后，均诱导小鼠产生了高水平的抗体，并且极显著高于免疫前和PBS组(0.05)(图1)。上述结果表明，2种猪丹毒活疫苗均能诱导免疫小鼠产生较强的体液免疫反应。2.3猪丹毒活疫苗的小鼠免疫保护试验结果将2种传统猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)经皮下注射免疫小鼠，15 d后采用约10 LD50的6株猪丹毒丝菌分别经腹腔注射攻毒。结果显示，无论是使用传统疫苗检验株C43-6(2型)、C43-8(1a型)，还是使用当前流行的1a型分离株HG-1、Er-2、Er-3、Er-4攻毒，2种猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)免疫组小鼠在14 d的观察期内均存活，且无明显的临床症状，保护率均为100%(5/5)。PBS对照组小鼠攻毒后24 h出现精神沉郁、食欲减退或废绝、蜷缩等症状；48 h后开始出现死亡，5 d内全部死亡；死亡小鼠立即剖检，发现其脾、肺、肾等脏器肿大、充血和出血，均呈败血症为特征的剖检病变；从死亡小鼠的心血、肺、肝等脏器均再次分离到猪丹毒丝菌。上述结果表明，我国传统的猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)对我国当前流行的1a型菌株仍具有较强的免疫保护效力，可继续用于当前我国猪丹毒的防控。2.4免疫猪丹毒灭活疫苗小鼠的抗体检测结果将制备的猪丹毒丝菌灭活疫苗株C43-5(2型)及其疫苗检验株C43-6(2型)和C43-8(1a型)，1a型猪丹毒丝菌临床分离株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4的灭活疫苗(共7种)，分别经皮下2次注射免疫小鼠(间隔21 d)，于首免前、首免后20 d、35 d采血，按1.4的间接ELISA方法14检测各组小鼠的IgG抗体水平。结果显示，7种猪丹毒灭活疫苗免疫20 d后，均诱导小鼠产生了高水平的IgG抗体，且极显著高于免疫前和PBS组(0.05)(图2)。首免后35 d，7种灭活疫苗免疫组小鼠的IgG抗体水平与首免后21 d相比均有升高，但均无显著差异(0.05)(图2)。上述结果表明，7种灭活疫苗均能够诱导免疫小鼠产生詹鹏飞，等.我国传统猪丹毒疫苗及流行株灭活疫苗的免疫保护效力评估第7期719*:0.05)，且3种传统菌株与4种当前流行株灭活疫苗诱导小鼠产生的抗体水平相当。2.5猪丹毒灭活疫苗的小鼠免疫保护试验结果 将传统猪丹毒灭活疫苗株C43-5及其疫苗检验株C43-6和C43-8，当前临床分离株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4分别免疫小鼠2次后15 d，采用约10 LD50的6株猪丹毒丝菌分别经腹腔攻毒。结果显示，无论是2株传统的疫苗检验株，还是当前流行的4株临床分离菌攻毒时，传统灭活疫苗株C43-5及其疫苗检验株C43-6和C43-8制备的灭活疫苗均能为小鼠提供80%(4/5)及以上的保护率，其中C43-6株灭活疫苗均能为免疫小鼠提供针对6个菌株攻击的100%保护率(5/5)；但4种临床分离株HG-1、Er-2、Er-3和Er-4制备的疫苗中，仅HG-1株制备的疫苗能够为免疫小鼠提供80%(4/5)及以上的保护率，其余3株分离株制备疫苗的保护率较低，仅为20%60%(1/53/5)(表2)。PBS对照组发病小鼠主要出现精神沉郁、食欲减退或废绝、对外界刺激无明显反应等；攻毒后48 h开始出现死亡，5 d内全部死亡(表2)；死亡小鼠各脏器均呈败血症为特征的剖检病变；从死亡小鼠的心血、肺、肝等脏器均能分离到猪丹毒丝菌。虽然2.4的ELISA结果显示7种灭活疫苗免疫组小鼠之间的IgG抗体水平均无显著差异(0.05)，但其对小鼠提供的保护率差异较大，表明疫苗诱导小鼠产生的IgG抗体水平与其为小鼠提供的保护率之间基本无相关性。表2猪丹毒灭活疫苗的小鼠免疫保护试验结果C43-5 vaccineC43-6 vaccineC43-8 vaccineHG-1 vaccineEr-2 vaccineEr-3 vaccineEr-4 vaccinePBS control221a1a1a1a1a30303030303030300.20.20.20.20.20.20.20.2C43-65/55/54/54/51/52/51/50/5C43-84/55/55/55/53/53/53/50/5HG-14/55/54/55/53/52/53/50/5Er-25/55/55/55/53/53/53/50/5Er-35/55/55/55/52/53/52/50/5Er-45/55/55/55/53/51/53/50/5攻毒菌株与保护率Challenge strain and protection rateDays post first immunization*:0.01;ns:No significant.图27种不同灭活疫苗免疫小鼠抗体水平的检测结果C43-5 vaccine1.51.00.50C43-8 vaccineC43-6 vaccineHG-1 vaccineEr-2 vaccineEr-3 vaccineEr-4 vaccinePBS control35200ns3讨论在20世纪5080年代，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病之一1，随后的30年间猪丹毒的病例报道很少，但近年来猪丹毒又在我国多个省份发生2-3。近年来该病在日本、美国和一些欧洲国家的发生率也呈上升趋势15-17。目前，中国、日本和美国等流行的猪丹毒丝菌血清型主要为1a型，我国使用的主要是猪丹毒灭活疫苗(C43-5株，2型)以及由其衍生的猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)7-9。美国和日本多为猪丹毒活疫苗(R-9株、31株和Ko-ganei65-0.15株，1a型)；英国、乌克兰、俄罗斯等欧洲国家临床分离株多为2型，使用的主要是猪丹毒灭活疫苗(R32/E11株、SE-9株、CN3342株和B-7株，2型)。国内外的这些猪丹毒疫苗多在上世纪中叶研制18。因此，传统疫苗能否对当前流行菌株具有免疫保护效力，值得系统研究。红斑丹毒丝菌是一种多种动物共患的病原菌，多使用小鼠模型研究其的感 染 与 免 疫 反 应19-20。我 国 传 统 猪 丹 毒 活 疫 苗(G4T10株或GC42株)和猪丹毒灭活疫苗(C43-5株)的中 国 预 防 兽 医 学 报2023年720血清型Serotype小鼠数量No.of mice免疫剂量/mLVaccination dose疫苗组别Vaccines types1234567891011121314151617181920詹鹏飞，等.我国传统猪丹毒疫苗及流行株灭活疫苗的免疫保护效力评估第7期721安全检验和效力检验也均使用小鼠作为替代动物6，因此本研究也使用小鼠对其进行当前流行菌株的免疫效力评价。本研究以近年分离的4株1a型猪丹毒菌株，以及传统疫苗检验株2型C43-6、1a型C43-8株通过交叉免疫保护试验系统研究了我国传统猪丹毒灭活疫苗(C43-5株)和猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)的保护效力，证实3种猪丹毒疫苗对我国当前流行菌株仍具有较强的免疫保护效果，仍可继续用于当前我国猪丹毒的防控。本研究还证实，我国使用的2型猪丹毒灭活疫苗(C43-5株)以及由其衍生的猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)15-17，针对传统强毒菌2型C43-6株和1a型C43-8株，以及当前流行的4株1a型猪丹毒丝菌均具有良好的免疫保护效力。值得注意的是，本研究中疫苗检验株C43-6(2型)制备的疫苗对小鼠的免疫保护效力强于疫苗株C43-5，后续将进一步探究C43-6(2型)疫苗对猪的免疫保护效果。本 研 究 结 果 还 显 示，4株1a型 临 床 分 离 株(HG-1、Er-2、Er-3和Er-4)制备的灭活疫苗，均能刺激小鼠产生一定的免疫保护效力，但不同菌株之间的保护率差异较大，HG-1株的免疫原性明显优于Er-2株、Er-3株和Er-4株，表明当前流行的1a型菌株之间也可能存在较大的抗原性差异。综上所述，我国传统猪丹毒活疫苗(GC42株和G4T10株)和猪丹毒灭活疫苗(C43-5株)对当前流行的1a型菌株仍具有良好的免疫保护效力，仍可继续用于当前我国猪丹毒的防控。当前流行的1a型菌株之间也可能存在较大的抗原性差异，在研发新的猪丹毒灭活疫苗时需要系统筛选疫苗菌株。本研究为目前我国猪丹毒的疫苗的防控应用提供了借鉴和参考依据。参考文献：王明俊，刘礼恒，周泰沖，等.猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三种疫苗的同时免疫试验J.畜牧兽医学报，1957，2(2)：113-116.姚焱彬，汪宗梅，殷一凡，等.猪丹毒丝菌SYBR 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