多杀性巴氏杆菌重组Dot蛋白对小鼠免疫保护效果研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202304011多杀性巴氏杆菌重组Dot蛋白对小鼠免疫保护效果研究王宇凤1覮，苏静明1覮，邵萌萌1，刘鑫1，黄复深1,2*(1.湖南农业大学 动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 湖南兽药工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)摘要：为评估猪多杀性巴氏杆菌(Pm)毒力蛋白Dot诱导小鼠产生的免疫保护效果，本研究根据GenBank登录的A型Pm CS株基因序列设计特异性引物，以CS株基因组DNA为模板经PCR扩增基因片段，PCR产物测序后利用生物信息学软件进行序列分析。结果显示，基因长729 bp，编码含242 aa的膜蛋白；该蛋白的N端有一个24 aa组成的信号肽，具有重复Sel 1结构功能域，属于四肽重复超家族；抗原表位分析显示，Pm Dot蛋白含有6个抗原表位；序列同源性分析显示，不同血清型Pm Dot蛋白氨基酸序列的同源性达99%以上。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒pET-dot，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达重组蛋白，采用His纯化柱纯化后，经SDS-PAGE检测并采用western blot鉴定。结果显示，重组Dot蛋白(rDot)正确表达，且纯化效果较好，具有较强的反应原性。取40只4周龄BALB/c小鼠随机均分为5组进行免疫保护实验，3个实验组分别于0、2周、4周对小鼠通过背部皮下多点注射弗氏不完全佐剂(IFA)+10 滋g rDot(低剂量组)、IFA+30 滋g rDot(中剂量组)、IFA+50 滋g rDot(高剂量组)。两个对照组分别注射等量生理盐水和IFA。共免疫3次，每次间隔2周，小鼠于免疫前和攻毒前，均经尾静脉采血并分离血清，采用ELISA检测血清中IgG抗体水平。第3次免疫后2周，通过腹腔注射10伊LD50的A型Pm CS株攻击小鼠，观察攻毒后小鼠的临床症状及死亡情况。结果显示，生理盐水和IFA组小鼠抗体水平无显著差异；实验组小鼠二免后2周和三免后2周IgG抗体水平均极显著高于两个对照组(0.01)。攻毒后3 d，对照组小鼠全部死亡，低剂量、中剂量、高剂量组小鼠存活率分别为12.5%(1/8)、50%(4/8)、62.5%(5/8)。攻毒后5 d存活小鼠逐渐恢复并正常采食。本研究表明，rDot具有很好的免疫原性，可诱导小鼠产生部分免疫保护力。该研究为Pm Dot亚单位疫苗的研究积累了基础资料。关键词：多杀性巴氏杆菌；基因；重组Dot蛋白；免疫保护效果；小鼠中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1165-07Immune protective efficacy of recombinant Dot protein ofin miceWANG Yu-feng1覮,SU Jing-ming1覮,SHAO Meng-meng1,LIU Xin1,HUANG Fu-shen1,2*(1.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Engineering Reasearch Center of Veterinary Drug,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)Abstract:To evaluate its immune protective efficacy of the virulent Dot protein of(Pm)in mice,a pairof specific primers were designed based on thegene sequence of Pm CS strain in GenBank,thegene fragment was收稿日期：2023-04-17基金项目：湖南省自然科学基金(2017JJ2116)覮 共同第一作者：王宇凤(1998-)，女，湖南邵东人，硕士研究生，主要从事病原生物学研究；苏静明(1997-)，男，湖南常德人，硕士研究生，主要从事病原生物学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding author;覮Equal contributorsamplified by PCR from genomic DNA of Pm serotype A CS strain.Sequencing and bioinformatics analysis of the products showedthat thegene consisted of 729bp and encoded a membrane protein containing 242 amino acids.The N-terminus of this proteinhad a signal peptide composed of 24 amino acids,with a repeat sel 1 domain,belonging to the tetrapeptide repeat superfamily.Epitope analysis showed that the protein had 6 antigenic epitopes.Sequence homology analysis showed that it shared more than99%homology with other Dot proteins from different serotypes Pm.Thegene without signal peptide sequence regions wassubcloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+)to construct the recombinant expression plasmid pET-dot,which wastransformed intoBL21(DE3).The recombinant Dot protein(rDot)induced by IPTG was purified by his-taaged purificationcolumn,and detected and identified by SDS-PAGE and western blot.The results showed that the rDot was expressed correctly,purified effectively,and had a good reactogenicity.Forty BALB/c mice of four-week-age were randomly divided into 5 groups forimmune protection experiment,the mice in three experimental groups were subcutaneously injected with Freunds incompleteadjuvants(IFA)+10滋g rDot(low-dose group),IFA+30滋g rDot(medium-dose group),and IFA+50滋g rDot(high-dose group)at 0,2 and 4 weeks,respectively.The mice in two control groups were injected with equal amounts of IFA and normal saline,respectively.Before each immunization and infection,blood was sampled from the tail vein and sera were separated,and the IgGlevels in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Two weeks after the third immunization,the micewere intraperitoneally challenged with Pm serotype A CS strain at a dose of 10伊LD50,and the clinical symptoms and death of themice after challenge were recorded.The results showed that there was no significant difference in IgG levels between the salinegroup and the IFA group,and the IgG levels of mice in the experimental group were significantly higher than those of in thecontrol groups 2 weeks after the second and the third immunization(0.01).Three days after challenge,no mice survived in thetwo control groups,and the survival rates of the low-,middle-,and high-dose groups were 12.5%(1/8),50%(4/8),and 62.5%(5/8),respectively.Subsequently,the surviving mice gradually recovered and began to feed normally.From above,the generatedrDot protein had good immunogenicity and could induce partial immune protection against Pm infection in mice,providingaccumulated data for exploring new Pm vaccines.Key words:(Pm);gene;recombinant Dot protein;immune protective efficacy;mice多杀性巴氏杆菌(，Pm)感染畜禽可导致禽霍乱、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎等巴氏杆菌病，该病对畜牧业以及人类的健康有较大的影响1-2。根据荚膜的不同，Pm可以分为A、B、D、E和F共5个血清型，目前我国畜禽流行的菌株以A型和D型为主，F型报道较少3-4。目前，巴氏杆菌病以抗生素防治为主，但Pm易产生耐药性5。现在临床上用于防控Pm感染的疫苗主要为灭活苗。由于灭活苗的免疫谱窄，只对同型菌株的强毒攻击产生保护，且保护期较短，而Pm的血清型较多，所以筛选新的具广谱保护效果的疫苗非常必要6-7。近年来，有关Pm的脂多糖、皮肤坏死毒素等毒素的致病和免疫机制以及生物特性研究已有许多报道8-11，为Pm新型疫苗尤其是亚单位疫苗的研究积累了基础资料。Pm重组蛋白疫苗的研究，多以毒力因子、甚至非毒力的外膜蛋白(Outer membrane pro-teins，Omp)等为候选分子12-13。研究表明，Omp对革兰氏阴性菌外膜结构的维持、细胞内外物质的运输等方面均有重要作用。有些Omp还和病原菌的致病作用如细菌侵入宿主时的黏附作用密切相关14。由于Omp位于细菌表面，易与抗体反应，进而产生抗感染的免疫保护效果15。高度保守的Omp还可诱导机体对病原体感染产生交叉保护16。研究表明，Pm 的 Omp 如 铁 调 节 外 膜 蛋 白(Iron-regulated outermembraneproteins，IROMP)、PlpE(Pasteurellalipoprotein E)等均可诱导宿主产生免疫保护力16-18。对于Pm的体外重组蛋白，研究发现Pm 重组OmpH(rOmpH)、rIbeB、rMetQ和抗菌肽ABC转运体ATP结合蛋白均可诱导机体产生很好的体液免疫应答和免疫保护力16,19-21。Dot作为一种膜蛋白存在于多种病原菌中，本实验前期对Pm基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析，发现该基因可编码一种位于细菌细胞表面具四肽重复结构域的蛋白，该蛋白有多个抗原表位。已有研究发现，致病性大肠杆菌的Dot蛋白为毒力蛋白，免疫动物可诱导其产生部分抗感染的免疫中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1166保护作用22。对鲍曼不动杆菌的研究也表明，Dot蛋白可诱导机体产生部分免疫保护作用23，因此推测Pm Dot蛋白可能会诱导机体产生较好的免疫应答。有关Pm Dot蛋白包括其相应的重组蛋白诱导的免疫保护效果未见文献报道。为此，本研究克隆了Pm基因并进行原核表达，同时评估了Pm重组Dot蛋白(rDot)对小鼠的免疫保护效果，为进一步探究Pm的亚单位疫苗积累基础资料。1材料与方法1.1主要实验材料A型Pm CS株、大肠杆菌()BL21(DE3)感受态细胞、pET-28a(+)质粒和Pm感染小鼠血清，均由本实验室保存。40只4周龄雌性SPF级BALB/c小鼠(体质量约20 g)购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)购自环凯微生物科技有限公司；无支原体新生牛犊血清和T4 DNA连接酶购自北京赛默飞世尔科技公司；质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶I和R I购自北京百奥莱博科技有限公司；蛋白Marker购自北京全式金生物技术有限公司；卡那霉素购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；TMB底物液购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)购自艾美捷科技有限公司；小牛血清白蛋白(BSA)购自北京酷莱博科技有限公司；ELISA终止液购自北京金诺百泰生物技术有限公司；异丙基-茁-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自宁波鸥曼生物工程有限公司；吐温-20购自北京索莱宝科技有限公司。1.2Pm基因的PCR扩增、测序及序列分析根据GenBank中基因序列(SUB11119617)，利用Primer 5.0设计不包含信号肽编码区序列的引物：F：CGCCATATGATGTCTCCTGAGCTGTCAGCTG/R：CCGGAATTCGCTCACACCAGACAGTGAG，由 北 京擎科生物科技有限公司合成。按试剂盒说明书提取A型Pm CS株的基因组DNA，以其为模板，采用上述引物经PCR扩增基因片段，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。根据基因测序结果，利用ORF finder软件(http:/www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)分 析其开放阅读框和相应的编码氨基酸序列，利用TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析Pm Dot蛋白的跨膜区，利用ProtScale分析Dot蛋白的 亲 疏 水 性，利 用 Signalp-5.0(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析Dot蛋白的信号肽及跨膜区域，利用在线网站Swiss-modle分析Dot蛋白质的二级及三级结构，利用Pfam在线网站(http:/pfam.xfam.org/)分析Dot蛋白质的功能，利用IEDB(http:/www.iedb.org/)分析Dot蛋白质的B细胞抗原表位，采用在线软件BLAST(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因编码氨基酸序列的同源性。1.3重组质粒的构建及鉴定根据1.2的测序和分析结果，设计扩增不含信号肽的基因序列的引物，F：ATGCGTGGTCAAGGTGTTCCAC(斜体部分为I酶切位点)/R：CTCACACCAGACAGTGAG(斜体部分为R I的酶切位点)，由北京擎科生物科技有限公司合成，使外源基因在包涵体表达。将PCR扩增的基因片段克隆至pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-dot，经I和R I双酶切及测序鉴定。1.4重组蛋白的表达、纯化及鉴定将pET-dot转化大肠 杆菌BL21(DE3)感受 态细胞，于 37 以220r/min培养至OD600nm为0.3时，加入终浓度为11mmol/L的IPTG，继续培养6 h。4、6 000 r/min离心收集细菌，用pH7.4的PBS洗2次。按3 mL/g沉淀加入缓冲液A(Buffer A溶液)15，振荡混匀后置于4 冰浴超声破碎，4、1 2000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀用PBS缓冲液洗3次。在沉淀中加入适量的8mol/L尿素溶解过夜后，4、12000r/min离心10min，收集上清，利用His纯化柱纯化。表达及纯化的重组蛋白经SDS-PAGE检测后，利用BCA定量试剂盒测定纯化的重组蛋白浓度。1.5重组蛋白反应原性的western blot鉴定将重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上。PBS洗涤后，利用含3%BSA的PBS缓冲液37 封闭1 h。PBS洗涤，以Pm感染的小鼠血清(1颐100)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1颐10 000)为二抗，参照文献13，经western blot检测重组蛋白的反应原性。1.6各组小鼠血清抗体水平的ELISA检测及免疫保护实验将40只4周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成5组(包括注射高、中、低剂量重组蛋白的3个实验王宇凤，等.多杀性巴氏杆菌重组Dot蛋白对小鼠免疫保护效果研究第 11 期1167SP(Sec/SPI)CSOTHERM K KT I L F I L S V F L S G V V H A Q S A P V S P E L S A V L P Q T A P T AT G A E Q H I S A L N A S E L S D E A R R E L I R E A A D K KS S S S S S S S S S S S S S S S S S C X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X组，生理盐水对照组和佐剂对照组)，每组8只。实验组分别于0、2、4周通过背部皮下多点注射对小鼠免疫：弗氏不完全佐剂(IFA)+10 滋g rDot(低剂量组)、IFA+30 滋g rDot(中剂量组)、IFA+50 滋g rDot(高剂量组)，对照组分别注射等量生理盐水和IFA。首免前和首免后2周(二免前)、4周(二免后2周，三免前)、6周(三免后2周，攻毒前)经尾静脉采血，分离血清用于ELISA试验。rDot的包被量为10 滋g/孔，以小鼠血清(1颐2 000)为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1颐5 000)为二抗，反应底物为TMB，测定OD450nm值以检测各组小鼠血清抗体水平。首免后6周攻毒，每只小鼠通过腹腔注射10伊LD50的A型Pm CS株感染小鼠，观察攻毒后小鼠的临床症状及死亡情况，并计算各组小鼠的存活率。1.7数据的统计与分析所有数据均采用SPSS软件的单因素方差进行统计学分析，以“平均值依标准差(依)”表示，0.05表示差异显著，0.01表示差异极显著。2结果2.1Pm基因的PCR扩增及测序以A型Pm CS株基因组DNA为模板，利用相应引物经PCR扩增基因片段，产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测，结果显示，在约730 bp出现目的条带(图1)，符合预期结果。测序结果显示，该片段含有一个729 bp的编码区，可编码242个氨基酸。将该序列上传Gen-Bank，获得GenBank登录号为WP_240266333.1。2.2Pm Dot蛋白的生物信息学分析通过在线软件对Pm Dot蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析，结果显示，Dot蛋白理论分子量为27 032 ku，等电点(pI)为7.86；N端有一24个氨基酸的信号肽(图2A)，跨膜区分析显示其为膜蛋白(图2B)；二级结构分析显示，该蛋白包括4种二级结构成分，其种类和比例分别为琢-螺旋(66.53%)、茁片层(7.85%)、茁转角(7.85%)、无规卷曲(17.77%)；Dot蛋白的三级结构为一含有多个琢-螺旋形成的桶状结构。结构域表位分析显示，该蛋白含4个重复Sel 1结构域和一个MA3结构域，属于四肽重复超家族，这些结构域与细胞的周期调节、增强Pm粘附能力等功能有关(图2C)。抗原表位分析显示，Dot含6个B细胞抗原表位(表1)。序列同源性分析显示，不同血清型Dot蛋白的氨基酸序列的同源性达99%以上。上述结果表明，该蛋白为一重要且保守的功能蛋白，可能成为疫苗候选分子。M:DNA Marker;1:gene图1Pm基因的PCR扩增结果A：Pm Dot蛋白信号肽区；B：Pm Dot蛋白跨膜区；C：Pm Dot蛋白三级结构A:Signal peptide predication of Pm Dot protein;B:Transmembrane region predication of Pm Dot protein;C:Tertiary structure prediction of Pm Dot protein图2Pm Dot蛋白的生物信息学分析1000bp750bp500bpM1TransmembraneInsideOutsideTMHMM posterior probabilities for WEBSEQUENCEProtein sequenceSignalP-5.0 prediction(Eukarya):SequenceABC0.80.401.210.80.60.40.20200150100506040200中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1168表1Pm Dot蛋白抗原表位的分布和序列抗原表位位置Location of epitopeaa20-aa37aa63-aa74aa100-aa111aa137-aa149aa172-aa180aa205-aa218表位序列Sequence of epitopeQSAPVSPELSAVLPQTAPIREAADKKEWTRRGQGVPQDFEKAGHGVKQDIRHSITNELNQMTQANGEGTKKNKKQAVY表位长度Length of epitope18aa12aa12aa13aa9aa14aa王宇凤，等.多杀性巴氏杆菌重组Dot蛋白对小鼠免疫保护效果研究第 11 期1169M：DNA Marker；1：重组质粒双酶切产物M:DNA Marker;1:Products of recombinant plasmid by the doubleenzyme digestion图3重组质粒pET-dot的双酶切鉴定结果5000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bpM1M：蛋白标准分子质量；A：1：纯化后的重组蛋白；2：经IPTG诱导表达的pET-dot/BL21(DE3)重组菌；3：未经IPTG诱导的pET-dot/BL21(DE3)重组菌；4：经IPTG诱导的pET-28a(+)/BL21(DE3)对照菌；B：1：Pm感染小鼠血清；2：正常小鼠血清M:Protein standard Marker;A:1:Purified recombinant Dot protein;2:pET-dot/BL21(DE3)with IPTG induction;3:pET-dot/BL21(DE3)without IPTG induction;4:pET-28a(+)/BL21(DE3)as control;B:1:Sera of Pm infected mice;2:Sera of normal mice图4rDot的SDS-PAGE(A)及western blot(B)鉴定结果2.3重组质粒的构建及鉴定结果以A型Pm CS株基因组DNA为模板，利用相应引物经PCR扩增基因片段，并将其克隆至pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-dot，经双酶切鉴定。结果显示，在520 bp出现目的条带(图3)，与预期一致。测序结果显示插入序列片段正确，表明重组质粒正确构建。2.4rDot的表达、纯化及western blot鉴定结果将pET-dot转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得的重组菌pET-dot/BL21(DE3)培养至OD600nm达0.3时，经IPTG诱导后收集细菌，超声破碎，离心弃上清，沉淀加8 mol/L尿素溶解，利用His纯化柱纯化目的蛋白，经SDS-PAGE检测，结果显示，表达蛋白和纯化蛋白均在25 ku处出现与预期结果相符的目的条带(图4A)。以Pm感染小鼠血清(1颐100)为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1颐10 000)为二抗，western blot鉴定结果显示，表达的rDot能够与Pm感染的小鼠血清反应，并出现25 ku的特异性反应条带，阴性对照小鼠血清则无该条带(图4B)。上述结果表明，rDot获得了表达，经纯化后获得了高纯度的蛋白，且反应原性良好。经BCA法测定rDot浓度并调整至500 滋g/mL备用。2.5各组小鼠血清抗体水平的ELISA检测及免疫效果评估利用rDot免疫小鼠后攻毒，经ELISA检测小鼠血清中抗rDot的特异性抗体，结果显示，与对照组比较，首免后2周，各免疫小鼠血清中的IgG特异性抗体水平升高；二免后2周和三免后2周(攻毒前)，各实验组小鼠血清中特异性抗体水平均极显著高于两个对照组(0.01)(图5)。三免后2周经腹腔注射10伊LD50的A型Pm CS株攻击小鼠，观察攻毒后小鼠的临床症状及死亡情况。结果显示，攻毒后约3 h各组小鼠均开始出现临床症状，表现为扎堆，被毛粗乱，精神萎靡，眼睛微闭及呼吸急促等；攻毒后4 h，生理盐水组小鼠最先出现死亡，攻毒后6 h，佐剂组小鼠开始出现死亡；攻毒后12 h，低、中、高剂量组小鼠相继出现死亡；攻毒后3 d，对照组小鼠全部死亡，低、中、高剂量组小鼠的存活率分别为12.5%(1/8)、50%(4/8)、62.5%(5/8)。实验组中的存活小鼠攻毒后5 d精神状况逐渐恢复正常，并恢复正常采食。上述结果表明，rDot可诱导小鼠产生较高的抗体水平和部分抗Pm攻击的免疫保护效力。33ku25ku15ku10ku15ku25ku35kuM12B40kuM1234A1:Normal saline;2:IFA;3:IFA+10滋g rDot;4:IFA+30滋g rDot;5:IFA+50滋g rDot图5各组小鼠血清中IgG抗体水平的ELISA检测结果Before the second immunizationBefore the third immunizationBefore the first immunizationPost challenge*:0.01(vs control group)32.521.510.50543211234563讨论本研究发现，Pm Dot是一种具有多个抗原表位的膜蛋白，不同血清型Pm的Dot蛋白氨基酸序列同源性高达99%以上，rDot与小鼠感染血清有很好的反应原性。有关Pm的膜蛋白诱导的免疫保护效果已有很多报道15-17。如，外膜蛋白FhaB、PlpE、OmpH和 铁 调 节 外 膜 蛋 白(IROMP)24-26。有 报 道 显 示，IROMP中有3种蛋白免疫后可以在Pm攻击时诱导机体产生免疫反应及保护效果27。此外，伍小松等发现Pm重组外膜蛋白rIbeB、rMetQ和抗菌肽ABC转运体ATP结合蛋白免疫小鼠，也能诱导较好的抗Pm攻击的免疫保护力19-21。Bajzert等发现牛免疫rOMP40后可产生针对巴氏杆菌的免疫保护力28。Pegu等发现用氢氧化铝包裹的外膜蛋白制成的纳米颗粒疫苗免疫小鼠，可对相同血清型病原攻击产生对100%的保护作用17。Wu等发现在疫苗中加入含有溶血素(rSly)或寡脱氧核苷酸(CpG)的佐剂，能够增强仔猪体液和细胞免疫应答以及对Pm的免疫保护效力18。Urosev等发现该蛋白可诱导脓毒症小鼠模型产生33%免疫的保护效力22。鲍曼不动杆菌的研究显示，该蛋白可诱导机体产生部分免疫保护作用23。本研究表明，小鼠第3次免疫后rDot+IFA组小鼠血清IgG抗体水平显著升高，具有很好的免疫原性；rDot可诱导小鼠产生部分抗Pm攻击的免疫保护力。本研究分析结果显示，Pm Dot具有重复的Sel 1结构功能域，属于四肽重复超家族。有报道显示，含重复Sel 1结构功能域的蛋白质参与细菌的黏附与定植、调节宿主的免疫活动等多种功能。研究发现含重复Sel 1结构功能域的蛋白能够介导大肠杆菌与宿主的相互作用，参与大肠杆菌在人体肠上皮细胞的黏附、定植及致病过程。大肠杆菌的重复Sel 1结构功能域蛋白与宿主细胞表面蛋白相互作用后，通过内质网蛋白降解途径(Endoplasmic reticulum associ-ateddegradation，ERAD)，影响宿主细胞的蛋白降解29。Voth等的研究显示，嗜肺军团菌LpnE蛋白的重复Sel 1结构功能域，可介导LpnE对该菌侵入宿主细胞，并促进细菌进入巨噬细胞与II型肺泡细胞；此外，LpnE还能影响宿主细胞，包括信号的传导、细胞的黏附以及囊泡运输等的多个生物学过程30。流感嗜血杆菌MsfA1-4是含Sel 1样重复序列(SLRs)的SlrVA亚家族成员，研究发现，MsfA1-4与流感嗜血杆菌的致病性密切相关，该蛋白参与宿主巨噬细胞对流感嗜血杆菌的吞噬、及其在巨噬细胞中的存活和定植，同时还参与将流感嗜血杆菌运输到宿主细胞非粘膜部位的生物学过程31。因此推测rDot诱导的免疫保护效果，除由于位于细菌细胞表面的Dot蛋白与抗体结合影响细菌活力外，可能还与抗体与细菌Dot结合后引起的细菌毒力降低有关。本研究结果表明，A型Pm CS株Dot蛋白氨基酸序列与其他血清型Pm Dot氨基酸同源性很高，该蛋白具多个B细胞抗原表位，可诱导小鼠产生部分免疫效力。本研究为Pm亚单位疫苗的研究积累了基础资料。参考文献：YANG WEN-HAO,LI MING-TAO,ZHANG CHENG-CHENG,et al.Pathogenicity,colonization,and innate immune responsetoin rabbits J.BMC Vet Res,2022,18(1):416.PENG ZHONG,LIN LIN,WANG XIANG-RU,et al.The pub-lic health concern ofshould not be ignoredJ.Lancet Microbe,2022,3(8):e560.王林柏，孙久鹤，郭东春，等.国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究J.中国预防兽医学报，2016，38(2)：116-119.方超，李润成，魏榕，等.猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测与致病性研究J.中国预防兽医学报，2017，39(3)：210-214.白彤，屈红安，穆秦，等.多杀性巴氏杆菌外膜蛋白免疫作用研究进展J.中兽医医药杂志，2013，32(6)：30-33.LIN HAO-YI,LIU ZHI-HUI,ZHOU YING-CHUN,et al.Char-中 国 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