梅毒螺旋体重组酶介导扩增检测方法的建立_刘建礼.pdf

中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1梅毒（Syphilis）是一种广泛流行的性传播疾病，属于我国法定报告的乙类传染病，也是海关出入境检疫的监测传染病之一。据世界卫生组织发布的全球流行报告，2016年全球新增梅毒患者超过630万1，主要集中在南亚、东南亚和次撒哈拉非洲。我国2021年报告梅毒病例48万例，发病率约33/10万，居全国甲乙类传染病报告发病数的第3位2。梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）是梅毒的病原体，因其透明不易着色，又称苍白螺旋体。实验室检测是梅毒临床诊断的主要依据，主要检测方法是暗视野显微镜检查和血清学试验，其中血清学检测应用最为广泛3。核酸检测技术具有极高的敏感性和特异性，在各类病原体的临床检测中展现出良好的应用前景，重组酶介导的等温扩增（Recombi-nase-aid amplification，RAA）技术是近年发展起来的一种核酸检测方法，可以在常温条件下对目的基因进行等温扩增，具有简便、快速、灵敏的特点4。本研究探索建立基于RAA技术的梅毒螺旋体核酸检测方法。1材料与方法1.1材料HIV、HBV、HCV阳性血液及正常血液样本为本实验室保存的出入境体检人群的血液样本。RAA基础荧光反应液、B6100混匀器和1620型Development of recombinase-aid amplification assay for detection ofTreponema pallidumLIU Jianli，JIAO Yanli，XIAO LiliGeneral Administration of Customs（Beijing）International Travel Health Care Center，Beijing 100013，ChinaAbstract：ObjectiveTo establish a recombinase-aid amplification（RAA）assay for the detection of Treponema pal-lidum.MethodsThe primers and probe were designed based on the conserved sequence polyA gene of Treponemapallidum.RAA assay was constructed by primer combination optimization.The sensitivity and repeatability of the es-tablished assay were evaluated by testing standard plasmid.The specificity was tested for common blood-transmittedpathogens such as HIV，HBV，HCV and normal blood samples.ResultsThe low detection limit of the establishedRAA assay was 10 copies/reaction，at which the method still had good repeatability.The detection time of themethod was less than 20 minutes，and a confirmed amplification signal could be detected in 2-3 minutes.No cross-reaction was observed with HIV，HBV，HCV and normal blood.ConclusionThe established Treponema pallidumRAA method was sensitive，rapid and specific.It can be used for the rapid detection of Treponema pallidum in pri-mary laboratories and ports.Keywords：Recombinase-aid amplification；Treponema pallidum；Syphilis论著梅毒螺旋体重组酶介导扩增检测方法的建立刘建礼，焦艳丽，肖利力海关总署（北京）国际旅行卫生保健中心，北京100013摘要：目的建立梅毒螺旋体重组酶介导核酸扩增（RAA）快速检测方法。方法根据梅毒螺旋体polyA基因序列设计引物和探针，通过引物组合优化，筛选建立梅毒螺旋体RAA检测方法，利用质粒标准品评估方法的灵敏度和重复性，检测HIV、HBV、HCV等血液传播疾病病原体，评价方法的特异性。结果建立的梅毒螺旋体RAA方法的灵敏度可达10拷贝/反应，在最低检测限仍有较好的重复性，检测时间少于20 min，最快23 min即可观察到扩增信号，与HIV、HBV和HCV及正常血液样本无交叉反应。结论 建立的梅毒螺旋体RAA方法灵敏、快速、特异性好，适用于基层实验室和口岸现场快速检测梅毒螺旋体。关键词：重组酶介导扩增；梅毒螺旋体；梅毒中图分类号：R183；R377+.1文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.2023.01.002基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFF0302501）通信作者：肖利力，E-mail：6中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1恒温核酸扩增检测仪均为江苏奇天基因生物科技有限公司产品。1.2梅毒螺旋体质粒标准品的构建在GenBank中下载梅毒螺旋体全基因组序列，用DNAStar软件进行同源性分析和BLAST序列比对，筛出高度保守序列。以参考序列（GenBank：U57757.1）为基础，在polyA基因中选取一段长度为620 bp的序列作为检测靶标，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成DNA并制备标准品质粒。计算质粒浓度，换算成拷贝数。1.3引物探针的设计和筛选针对梅毒螺旋体polyA基因区设计了3对引物和1条探针。见表1。将设计的3条正向引物（F1、F2、F3）和3条反向引物（R1、R2、R3）两两组合，形成9对引物组合，与探针（P）组成RAA反应体系，通过反应时间和荧光信号值的大小确定最佳引物探针组合。1.4RAA 扩增体系及条件在RAA干粉管中加入双蒸水16.7 l、RAA基础荧光缓冲液25 l、正反向引物2.1 l、探针0.6 l，混匀，短暂离心，再加2.5 l醋酸镁溶液，然后加入1 l质粒标准品。放入B6100混匀仪39振荡混匀并预反应4 min，之后放入F1620荧光检测仪中39扩增，观察荧光扩增曲线。1.5检测灵敏度将梅毒螺旋体质粒标准品10倍稀释，制备成101105拷贝/l备用。利用上述优化好的RAA扩增体系检测，考察方法的最低检测限。1.6检测特异性取HIV、HBV、HCV阳性血液各2份及正常血液样本10份，提取核酸，利用上述优化的RAA扩增体系检测，考察方法的特异性。1.7检测重复性取7管优化好的RAA扩增体系管，分别加入10拷贝/l的质粒标准品，充分混匀后检测。考察结果的重复性。2结果2.1引物探针的筛选本研究共设计3条RAA正向引物和3条反向引物两两组合形成了9对引物，分别与探针组合，对同一浓度的梅毒螺旋体质粒标准品进行探针优化筛选，结果如图1所示。F3R2引物组合的起峰时间最短，扩增效果最好。阴性对照（NC）无扩增。2.2检测灵敏度RAA方法在梅毒螺旋体质粒标准品10拷贝/l时仍然有明显的扩增曲线，且在10min就起峰。随着质粒标准品浓度升高，起峰时间依次提前。105拷贝/l时样本反应2 min即可检测到荧光扩增信号，阴性对照（NC）无扩增。见图2。表1梅毒螺旋体RAA引物和探针序列Tab.1Treponema pallidum RAA primer and probe sequences名称Name序列（5-3）Sequence（5-3）F1AGTCTTTGATTAAGTTTTTGCGTGCGCATAF2TAAAAATTTTCGTGCATACACAGATTCCAATGF3TACACAGATTCCAATGTGATATTCCGTCTTAR1TTCTTTCCGCTCCTAACGTGGCATACCCTTTGR2CTCCTAACGTGGCATACCCTTTGTCTTTCCR3TGTCTTTCCCGGAAAAGCAGATTGGCACAGPAATAGTAGGAAGTAACTTACATTAGAGGCCT（FAM-dT）G（THF）（BHQ-dTAAAGAACTACGTTC）图1不同引物组合的RAA扩增曲线Fig.1RAA amplification curves with different primer combinationsNCF1R1F1R2F1R3F2R1F2R2F2R3F3R1F3R2F3R325 00020 00015 00010 0005 0000荧光值扩增时间（min）0481216207中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.13讨论近年来，梅毒螺旋体的核酸检测成为梅毒病原学关注的热点5，相对于广泛使用的血清学方法，核酸检测具有更高的敏感性和特异性。核酸检测目前主要针对梅毒螺旋体特异性抗原的开放编码区，常用的检测靶点包括tmpA、bmp、tpp47以及polyA等6，其中polyA基因具有较高的种间特异性，根据polyA基因设计特异引物可以提高检测结果可信性6。检测方法有荧光PCR和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等7，其中荧光PCR灵敏度高、特异性好，但操作要求高，设备投入大，检测时间较长；LAMP法属于恒温扩增，不需特别设备，但引物设计复杂，灵敏度和特异性难以达到荧光PCR的水平。总体来看，核酸检测技术因其操作复杂性、检测时间较长等限制，目前仍未在临床检测推广应用。图2RAA检测灵敏度Fig.2RAA detection sensitivityNCE1E2E3E4E518 00016 00014 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000荧光值扩增时间（min）0481216202.3检测特异性HIV、HBV、HCV等常见血液传染病阳性血液及阴性血液样本经核酸提取后，用优化的RAA体系检测，均未见扩增信号。2.4检测重复性取7管10拷贝的质粒标准品进行平行检测，均有明显的荧光扩增信号，表明在最低检测浓度下，依然有较好的检测重复性。见图3。图310拷贝质粒标准品重复性试验Fig.3Reproducibility test of 10 copies plasmid standard18 00016 20014 40012 60010 8009 0007 2005 4003 6001 8000荧光值时间（min）0369121518（下转第52页）注：E1E5表示质粒标准品浓度依次为101、102、103、104、105拷贝/l。Note：E1 to E5 means the plasmid standard concentration is 101，102，103，104，105copies/l.8中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1RAA是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下进行核酸扩增的技术。结合荧光探针，可以快速、灵敏地检测病原体。RAA不需PCR扩增的反复升降温，只需要带荧光信号收集的恒温装置即可完成检测4。本研究选择梅毒螺旋体的polyA基因作为检测靶标，设计了3对RAA引物，通过优化筛选确定了最佳引物组合和反应体系，建立了基于RAA技术的梅毒螺旋体快速检测方法，灵敏度可达10拷贝/反应，相当于或略优于实时荧光PCR8。从检测时间来看，RAA在最低检测浓度下，上机反应10 min即可见典型的荧光信号；而高浓度下，仅需23 min即可观察到明显的扩增，完成整个检测过程仅需20 min，检测时间仅为荧光PCR的五分之一，已经接近甚至略短于梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）和快速血清反应素试验（RPR）等常用血清学检测方法，使得梅毒的核酸检测走向临床应用具有更大的可行性。同时，由于RAA所需设备轻巧简便，易于携带，更适用于基层实验室和现场快速检测。本研究建立的梅毒螺旋体RAA检测方法具有快速和灵敏的特点，同时对实验硬件要求较低，在口岸或基层实验室具有广阔的应用前景。参考文献1Rowley J，Vander Hoorn S，Korenromp E，et al.Chlamydia，gon-orrhoea，trichomoniasis and syphilis：global prevalence and inci-denceestimates，2016J.BullWorldHealthOrganization，2019，97（8）：548-562.2国家卫生健康委员会.2021年全国法定传染病疫情概况EB/OL.2022-04-22.http：/ 273-2018梅毒诊断S.北京：中国标准出版社，2018.4Lu B，Cheng HR，Yan QF，et al.Rapid amplification of nucleicacids by recombinase-mediated amplification J.Scientia 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