蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析.pdf

第 46 卷 第 3 期Vol.46 No.3 2024 年 3 月Mar.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland蒺藜苜蓿 MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析王悦1，刘亚玲2，苑峰2，王梦迪1，晁跃辉1，*（1.北京林业大学草业与草原学院，北京 100083；2.内蒙古草业技术创新中心有限公司，内蒙古 呼和浩特 010070）摘要：植物中 MYB 转录因子数量众多，功能多样，在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究 MYB 转录因子在蒺藜苜蓿中的功能，本研究采用 PCR 技术从蒺藜苜蓿中克隆 MtMYB16基因，该基因开放阅读框 1074 bp，共编码 357个氨基酸。进化树分析结果显示，MtMYB16蛋白与白花草木樨中 MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示，MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示，MtMYB16蛋白具有自激活活性，自激活结构域位于 C 端。表达分析结果显示，MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达，在根中表达水平最高；IAA、MeJA 能够降低 MtMYB16表达水平；盐胁迫和干旱胁迫下，MtMYB16表达量在 1.0 h时迅速增加，说明 MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。关键词：MtMYB16；蒺藜苜蓿；亚细胞定位；酵母表达；胁迫中图分类号：Q943.2 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）03-0001-10MYB（Myeloblastosis）转录因子是植物中一类重要的转录因子，在植物的生长发育、代谢调控和逆境胁迫等方面具有重要作用1。MYB 转录因子的结构特征是在 C 端含有转录激活域，保证转录活性并参与其他转录因子或 DNA 间的相互作用2，从而导致 MYB基因家族具有多种多样的调控作用；N末端包括 1 个高度保守的 DNA 结合区域，它包括 14个重复，每个重复都由5053个氨基酸残基组成3，决定转录因子与不同作用元件的结合2。根据 N 端保守结构域的重复次数，MYB基因家族大致分为四类：即单一 MYB 结构域的 1R-MYB、两个 R 结构域的 R2R3-MYB、三个 R 结构域的 3R-MYB 以及四个R 结构域的 4R-MYB(含有 4 个重复的 R1/R2)34。其中，R2R3-MYB是最主要的转录因子5，在与植物生长发育相关的激素调节、逆境胁迫、细胞分化以及植物器官的形态建成等方面都发挥着重要的调控作 用67。例 如：Wang 等8在 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）中发现，AtMYB12基因的过表达显著增加了类黄酮的积累，可以增强植物对干旱和氧化胁迫等非生物胁迫的耐受性；徐子寅等9通过启动子活性分析发现，在木薯（Manihot esculenta）中 MeMYB60可以在保卫细胞表达，预示着该基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。此外，R2R3-MYB 转录因子的功能多样性还与它能和其他转录因子形成蛋白复合体有关。例如：R2R3-MYB 转录因子可以与bHLH（Basic-helix-loop-helix）和 WD40 形成蛋白复合体（MBW），调控花青素苷代谢途径中结构基因的转录1011；拟南芥 R2R3-MYB 转录因子 AtMYB2与 bHLH家族蛋白 RdBP1互作，共同调控 Rd22基因（脱水反应基因）的表达1213。研究表明，MYB转录因子同样参与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）生长发育、激素调节以及逆境胁迫等过程。Peel等14在蒺藜苜蓿中检测到 LAP1基因，该基因属于 MYB型转录因子，可以调控黄酮类物质花青素的合成，将其转入紫花苜蓿（Medicago sativa)中，紫花苜蓿的地上部分也可以积累大量的花青素。刘娅菲15通过对蒺藜苜蓿突变体和野生型进行盐胁迫处理，证明 MYB 转录因子家族中 MtRVE7基因在蒺藜苜蓿响应盐胁迫中起重要作用。MYB16作为一种 R2R3-MYB转录因子，在拟南芥中编码一种参与角质生物合成的转录因子，在分生组织中的过表达或异位表达增加了气孔密度，导致气孔簇的形成，并影响细胞外壁结构16。MYB16与 MYB106相互作用可以调节拟南芥花瓣中的表皮细胞形状17，并直接上调WIN1/SHN1基因表达和参与角质生物合成基因的表达1819。吕华君等20从黄芩（Scutellaria baicalensis）中检测出 SbMYB16蛋白，预测可影响植物生长发育和增强植物抗逆性。蒺藜苜蓿属于豆科一年生牧草，因其倍性小（2n=16）、基因组较小（454526 Mb）、自花授粉、生育周DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230226*通信作者，E-mail：收稿日期：2023-08-10；修回日期：2023-10-06基金项目：2023年国家草业技术创新中心（筹）重大创新平台建设专项“苜蓿新品种选育及制繁种关键技术研发”作者简介：王悦（1999-），女，山东临沂人，在读硕士生，研究方向为草地植物育种，E-mail：.1中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期期短（80100 d），已经成为研究豆科植物的模式植物21。干旱和盐胁迫等逆境胁迫是影响草本植物生长发育的重要影响因素2223，研究表明，许多MYB 转录因子在盐胁迫和干旱胁迫中发挥重要作用，而关于蒺藜苜蓿 MYB 转录因子抗旱、耐盐方面的研究相对较少。因此，本试验通过克隆蒺藜苜蓿MtMYB16基因，进行生物信息学预测，分析启动子顺式作用元件，进行亚细胞定位和转录自激活试验以及实时荧光定量表达分析，初步探讨 MtMYB16基因在蒺藜苜蓿中的功能，以期为进一步探究蒺藜苜蓿 MYB转录因子功能奠定基础。1试验材料和方法1.1试验材料试验所需材料为保存在北京林业大学草业与草 原 学 院 分 子 实 验 室 的 野 生 型 蒺 藜 苜 蓿 R108。Master Assembly无缝连接酶、克隆载体 pMD19-T、大 肠 杆 菌 感 受 态 DH5、限 制 性 内 切 酶 Nco 和Sma 由 TAKARA 公 司 提 供，DNA Marker DL 5000 由北京艾克瑞生物公司提供，质粒提取试剂盒、植物基因组 DNA、RNA 提取试剂盒、DNA 凝胶电泳纯化试剂盒由美国 OMEGA 公司提供，利福平、卡那霉素、MeJA 和 IAA 由 Sigma公司提供，2Rapid Taq Master Mix 购于诺唯赞公司，荧光定量UltraSYBR Mixture购于康为公司。1.2试验方法1.2.1引物设计利用 Primer Premier 5.0 软件设计所需要的引物，其中引物 MYB16-F/R 和 MYB16P-F/R 分别用于 MtMYB16 基因和 MtMYB16 启动子克隆，通用引物 M13-F/R 用于构建的克隆载体检测。引物3302Y-MYB16-F/R 用于 3302Y-MYB16 表达载体构建，3302Y-F/R 用于检测植物表达载体是否构建成 功。BD-MYB16-F/R、BD-N-MYB16-F/R 和BD-C-MYB16-F/R分别用于 MtMYB16全长、N 端及 C 端酵母表达载体构建。T7 promer、3BD 用于酵 母 表 达 载 体 鉴 定。引 物 MtACT-F/R 和 RT-MYB16-F/R 分别用于内参基因 MtActin 及目标基因 MtMYB16 荧 光 定 量 PCR 检 测。引 物 序 列见表 1。1.2.2MtMYB16基因和启动子的克隆在花盆中种植蒺藜苜蓿，采用试剂盒方法提取叶片 RNA，将其反转录为 cDNA，以该 cDNA 为模板，通过 MYB16-F/R 扩增 MtMYB16 基因，通过凝胶成像和 DNA电泳分离纯化，得到正确的 PCR纯化产物。16 下连接克隆载体和纯化产物15 min，将合成的连接物转化到大肠杆菌感受态 DH5 中，吸取100 L菌液均匀涂布在LB固体培养基（含50 mg/L氨苄青霉素）上，倒置在 37 培养箱中 12 h。挑取单一菌落，菌落富集后进行 PCR 菌体检测，将条带大小表 1引物名称及序列Table 1Primer names and sequences名称 NameMYB16-FMYB16-R3302Y-F3302Y-RT7 promer3BDBD-MYB16-FBD-MYB16-R3302Y-MYB16-F3302Y-MYB16-RMYB16P-FMYB16P-RM13-FM13-RMtACT-FMtACT-RRT-MYB16-FRT-MYB16-RBD-N-MYB16-FBD-N-MYB16-RBD-C-MYB16-FBD-C-MYB16-R序列(5-3)Sequence(5-3)CCTTCTCTCTTTTTTTCTATCTTACATAACTATAAGCACAATGTCTACTGACGCACAATCCCACTATCCTTCCGTCCAGCTCGACCAGGATTAATACGACTCACTATAGGTTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCATGGCCATGGAGGCCGAATTCGGACGTTCACCATGTTGTGACTGCAGGTCGACGGATCCCCATTACTATTTTCACCTCCAAGAACACGGGGGACTCTTGACCATGGGACGTTCACCATGTTGACGCGTACTAGTCAGATCTACAAACATTGGTGAATCAGAGGTTTTCCTTCCTTTGGACGATGGTGTAAAGCACGCCAACTTCCATGACCGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAACAGCTATGACTGATCTGGCTGGTCGTGACCTTAATGCCTGCTGCTTCCATTCCTATGATCAAAAACTCTTAGCTTATATTGATAGCTGACCACCTGTTCCCTAAATGGCCATGGAGGCCGAATTCGGACGTTCACCATGTTGTGACTGCAGGTCGACGGATCCCCTAACCTTTTCTTAAGATGTGATGGCCATGGAGGCCGAATTCACAAAAATGGGAATTGATCCATGGCCATGGAGGCCGAATTCACAAAAATGGGAATTGATCC2王悦 刘亚玲 苑峰等 蒺藜苜蓿 MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析正确的菌液送至北京睿博生物技术公司进行测序验证。同样，选取长势优良的蒺藜苜蓿植株叶片，利用CTAB 法提取蒺藜苜蓿 DNA。在引物 MYB16P-F/R作用下对 MtMYB16基因启动子进行扩增，后续反应同上述 MtMYB16基因克隆。1.2.3表达载体构建将测序结果正确的菌液通过试剂盒提取质粒，以 3302Y-MYB16-F/R、BD-MYB16-F/R、BD-N-MYB16-F/R 和 BD-C-MYB16-F/R 为引物分别对目的基因扩增，将反应产物经琼脂糖电泳后进行条带鉴别，纯化条带正确的反应产物。将表达载体3302Y 和 pGBKT7分别用 Nco 和 Sma 酶切，酶切产物纯化后与 PCR 纯化产物用无缝连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌，吸取 100 L 菌液涂布在LB 固体培养基（含 50 mg/L 卡那霉素）上，37 倒置培育 12 h。挑取单克隆菌落，菌落富集后进行PCR 菌体检测并将条带大小正确的菌液送至北京睿博生物技术公司测序验证。1.2.4MtMYB16基因的生物信息学分析在 NCBI（https：www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站获取 MtMYB16 基因序列并预测 MtMYB16 蛋白保守结构域。在 Expasy（https：www.expasy.org/resources/protparam）网站预测MtMYB16蛋白分子式、分子量和等电点等，在 SOPMA（https：swissmodel.expasy.org/）对 MtMYB16蛋白三级结构进行预测，用 Cell-PLoc 软件预测 MtMYB16 的胞内定位。通过 MEGA 11 软件构建蒺藜苜蓿 MtMYB16 同源蛋白系统进化树24。1.2.5亚细胞定位将构建好的 3302Y-MYB16 农杆菌菌液加入50 mL LB 溶液（含 50 mg/L 利福平和 50 mg/L 卡那霉素）中，培养箱中避光振荡 12 d后，测其 OD600为0.60.8 时，将菌液用重悬液重悬，然后注射到花盆中健康生长 1 个月左右的烟草叶片的下表皮细胞，继续避光培养 48 h，取注射菌液的叶片制成玻片，倒置在 SP8 激光共聚焦显微镜下，通过 GFP 荧光信号观察目的基因在细胞中的位置。1.2.6酵母转化及自激活检测通过质粒提取试剂盒提取 pGBKT7-MYB16质粒，利用 LiAc 转化法将 pGBKT7-MYB16 转化至Y2HGold 酵母菌株中，取含 pGBKT7-MYB16 的酵母菌液 100 L均匀涂布在 SD/-Trp培养基上，倒置于 30 酵母培养箱中，持续 23 d，挑取单一菌体进行 PCR 检测，然后送至公司测序验证。选取测序结果正确的 pGBKT7-MYB16 酵母菌，在 SD/-Trp液体培养基中摇动，测其 OD600为 0.30.4时，将菌液稀释 10 倍和 100 倍，吸取稀释后的菌液 10 L 分别 滴 在 SD/-Trp、SD/-Trp/X-Gal 和 SD/-Trp/X-Gal/AbA 固体培养基上，倒置于 30 培养箱中23 d，观察酵母菌生长状况。1.2.7自激活结构域分析根据 pGBKT7结构域的位置，在位于 MtMYB16的 N 端 348 bp 处 将 基 因 截 断，构 建 pGBKT7-N-MYB16 和 pGBKT7-C-MYB16 酵母表达载体，分别进行转录自激活检测。自激活检测步骤同上。1.2.8表达分析为探究 MtMYB16在 IAA、MeJA、盐胁迫和干旱胁迫处理下的表达情况，选择生长良好的蒺藜苜蓿分别将 10 mol/L IAA 和 10 mol/L MeJA 均匀地喷洒在叶表面，同样选择长势优良的蒺藜苜蓿植株分别浇 200 mmol/L NaCl 和 200 mmol/L PEG6000溶液，并均在四种处理后第 0、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0、12.0 h取植株叶片，液氮速冻后进行研磨，提取叶片 RNA，将 RNA 反转录为 cDNA，以其为模板进行 qRT-PCR 反应。在反应完成后，将所得数据在Excel 2010软件中采用 2Ct法进行处理。2试验结果2.1MtMYB16基因和启动子的克隆以蒺藜苜蓿cDNA为模板，利用引物MYB16-F/R 对 cDNA 区域进行 PCR 扩增，将其与克隆载体pMD19-T 连接后转入大肠杆菌中，经 PCR 菌体检测，电泳条带长度与目标基因长度基本相同（图 1）。将菌液送至公司进行测序，测序结果与目的基因序列一致，说明该基因已被成功克隆。以蒺藜苜蓿 DNA作为模板，用引物 MYB16P-F/R 进行 PCR 扩增，将其转化大肠杆菌，PCR 菌体检测结果显示与目标基因启动子长度相似（图 2），测序后发现与目标基因MtMYB16启动子序列相同，表明启动子克隆成功。2.23302Y-MYB16 和 pGBKT7-MYB16 表达载体的构建以pMD19-MtMYB16质粒作为模板进行PCR扩增，将其分别与表达载体3302Y和pGBKT7连接后转入大肠杆菌，进行PCR菌体检测后（图3和图4），送至公司测序，其序列与目标基因序列相同，表明 3302Y-MYB16和pGBKT7-MYB16载体构建成功。3中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期2.3MtMYB16生物信息学分析通过 PCR 扩增技术获得 MtMYB16 基因，该基因开放阅读框为 1074 bp，编码 357 个氨基酸。通过对 MtMYB16 基 因 保 守 区 域 的 预 测，发 现 其 属 于REB1 超家族（图 5），由 5464 个原子组成，分子式为C1707H2671N507O567S12，分子总质量为 39.752 kD，理论等电点为 5.7，蛋白质不稳定系数为 47.03，蛋白质结构不稳定。对 MtMYB16蛋白二级结构和三级结构进行预测，发现该蛋白由无规则卷曲、螺旋、-转角和延伸链四部分组成，其中，无规则卷曲比例达51.54%（图 6）。进化树分析显示，MtMYB16蛋白与白花草木 樨（Melilotus albus）、豌 豆（Pisum sativum）、蚕 豆（Vicia faba）中 MYB蛋白高度同源，与白花草木樨中MYB蛋白相似度最高（图7）。2.4亚细胞定位通过 Cell-PLoc 网站预测，MtMYB16 蛋白定位在细胞核中。将构建好的 3302Y-MYB16 载体转入农杆菌后并将其注射到烟草下表皮细胞中培养，激光聚焦显微结果显示 MtMYB16 蛋白定位在细胞核中（图 8）。2.5自激活检测将 pGBKT7-MYB16转入 Y2HGold酵母菌后进行摇菌，并将其按不同稀释倍数点板于不同培养M：DNA marker DL5000 Plus；1，2：MtMYB16基因。M：DNA marker DL5000 Plus；1，2：MtMYB16 gene.图 1蒺藜苜蓿 MtMYB16基因 PCR电泳Fig.1PCR electropherogram of MtMYB16 gene from Medicago truncatulaM：DNA marker DL5000 Plus；1：MtMYB16启动子。M：DNA marker DL5000 Plus；1：MtMYB16 promoter.图 2蒺藜苜蓿 MtMYB16启动子 PCR电泳Fig.2PCR electropherogram of MtMYB16 promoter from Medicago truncatulaM：DNA marker DL5000 Plus；1：3302Y-MYB16载体。M：DNA marker DL5000 Plus；1：3302Y-MYB16 vector.图 33302Y-MYB16载体 PCR检测Fig.3PCR detection of 3302Y-MYB16 vectorM：DNA marker DL5000 Plus；1，2：pGBKT7-MYB16载体。M：DNA marker DL5000 Plus；1，2：3302Y-MYB16 vector.图 4pGBKT7-MYB16载体 PCR检测Fig.4PCR detection of pGBKT7-MYB16 vector4王悦 刘亚玲 苑峰等 蒺藜苜蓿 MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析基，结果酵母菌在 SD/-Trp培养基上正常生长，表明MtMYB16蛋白无毒；在 SD/-Trp/X-Gal培养基上变蓝并正常生长，在 SD/-Trp/X-Gal/AbA 培养基上变蓝但抑制生长（图 9），表明 MtMYB16 蛋白具有转录自激活活性。2.6自激活结构域分析将 pGBKT7-N-MYB16 转 入 Y2HGold 酵 母 菌后摇菌，并将其按不同稀释倍数点板于不同培养基，结果含 pGBKT7-N-MYB16质粒的菌株在 SD/-Trp培养基上正常生长，在 SD/-Trp/X-Gal培养基上正常生长且不变蓝，在 SD/-Trp/X-Gal/AbA 培养基上菌体生长受抑制且菌体变蓝（图 10），以上结果说明 MtMYB16 蛋白在 N 端没有毒性且不存在转 录 激 活 结 构 域。将 pGBKT7-C-MYB16 转 入图 5MtMYB16蛋白的保守结构域Fig.5Conserved domain of the MtMYB16 protein蓝色：螺旋；红色：延伸链；绿色：转角；紫色：无规则卷曲。Blue：Alpha helix；Red：Extended strand；Green：Beta turn；Purple：Random coil.图 6MtMYB16蛋白的二级结构和三级结构Fig.6Secondary and tertiary structure of the MtMYB16 protein图 7MtMYB16蛋白的系统进化树Fig.7Phylogenetic tree of MtMYB16 protein5中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期Y2HGold酵母菌后摇菌，并将其按不同稀释倍数点板于不同培养基，菌株在 SD/-Trp培养基上正常生长，在 SD/-Trp/X-Gal 培养基上正常生长且变蓝，在 SD/-Trp/X-Gal/AbA 培养基上生长受抑制且变蓝（图 10），表明 MtMYB16 蛋白在 C 端具有转录自激活活性。2.7顺式作用元件预测本研究对 MtMYB16 基因启动子区序列进行预测，并对其功能进行初步分析。从表 2 可看出，MtMYB16 基因包含 MeJA 应答元件、IAA 应答元件、防卫和胁迫应答元件等。2.8表达分析利 用 荧 光 定 量 技 术 测 定 蒺 藜 苜 蓿 各 组 织 中MtMYB16 基因的表达量，发现 MtMYB16 基因在蒺藜苜蓿的根、茎、叶、花和果实中均表达，表达量在根中最高，分别是茎中表达量的 7.62 倍，果实中的 5.44倍，叶中的 4.26倍，花中的 2.47倍（图 11）。为探究 MtMYB16 基因在 IAA、MeJA、盐胁迫和干旱胁迫处理下的表达，分别于处理 0、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0、12.0 h时对 MtMYB16基因的表达量进行检测。结果显示，经过外源激素 IAA 处理后，MtMYB16 基因的相对表达量与 0 h 相比呈现下降趋势，在 3.0 h时达到最低水平，占 0 h的 18.0%（图12-A），表明 IAA 可以抑制 MtMYB16表达，且抑制作用较明显；MeJA 处理后，MtMYB16 表达水平变图 8MtMYB16蛋白的亚细胞定位Fig.8Subcellular localization of MtMYB16 protein图 9MtMYB16蛋白的自激活检测Fig.9Detection of the autoactivation of the MtMYB16 protein图 10MtMYB16蛋白自激活结构域分析Fig.10Activation domain analysis of MtMYB16 protein表 2MtMYB16启动子的主要顺式作用元件和功能Table 2The main cis-acting elements and functions of MtMYB16 promoter元件名称Element nameAuxRR-coreBox 4CGTCA-motifGT1-motifTC-rich repeatsTGACG-motif基序序列Motif sequenceGGTCCATATTAATCGTCAGGTTAATGTTTTCTTACTGACG数量Number142712功能Function参与 IAA反应的顺式作用调节元件参与光响应的保守 DNA模块的一部分参与 MeJA响应的顺式作用调节元件光响应元件参与防御和应激反应的顺式作用元件参与 MeJA响应的顺式作用调节元件6王悦 刘亚玲 苑峰等 蒺藜苜蓿 MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析化不规律，但总体呈现下降趋势，在处理 12.0 h 时表达量最低，占 0 h 的 48.3%（图 12-B），说明 MeJA对 MtMYB16的表达具有抑制作用；盐胁迫处理后，MtMYB16表达量在1.0 h时达到最高值，是对照组的2.32 倍，此后表达量均快速下降，在 3.0 h 达到最低值，是对照组的23.8%，在12.0 h时表达量与0 h基本相同（图12-C），说明MtMYB16能够快速增加蒺藜苜蓿盐胁迫的耐受性；干旱胁迫处理后，MtMYB16表达量在 1.0 h时达到最高值，是 0 h的 4.50倍，此后表达量快速下降，在 6.0 h 达到最低值，是 0 h 的 22.47%（图 12-D），说明 MtMYB16能够快速增加蒺藜苜蓿干旱胁迫下的耐受性。3讨论植物中 MYB转录因子可调控多种生物学过程，在植物的器官发育、逆境响应、激素应答等多方面起着重要作用17。本试验通过 PCR扩增技术成功克隆出蒺藜苜蓿 MtMYB16 基因，该基因开放阅读框为1074 bp，编码 357个氨基酸。通过 NCBI数据库和进化树分析得出，MtMYB16蛋白与白花草木樨、豌豆、蚕豆中 MYB蛋白高度同源，相似度最高的是白花草木樨 MYB蛋白。前人的研究证明多数 MYB蛋白定位于细胞核中，如：Zhang等25在银杏（Ginkgo biloba）中鉴定出的 GbMYBFL 蛋白定位于细胞核；贺威智等26对早花百子莲（Agapanthus praecox）MYB基因家族鉴定发现，部分 R2R3-MYB 蛋白可以参与百acbcbc根茎叶花果实0.000.020.040.060.080.100.120.14相对表达水平Relative expression level 植物组织Plant tissues图中不同小写字母表示差异显著（P0.05），下同。Different lower-case letters indicate significant differences（P0.05），the same below.图 11MtMYB16基因的组织表达分析Fig.11Tissue expression analysis of MtMYB16 geneabcbbcbcbcbc0.00.5 1.0 3.0 6.0 9.0 12.0 0.00.20.40.60.81.01.21.41.6ACDBIAA处理时间（h）IAA treatment time（h）盐胁迫处理时间（h）Salt stress treatment time（h）干旱胁迫处理时间（h）Drought stress treatment time（h）MeJA处理时间（h）MeJA treatment time（h）aababbcabbcbc0.00.5 1.0 3.0 6.0 9.0 12.0 0.00.10.20.30.40.50.60.70.8bbadccbc0.00.5 1.0 3.0 6.0 9.0 12.0 0.00.20.40.60.81.0bbabcbcbc0.00.5 1.0 3.0 6.0 9.0 12.0 0123456相对表达水平Relative expression level 相对表达水平Relative expression level 相对表达水平Relative expression level 相对表达水平Relative expression level 图 12MtMYB16基因的表达分析Fig.12Analysis of MtMYB16 gene expression7中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期子莲类黄酮生物合成途径，亚细胞定位显示 6 个R2R3-MYB 蛋白均在细胞核中，其中 ApMYB123 主要分布在核仁中，预示着 ApMYB123具有更强的转录激活能力。本研究亚细胞定位结果表明MtMYB16蛋白定位于细胞核，与预测结果相同，也与前人研究结果一致。酵母双杂交技术常用于研究蛋白质之间的相互作用，利用诱饵蛋白筛选 cDNA文库，可以获得与诱饵蛋白互作的候选蛋白2728。在利用诱饵蛋白进行筛选前，首先要将诱饵蛋白的自激活能力排除，否则会引起其下游启动子调节的报告基因表达，从而导致结果假阳性29。本研究将 pGBKT7-MYB16 质粒转入酵母菌并表达，结果表明 MtMYB16蛋白具有转录自激活活性，将 MtMYB16基因按 N端和 C端截断后，再次构建 pGBKT7-N-MYB16 和 pGBKT7-C-MYB16 载体并分别转入酵母菌进行转录自激活验证，发现该蛋白在C端存在转录自激活结构域。这与前人研究的 R2R3-MYB转录因子在 C端含有转录激活域，在 N 端含有 MYB 保守结构域的结果吻合2。该结果为后续筛选蒺藜苜蓿cDNA文库和MtMYB16的互作蛋白提供了参考。表达分析结果表明，MtMYB16基因在根、茎、叶、花和果实中均能够表达，但表达量存在着一定的差异，MtMYB16基因在根中的表达量是最高的。Zhang等25研究表明 MtMYB14、MtMYB18和MtMYB37等同样在根中表达量最高，推测 MtMYB16与这些基因功能相似且在根中发挥作用最大。李殷睿智等1通过荧光定量试验表明，在外源激素 IAA的诱导下，蒺藜苜蓿 MtMYB 基因表达量总体呈现先上升后下降的趋势，表明该基因在植物生长发育过程中可能发挥作用。本试验中，在 IAA和 MeJA诱导后，MtMYB16表达量总体呈现降低趋势，推测 MtMYB16基因也参与调节蒺藜苜蓿的生长发育。干旱胁迫是影响农作物生长发育及产量的重要逆境因素，研究表明干旱胁迫受两大类信号通路的调控，即将胞外水分胁迫信号与功能基因表达联系在一起的ABA依赖途径和胞外水分胁迫信号直接通过第二信使系统调控相应转录因子，进而引起功能基因表达的ABA非依赖途径30。有研究报道，拟南芥 AtMYB2能够通过 ABA 依赖途径诱导干旱胁迫相关基因表达，提高干旱胁迫耐受性12。任明辉等31在研究紫花苜蓿 R2R3-MYB亚家族干旱胁迫的响应中发现，MsMYB52、MsMYB268和 AtMYB2 均属于系统发育树的 S20 分组，推测MsMYB52 和 MsMYB268 能在紫花苜蓿的干旱胁迫响应中发挥作用，通过 qRT-PCR验证，MsMYB52和MsMYB268等 9个基因在干旱条件下的表达量明显升高，推测它们可能在响应干旱胁迫中发挥重要作用。在本研究中，MtMYB16表达量在盐胁迫和干旱胁迫处理后 1.0 h均迅速增加，因此推测 MtMYB16可能具有响应盐胁迫和干旱胁迫的功能，可以为后续选育蒺藜苜蓿耐盐、抗旱转基因品种提供帮助。4结论本研究成功克隆出蒺藜苜蓿 MtMYB16 基因，该基因开放阅读框为 1074 bp，共编码 357个氨基酸。亚 细 胞 定 位 结 果 显 示，MtMYB16 蛋 白 定 位 在 细胞核中。酵母双杂交试验结果表明，MtMYB16 蛋白具有转录自激活功能，其激活域位于蛋白质 C端。植物组织表达分析结果显示，MtMYB16 在根中的相对表达量最高。在IAA和MeJA激素诱导下，MtMYB16 转录水平有所降低，说明 MtMYB16 基因可能响应 IAA 和 MeJA 的诱导。在盐胁迫和干旱胁迫下，MtMYB16表达量在 1.0 h均快速增加，说明该转录因子可能参与盐胁迫和干旱胁迫的表达，对耐盐和抗干旱机制可能具有响应作用。参考文献（References）：1 李殷睿智，冷暖，穆致远，等.蒺藜苜蓿转录因子 MtMYB 的克 隆、表 达 分 析 及 拟 南 芥 转 化J.分 子 植 物 育 种，2020，18（9）：2769-2775.LI Yinruizhi，LENG Nuan，MU Zhiyuan，et al.Cloning and expression analysis of transcription factor MtMYB and trans-formation of Arabidopsis thaliana J.Molecular Plant Breeding，2020，18（9）：2769-2775.2 刘蕾，杜海，唐晓凤，等.MYB 转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理 J.遗传，2008（10）：1265-1271.LIU Lei，DU Hai，TANG Xiaofeng，et al.The roles of MYB transcription factors on plant defense responses and its 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