本科毕业论文---草果gcms指纹图谱研究.doc

2015年度本科生毕业论文（设计）

草果GC-MS指纹图谱研究

院 － 系： 理学院 化学系
专 业： 化学专业
年 级： 2011级
学生姓名： 何宣鹏
学 号： 201101020132
导师及职称： 吴娜（讲师）

2015年4月
2015Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate

Study on GC-MS fingerprint of Amomum Tsao Ko

Department: Chemistry Department， College of Science
Major: Chemistry
Grade: 2011
Student’s Name: Xuanpeng He
Student No.: 201101020132
Tutor: Na Wu（Lecturer）

Finished by April， 2015
毕业论文（设计）原创性声明

本人所呈交的毕业论文（设计）是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意.

作者签名： 日期：

毕业论文（设计）授权使用说明

本论文（设计）作者完全了解红河学院有关保留、使用毕业论文（设计）的规定，学校有权保留论文（设计）并向相关部门送交论文（设计）的电子版和纸质版.有权将论文（设计）用于非赢利目的的少量复制并允许论文（设计）进入学校图书馆被查阅.学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容.保密的论文（设计）在解密后适用本规定.

作者签名： 指导教师签名：

日期： 日期：
何宣鹏 毕业论文（设计）答辩委员会(答辩小组)成员名单

姓名
职称
单位
备注
周波
讲师
红河学院理学院
主席（组长）
吴娜
讲师
红河学院理学院
组员
龙云惠
讲师
红河学院理学院
组员
徐世娟
助教
红河学院理学院
组员

红河学院本科毕业论文（设计）

摘 要

论文以红河州金平县的草果为参考样品，寻找最佳静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）条件，优化提取和进样方式，在优化条件下，对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性成分进行测定，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析。GC-MS的优化条件为：分流比为20:1、柱流量为1.0、色谱柱为HP-FFAP；草果超声提取顶空进样的振荡温度为140℃，振荡时间为20min；草果干粉顶空进样振荡温度为150℃，振荡时间为10min；草果的最佳提取进样方式为：干粉顶空进样。草果不同部位共鉴定出86个化合物。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行相似度表明：草果不同部位样品差异大，分布不稳定；不同产地的草果挥发性成分和含量虽然有差异，但是分布比较稳定；不同炮制方法的草果挥发性成分很相近，而且样品分布很稳定，说明草果通过炮制后药性很稳定。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行聚类分析表明：草果果不同部位样品可以分为2类；草果不同产地样品可以分为2类；草果不同炮制方法样品可以分为3类。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行主成分分析表明：草果不同部位样品共提取了3个主成分；草果不同部位共有化学成分共提取了4个主成分；草果不同产地样品共提取了3个主成分；草果不同炮制方法样品共提取了3个主成分。

关键词：草果，气相色谱-质谱，指纹图谱，相似度分析，聚类分析，主成分分析

ABSTRACT

The Jinping County in Honghe Prefecture of Amomum Tsao Ko as reference sample,to find the best static headspace gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS) condition,optimization of extraction and injection method,under the optimized conditions, The different parts (fruit, fruit shell, seed, stem, leaf, bud) volatile components were determined, and the establishment of different parts (fruit of Amomum Tsao Ko, shell, kernel,stem, leaf, bud), different areas (Chuxiong, Lijiang, Honghe, Dali, Yuxi, Wenshan), different processing methods (frying, salt, ginger, vinegar, net system) GC-MS fingerprint of thevolatile, "traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system 2004A version of" software to calculate the similarity of fingerprints, cluster analysis, principal component analysis of the fingerprint by SPSS 19 software. Optimization of conditions for GC-MS: the split ratio was 20:1, the column flow rate is 1, the column was HP-FFAP; ultrasonic extraction temperature oscillations of Amomum Tsao Ko headspace is 140℃, the reaction time was 20min; the dry powder of Amomum Tsao Ko headspace oscillationtemperature 150 ℃, reaction time was 10min; the best extract of Amomum Tsao Ko andsampling methods for dry powder: Headspace sampling. Apples in different regions were identified 86 compounds. Volatile fingerprints of different parts of Amomum Tsao Ko, different regions, different processing methods for similarity showed that: large differences in different samples of Amomum Tsao Ko, unstable distribution; Amomum Tsao Ko volatile constituents and content in different areas although there are differences, but the distribution is relatively stable; not exceeding the processing method of volatile components with very similar, and the sample distribution is very stable after that, through the processing of Amomum Tsao Koresistance stability. Volatile fingerprints of different parts of Amomum Tsao Ko, different regions, different processing methods of cluster analysis showed that: the grass fruit in different parts of the sample can be divided into 2 categories; including different origin samples can be divided into 2 categories; including different sample processing methods can be divided into 3 categories. Principal component analysis showed that volatile fingerprints of different parts of Amomum Tsao Ko, different regions, different processing methods: Amomum Tsao Ko different samples of 3 principal components are extracted by different parts of fruit;total chemical constituents extracted a total of 4 principal components; fruit of different origin samples extracted a total of 3 samples including different principal component; processing method of 3 principal components are extracted by.
Keywords: Amomum Tsao Ko, Gas Chromatograph-Mass Spectrometry, the Fingerprint,Similarity Analysis,Cluster analysis,the Principal Component Analysis

目 录
1引言 1
1.1 草果中的化学成分 1
1.2 中药指纹图谱技术 1
1.3 静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS） 2
1.4 草果的炮制 2
1.5 实验的分析方法 3
1.5.1 相似度分析 3
1.5.2 聚类分析 3
1.5.3 主成分分析 4
1.6 论文研究的现状 4
1.6.1 草果的研究进展 4
1.6.2 中药指纹图谱的研究进展 5
1.7 论文研究的内容及意义 5
2 实验部分 7
2.1材料、试剂及仪器 7
2.1.1 主要材料 7
2.1.2 主要仪器及试剂 8
2.2 实验、仪器条件 9
2.3 实验步骤 11
2.3.1 样品的预处理 11
2.3.2 样品的制备 11
2.3.3 样品检测 11
2.4 数据处理 11
2.5 实验流程图 12
3 结果与讨论 13
3.1 草果HS-GC-MS条件选择 13
3.1.1 草果超声提取直接进样挥发性成分分流比、柱流量、色谱柱的选择 13
3.1.2草果超声提取顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择 17
3.1.3草果干粉顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择 20
3.1.4 草果挥发性成分提取和进样方式的比较 22
3.2 草果不同部位挥发性成分的测定 24
3.3 草果不同部位挥发性成分GC-MS指纹图谱研究 33
3.3.1草果不同部位挥发性成分指纹图谱的建立 33
3.3.2草果不同部位挥发性成分指纹图谱的相似度分析 33
3.3.3草果不同部位挥发性成分指纹图谱的聚类分析 35
3.3.4 草果不同部位挥发性成分指纹图谱的主成分分析 35
3.3.5 草果不同部位挥发性成分的主成分分析 38
3.4 草果不同产地挥发性成分GC-MS指纹图谱研究 42
3.4.1草果不同产地挥发性成分指纹图谱的建立 42
3.4.2 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的相似度分析 43
3.4.3草果不同产地挥发性成分指纹图谱的聚类分析 44
3.3.4 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的主成分分析 45
3.5 草果不同炮制方法挥发性成分GC-MS指纹图谱研究 48
3.5.1草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的建立 48
3.5.2 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的相似度分析 48
3.5.3草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的聚类分析 50
3.5.4 草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的主成分分析 50
4 结论 54
参考文献 57
致　谢 59

1引言
草果为姜科豆蔻属多年生草本植物草果的果实，全株有辛香味，为一种药食同源的植物[1]，干燥成熟的草果果实既是一种传统的中药材，又是日常生活中必备的食用香辛料。具有温中、健胃、消食、顺气的功能[2]，主治心腹疼痛、脘腹胀满、恶心呕吐、咳嗽痰多、疟疾寒热等。我国云南、广西、贵州、四川等省区都有种植[3]，云南是国内草果生产的主产地。草果不同部位、不同产地、不同炮制方法挥发性成分有所不同，含量也有差异，可以通过GC-MS指纹图谱对草果的差异性进行研究。
1.1 草果中的化学成分
草果带有香气，主要含有挥发性成分，主要是1,8-桉油素、α-蒎烯、β-蒎烯、对-聚伞花烃、柠檬烯、柠檬醛、樟脑、芳樟醇、壬醛、α-松油醇、α-水芹烯、橙花叔醇、香叶醇、草果酮、香茅醛、4-香芹薄荷酮、牛儿醛等，目前对草果的化学成分研究主要是挥发油[4]。此外， 研究还发现草果中含有淀粉、油脂及Zn、Mn、Cu 、Fe、Ni、Sn、Pb 等微量元素。
草果挥发性成分提取方法有回流提取、超临界CO2 流体萃取、超声提取、微波萃取[5]、顶空提取，分析方法大多为气相色谱-质谱法（GC-MS）。
1.2 中药指纹图谱技术
中药中药指纹图谱是指中药材或中成药经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识该中药特性的共有峰的图谱[6]。通过比较供试品和标准品图谱间的相似程度, 可鉴别中药材真伪，判断中药材或中成药批次间质量差异， 从而实现中药材的质量评价和控制。
中药指纹图谱主要的分析方法有有高效液相色谱(HPLC) 法、气相色谱(GC) 法、高效毛细管电泳(HPCE) 法、红外光谱( IR)法、质谱( MS)法、核磁共振( NMR) 法、X-射线衍射( XRD) 法等[7]。
中药指纹图谱有两个特点：一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地，二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的鉴定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。

1.3 静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）
静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）是在已达到平衡的密闭容器中液体或固体分析物的顶部空间取气态(或蒸气) 样品，并与气相色谱结合对气态(或蒸气) 样品进行分析，质谱作为检测器，准确鉴定化合物的一种比较特殊的分析技术。顶空气态取样的主要优点是避免了在直接的液体或固体取样时使复杂的样品基体成分一起被带入分析仪器系统的可能性，从而消除了由基体成分的带入而对样品中可挥发性成分的分析所造成的影响和干扰[8]。
传统分析挥发油的方法是采用水蒸气蒸馏或有机溶剂提取再进行气相色谱分析。水蒸气蒸馏和有机溶剂提取会损失掉一些低相对分子质量的萜类和小分子量的酯类等易挥发的化合物，这些化合物往往对挥发油的气味起着重要的作用。采用顶空分析法分析挥发油，可以为气味分析提供第一手信息，在含挥发油的中草药研究及其品质控制方面具有良好的应用前景。顶空分析包括静态顶空分析、动态顶空分析（吹扫捕集）、顶空-固相微萃取三大类，其中静态顶空分析法具有快速、自动化程度高、样品消耗量少、检测费用低等优点，并且可以最大程度地避免溶剂提取所带来的分析本底，近年来在挥发油的气味分析方面得到了快速的发展[9]。
1.4 草果的炮制
中药必须经过炮制之后才能入药，是中医用药的特点之一。中药炮制是根据中医药理论，依照辨证施治用药的需要和药物自身性质，以及调剂、制剂的不同要求，所采取的制药技术。中药的炮制对药物疗效的影响包括对临床疗效、药性（性味、升降浮沉、归经、毒性）、药物成分的影响等[10]。
草果的炮制在宋代以前基本上没有什么记载，宋代起，随着社会的进步和临
床上的需要，草果的炮制方法兴盛起来，出现了净制、切制、煨制、火炮、制炭、麝香制、姜制等多种炮制方法，极大的丰富了草果的临床用药，近现代在历代炮制的基础上，对草果的炮制进行适当的发展，形成了现在各地不同的草果炮制方法，使草果的炮制更具操作性。不同炮制方法的草果，其临床疗效、药性有所不同，主要表现在化学成分的差异上[11]。草果的炮制方法，自古至今有很多种，论文只列举出典型的五种，对不同炮制方法的草果的指纹图谱和化学成分进行研究。

1

表1-1 草果的炮制方法
炮制方法
文献记载
文献出处
净制
除去外壳，搓散，筛去膜质的假种皮[12]。
《四川省中药饮片炮制规范》
炒制
取原药材放入锅内，用文火炒至外表黑褐，发泡，有香气时取出，放冷，筛去灰屑，用时捣碎[13]。
《云南省中药咀片炮制规范》
盐制
取草果，除去硬壳后，将仁搓散，放入锅中，
用文火加热，炒香后，喷放盐水，继续炒干，
取出，晾凉。每草果100Kg，用食盐2Kg[14]。
《贵州中药饮片炮制规范》
姜制
取净草果仁，加姜汁拌匀，置锅内用文火炒干，取出，晾干。用时捣碎。每草果仁100Kg，用生姜10Kg或干姜3Kg[15]。
《中华人民共和国药典》2005年版
醋制
醋煮[16]
《嵩崖尊生全书》
1.5 实验的分析方法
1.5.1 相似度分析
在中药指纹图谱研究中，如何运用指纹图谱所提供的信息是一个非常重要的环节。现在常用的方法是通过评价中药指纹图谱之间的相似度来判断中药的质量是否稳定合格。以相似度判断中药的质量，关键在于中药中各成分含量发生变化计算的相似度结果是否发生相应的改变。
中药指纹图谱是表征中药复杂成分与其质量关系的重要手段。在表征过程中，相似度评价起着关键作用。目前常用的相似度评价方法主要有峰重叠率法（Nei系数法），相关系数法，距离系数法，向量夹角余弦法与峰重叠率和共有峰强度结合法（改进的Nei系数法）。论文文采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对其指纹图谱进行相似度计算，了解各样品之间的差异和变化规律[17]。
1.5.2 聚类分析
聚类分析可以将一组数据按照本身的内在规律较合理地分为几类， 通过比较各事物之间的性质，将性质相近的归为一类，性质差别较大的归入不同类，缩小主观判断所造成的误差，具有较好的科学性和客观性[18]。它适用于事先并不知道对象类别的面貌，甚至连共有几个类别也不能确定的情况，符合中医认识疾病的思维方法，故目前，聚类分析在中医药研究中被逐步采用，是中医药客观化、标准化研究中的一种新的思路。论文采用SPSS19.0软件对指纹图谱进行聚类分析，了解样品之间的差异和成分的变化规律。
1.5.3 主成分分析
主成份分析是一种常用的多元统计方法，它在社会经济、企业管理及地质、生化、医药等各个领域中都有着广泛的应用，如服装行业的服装定型、企业的经济效益分析、新开发项目目标的制订等问题[19]。主成份分析的目标,就是要对多变量的高维系统进行最佳简化。也就是说，要在力保数据信息丢失最少的原则下，对高维变量空间进行降维处理。论文采用SPSS19.0软件对指纹图谱进行主成分分析，了解样品的综合性、深层次特征。
1.6 论文研究的现状
1.6.1 草果的研究进展
目前，研究者对草果的研究主要集中在基源植物、栽培技术研究、生药材鉴定（性状鉴定、显微鉴定、中药化学鉴定、GC-MS 指纹图谱鉴别、气相定量测定）、中药化学成分、炮制的研究、药理作用(镇痛、抗胃溃疡、抗乙肝病毒)、临床用药（治疗乙型肝炎、治疗牛瘤胃鼓气、治疗腹部手术后腹胀）、生理功能研究等方面[20]。
目前，对草果GC-MS指纹图谱研究，如吴惠勤等采用PR混合溶剂超声提取中药材草果的挥发油，运用GC- MS分析其化学成分及相对含量，建立草果挥发油的GC-MS 指纹图谱，化学成分相对含量较高，各组分间比例基本保持恒定，可作为草果的特征成分，为鉴别中药草果真实性及评价其质量的指标提供依据[3]；丁艳霞等采用GC-MS方法建立草果挥发油指纹图谱，探讨GC-MS联用技术在草果挥发油质量控制方面应用的可行性，不同产地草果油的指纹图谱中各成分均得到了较好的分离，具有特征性和唯一性，作为草果油质量的控制方法[21]。
在HS-GC-MS优化条件下，通过质谱（MS）对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性成分进行测定，采用峰面积归一法计算各组分的相对含量，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析的文章未见报道。
1.6.2 中药指纹图谱的研究进展
我国中药指纹图谱研究最早可以追踪到60年代，目前国内中药指纹图谱的研究还处在初级阶段，但近年来成为中药质量控制的研究热点之一。国内众多的研究人员正在尝试运用各种方法构建中药指纹图谱应用于中药材和中成药的质量控制，以寻求一种可行的中药指纹图谱控制质量的法定标准。由于中药注射液的特殊性，我国决定先采用中药指纹图谱控制中药中注射剂的质量。由于中药注射液的特殊性，我国决定先采用中药指纹图谱控制中药中注射剂的质量。国家药品监督管理局要求中药注射剂应固定药材产地，建立药材和制剂的指纹图谱标准”，并颁发了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）等相应的指导原则。我国对中药指纹图谱的研究目前主要为使用各处方法建立中药材及制剂的指纹图谱以及对相应信息进行数字化处理，使其能评价和控制中药材及制剂的质量。
国外对于指纹图谱的研究较国内已达到了较高阶段。国外有关指纹图谱的报道无一例外地将指纹图谱作为鉴别项，评价草药的真实性以及产品质量的一致性，韩国、日本、德国等，都比较重视对植物药的开发和利用德国用指纹图谱技术控制银杏制剂的质量，在国际上具有很强的竞争力。美国FD A 已开始接受指纹图谱，在递交新药成分控制资料时，植物物质和植物产品的质量控制部分的鉴别项应包括指纹图谱。WTO在中草药指南中同样对植物制品和最终产品如果有效成分不能鉴别，可提供特征成分或混合成分的指纹图谱鉴别以保证产品质理的一致性。英国、印度以及WTO 等药品管理机构，也都采用指纹图谱技术对植物药、草药质量进行评价[22]。目前，国外开展的植物制剂指纹图谱研究, 主要还是针对单味药材提取物而言，在植物制剂的整体性作用和药效相关性方面研究很少。
1.7 论文研究的内容及意义
论文以金平县草果为参考样品，对草果的GC-MS条件（分流比、柱流量、色谱柱）进行优化，对静态顶空（HS）进样条件（超声提取顶空进样和干粉顶空进样的振荡温度、振荡时间）进行优化，对不同的提取进样方式（超声提取直接进样、超声提取顶空进样、干粉顶空进样）进行优化，在优化条件下，通过质谱（MS）对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性成分进行测定，采用峰面积归一法计算各组分的相对含量，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件[23]对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析，为草果的快速鉴别、品质的评价、质量的控制、生产工艺提供参考。

57

2 实验部分
2.1材料、试剂及仪器
2.1.1 主要材料
草果的不同部位（壳、仁、果、茎、叶、芽）来自红河州金平县，不同产地的草果分别来自红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山，红河的草果来自金平县草果种植户。
表2-1 草果样品的产地、不同部位的颜色
产地
部位
颜色
外观形状
平均质量（g）
红河
壳
棕黑色
圆形
3.5702
仁
黄色
茎
绿色
叶
绿色
芽
红色
楚雄
壳
棕黄色、棕黑色
椭圆形、圆形
3.5228
仁
棕红色
丽江
壳
棕黑色
椭圆形
3.3659
仁
棕黄色
大理
壳
棕黄色
椭圆形
4.1099
仁
棕红色
玉溪
壳
棕黑色、棕黄色
椭圆形、圆形
3.3509
仁
淡黄色
文山
壳
棕黄色
椭圆形
4.6328
仁
棕红色

2.1.2 主要仪器及试剂
表2-2 主要仪器及试剂
仪器与试剂
型号与规格
生产厂家
气相色谱-质谱联用仪（配有AOC-5000自动进样器）
GC-MS-QP 2010
日本岛津公司
超声波清洗器
SK5200HP
上海科导超声仪器有限公司
高速万能粉碎机
DFY-400
温岭市林大机械有限公司
电子天平
CP224C
奥豪斯仪器（上海）有限公司
电热鼓风干燥箱
DHG-9070A
上海-恒科学仪器有限公司
电子万用炉
220V，1kW
浙江省上虞市通州实验仪器厂
直接进样针
10uL
日本岛津公司
静态顶空进样针
10uL
美国安捷伦公司
中药筛
100目
温岭市林大机械有限公司
直接进样瓶
2mL
北京欣惠泽奥科技有限公司
静态顶空进样瓶
20mL
广州市鸿州实验器材科技有限公司
漏斗
直径：90mm
深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司
化学分析滤纸
直径：15cm
上海敬智过滤材料有限公司
色谱柱： Rtx-5MS
30m×0.25mm×0.25μm
美国Restek公司
色谱柱： DB-1701
30m×0.250mm×0.25μm
美国安捷伦公司
色谱柱：HP-FFAP
30m×0.250mm×0.25μm
美国安捷伦公司
移液管
10mL
深圳玻璃仪器公司
具塞三角烧瓶
50mL
深圳玻璃仪器公司
烧杯
50mL、100mL
深圳玻璃仪器公司
自封袋
12×17cm
台州市冠龙塑业有限公司
正己烷
AR
天津市风船化学试剂科技有限公司
丙酮
AR
重庆川东化工有限公司
生姜

食醋
糯米白醋
加加食品集团股份有限公司
食盐
白象牌
云南盐化股份有限公司

2.2 实验、仪器条件
表2-3实验、仪器条件
超声条件
超声时间
30min
料液比
1:15
提取溶剂
正己烷
超声功率
200W
GC条件
柱箱温度
80℃
进样口温度
220℃
分流比
20:1
柱流量
1.0ml/min
总流量
24.0 ml/min
吹扫流量
3.0ml/min
载气
He（纯度≥99.999%，压力：13.5±0.5Mpa，吴江梅塞尔工业气体有限公司）
气相毛细管色谱柱
HP-FFAP（30m×0.250mm×0.25μm）
程序升温
初始温度80℃，保持3min，以6℃/min速度升至180℃，保持2min
总运行时间
21.67min
MS条件
离子源温度
200℃
接口温度
220℃
检测器电压
0.88KV
溶剂延迟时间
2min
m/z
35-1000
直接进样
条件
Cycle（循环）
GC-Inj
Syringe（针体积）
10uL
Sample Volume（进样体积）
1.0uL
Air Volume（空气体积）
0nL
Pre cln slv1（进样前清洗-溶剂1）
2
续表2-3
直接进样
条件
Pre cln slv2（进样前清洗-溶剂2）
2
Pre cln spl（进样前清洗-样品）
2
Fill Volume（排气体积）
5.0uL
Fill Speed（针杆速度）
5uL/s
Fill Stokes（拉杆次数）
5
Pullup Del（补偿时间）
300ms
Inject to（进样口）
GC-Inj1（进样口1）
Inject Speed（进样速度）
50uL/s
Pre Inj Del（进样前补偿时间）
500ms
Pst Inj Del（进样后补偿时间）
500ms
Pst Cln Slv1（进样后清洗-溶剂1）
3
Pst Cln Slv2（进样后清洗-溶剂2）
0
静态顶空（HS）条件
Cycle（循环）
HS-Inj
Syringe（进样针体积）
2.5ml
Sample Volume（进样体积）
250uL
Incubat Temp（振荡箱温度）
140℃（液体）、150℃（干粉）
Incubat time（振荡时间）
20min（液体）、10min（干粉）
Agi Speed（振荡速度）
250rpm
Agi on Time（振荡开启时间）
5s
Agi off Time（振荡停止时间）
2s
Syringe Temp（进样针温度）
80.0℃
Fill Speed（针杆速度）
200ul/s
Pullup Del（补偿时间）
1s
Inject to（进样口）
GC- Inj1（进样口1）
Inject Speed（进样速度）
500ul/s
Syr Flushing（气体吹针时间）
120s
GC-Runtime（气相运行时间）
22.00min

2.3 实验步骤
2.3.1 样品的预处理
将草果不同部位（壳、仁、果、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、文山、玉溪）、不同炮制方法（净制、炒制、盐制、姜制、醋制）的草果于万能中药粉碎机中粉碎，过100目中药筛，并储存在密封袋中，贴上标签。草果的茎、叶、芽放入电热鼓风干燥箱中，于50℃下烘60h，再粉碎；壳、仁、果、不同产地的草果直接粉碎，草果的炮制方法见表1-1。
2.3.2 样品的制备
准确称取三份1.00g的草果干粉样品，其中两份分别置于50mL的具塞三角烧瓶中，加入15.00mL正己烷溶剂，超声处理30min，超声功率：200W，过滤，加5.00mL的正己烷洗涤残渣，过滤，合并滤液，取适量体积的溶液分别加入直接进样瓶和顶空进样瓶；另一份草果干粉样品直接加入顶空进样瓶，待测。
2.3.3 样品检测
将待测样品于GC-MS进行检测，检测条件见2.2。
2.4 数据处理
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、Microsoft Office 2013、Orgin7.5中文版、SPSS 19.0中文版进行数据处理。

2.5 实验流程图图2-1 实验流程图

3 结果与讨论
3.1 草果HS-GC-MS条件选择
3.1.1 草果超声提取直接进样挥发性成分分流比、柱流量、色谱柱的选择
准确称取金平县草果样品1.00g于50mL具塞三角烧瓶中，加入15.00mL正己烷溶剂，超声处理30min，超声功率：200W，过滤，加5.00mL的正己烷洗涤残渣，再过滤，合并滤液，取适量体积的溶液加入直接进样瓶。将待测样品于GC-MS进行检测，检测条件见2.2，分别改变GC条件的分流比、柱流量、色谱柱，讨论分流比、柱流量、色谱柱对草果挥发性成分提取的影响，分流比分别设置为不分流、10:1、20:1、50：1，柱流量分别设置为0.5、1.0、1.5，色谱柱分别为Rtx-5MS、HP-FFAP、DB-1701，不同分流比、柱流量、色谱柱的GC-MS图谱分别见图3-1、3-3、3-5，时间、信号三维图谱分别见图3-2、3-4、3-6，

图3-1 不同分流比对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱
注：从下往上分流比分别为不分流、10:1、20:1、50:1

图3-2 不同分流比对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱

图3-3 不同柱流量对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱
注：从下往上柱流量分别为0.5、1.0、1.5

图3-4 不同柱流量对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱

图3-5 不同色谱柱对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱
注：从下往上色谱柱分别为Rtx-5MS、DB-1701、HP-FFAP

图3-6 不同色谱柱对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱

由图3-1、3-2可以看出，当分流比为20:1时出峰较多、重叠峰少、杂峰少、峰形对称、分离效果好。分流比为10:1时峰形没有20:1时对称；分流比为10:1时出峰比20:1时少，且峰形较小；不分流时峰形虽然比分流比20：1时峰