DB64∕T 1865-2023 贺兰山东麓酿酒葡萄霜霉病监测预警技术规程.pdf

ICS 35.240.68 CCS B 05 64 宁夏回族自治区地方标准 DB64/T 18652023 贺兰山东麓酿酒葡萄霜霉病监测预警技术规程 Rules for the investigation and forecast of wine grape downy mildew in the eastern foothills of Helan Mountains,Ningxia 2023-02-21 发布 2023-05-21 实施 宁夏回族自治区市场监督管理厅 发 布 DB64/T 18652023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由贺兰山东麓葡萄产业园区管委会提出、归口并组织实施。本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院植物保护研究所、宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏农垦玉泉营苗木繁育有限公司、宁夏西鸽酒庄、宁夏志辉源石酒庄、宁夏立兰酒庄、宁夏新牛酒庄、宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业园区管委会。本文件主要起草人：顾沛雯、张怡、张继丰、张瑶、吕毅、冯延涛、袁园、陈丽琼、毛雪、邵青松、张厚宝、白明、李治锋、何金柱、苏文平、叶晓宏、拓维庶、康宏。DB64/T 18652023 2 贺兰山东麓酿酒葡萄霜霉病监测预警技术规程 1 范围 本文件规定了酿酒葡萄霜霉病监测预警技术的术语和定义、病害调查方法、监测预警资料的收集、统计和汇报等。本文件适用于宁夏贺兰山东麓地区酿酒葡萄霜霉病病情调查和测报。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8321 农药合理使用准则 NY/T 1276 农药安全使用规范总则 DB64/T 1024 葡萄霜霉病防治技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 病害监测预警（Disease monitoring and early warning）根据植物病害流行规律，推测未来一段时间内病害分布扩散和为害趋势的综合性科学技术。3.2 幼果园（Young orchard）贺兰山东麓产区，树龄在7年以下的葡萄园。3.3 盛果园（Orchard with a high yield）贺兰山东麓产区，树龄在 7 年15 年之间的葡萄园。3.4 老果园（Old orchard）贺兰山东麓产区，树龄在15年以上的葡萄园。3.5 油斑期（Oil spot stage）多见于葡萄霜霉病的初次侵染时期，葡萄下部叶片零星出现圆形或不规则形水渍状黄色退绿斑，叶片背面尚未见霉层出现的时期。3.6 病害严重度（disease severity）表示植株或器官的罹病面积，即病斑面积占总面积的比率。DB64/T 18652023 3 3.7 病害发展曲线下面积(Area under the disease progression curve，AUDPC)是霜霉病流行期，每天感染百分比累加所得的值，AUDPC 值越高表明品种的感病性越强，反之则表明品种的抗病性越强。其计算公式，按式（1）计算：AUDPC=(Xi+1+Xi)/2(Ti+1Ti)（1）式中：AUDPC病害发展曲线下面积，这一参数能够有效描述病情发展累积情况；n总调查次数；Xi第i次调查的严重度；Ti为第i次调查的天数。3.8 最佳防治时期预警（Early warning during the best control period）根据气候因子、菌量等预测病原菌集中侵染的时期，以确定喷施杀菌剂适宜时机，这种预警称为最佳防治时期预警。3.9 分子病情指数（moleculardetected disease index，MDI）分子病情指数（MDI）的概念，即病原菌DNA浓度（pg）与寄主植物DNA浓度（ng）的比值，用于衡量病害潜伏期菌量。3.10 病情指数（disease index，DI）病情指数（DI）是全面考虑发病率与严重度的综合指标。计算公式有两种：当严重度用分级代表值表示时，病情指数=100(各级病叶数 各级代表值)/(调查总叶数 最高级代表值)；当严重度用百分率表示时，病情指数=普遍率 严重度 100 4 病害调查方法 4.1 孢子捕捉 使用孢子捕捉仪进行孢子捕捉。选择地块相对平整，树龄78年，架型不限，且易发病或种植感病葡萄品种的果园1块，安装孢子捕捉仪。监测果园地块面积要求大于20亩以上，根据葡萄地行数平均，自西向东，沿对角线方向，分别安装3台仪器。每台仪器放置时，距葡萄叶幕0.2m，吸风口距地面高度0.5 m。每年春季日均温超过15时开始捕捉，至霜霉病停止发病时结束，一般在6月中旬至9月下旬。每3d调换涂有白凡士林的玻片，在18mm 18mm盖玻片范围内，用10 40倍镜头镜检观察孢子数，每玻片查35个视野，计算每视野平均孢子数，将结果记录附录表A.1，同时记录天气情况。4.2 定点系统调查 葡萄展叶后，即开始定园，定点、定期调查，直至秋季葡萄落叶结束。一般从4月下旬至10月下旬，每7d10d调查1次。若遇到降雨频繁、果园枝叶郁闭或地势低洼等条件时，可适当增加调查天数，每3d5d调查1次。选择上年或常年发病重的果园，且面积在10亩以上的幼果园、盛果园、老果园各1块，每块园按5点取样各固定5个新梢，每梢自上而下调查10张叶片。若气候条件适宜，未见中心病株，应扩大调查面积。细查其严重度级别（附录表A.2），将结果记入附录表A.3，计算病情指数和AUDPC。4.3 大田普查 DB64/T 18652023 4 分别在葡萄开花前、落花后20d、果实膨大至着色初期、果实收获后和葡萄落叶前普查5次。每次根据当地葡萄品种、栽培年限等，分类普查10块15块面积大于10亩以上的葡萄园，每块园按5点取样调查25个新梢，每梢自上而下调查10张叶片，分别记载严重度级数（附录表A.2），将结果记入附录表A.4，计算病情指数。5 监测预警数据收集 5.1 葡萄园微气象数据收集 葡萄出土后，利用田间设置的自动气象测量仪，以小时为间隔，测量气温、降水和湿度等气象资料，数据传输到数据中心，进行数据处理和分析。5.2 葡萄栽培数据收集 收集葡萄种植品种、树龄、栽培面积和生育期等数据（附录表B.1）。5.3 葡萄霜霉病发生防治基本情况 记载葡萄霜霉病发生面积、发生程度、防治面积和防治措施等（附录表B.2），总结发生特点，并进行原因分析。6 监测预警资料统计和预警汇报 6.1 油斑期预警 在葡萄全部长出叶片后，春季平均气温上升为2325，田间相对湿度大于等于90%，持续小时数在8h10h以上，则10h15d后葡萄园中、下部叶片将出现病斑，若病斑背面尚未出现霉层，则确定为油斑期预警，进而确定最佳防治时期。6.2 孢子释放期 根据田间孢子捕捉结果，孢子捕捉量出现突增日起到高峰后的突减日止，为一个孢子散发高峰期，高峰期内捕捉量最多的日期为高峰日。一个葡萄生长季节中有多个孢子释放高峰。若气候条件适宜，孢子释放高峰期后7d10d田间出现病株。6.3 流行程度预警 葡萄霜霉病发生程度以全年最高病情指数和最高病叶率（3块5块系统田平均）为指标划分成5级，分级标准见附录表C.1。将前期调查的中心病株调查、大田普查数据和AUDPC图，结合品种抗性、气候条件等相关因子，将葡萄霜霉病流行程度划分为5个级别，分别为大发生、中等偏重发生、中等发生、中等偏轻发生和轻发生，确定葡萄生长季每月和全年病害发生严重程度（见附录表C.2C.5）。6.4 最佳防治时期预警 6.4.1 田间微气候数据确定最佳防治时期：依据贺兰山东麓地区自然气候条件，酿酒葡萄霜霉病病原菌完成孢子成熟孢子萌发新孢子侵染的过程，需要 10d15d。在此过程中，如果没有采取防治措施，则有可能看到侵染叶片上的病斑或其上的白色霉层。最佳防治时期预警为田间平均温度 2325、DB64/T 18652023 5 平均湿度大于等于 60%以上和叶面湿润时间为 8h10h（湿度大于等于 90%，持续小时数）。最佳施药时间为预警后 10d15d 的时间，以后再根据杀菌剂持效期、降雨、品种抗性和新的侵染循环确定下一次喷药时间。防治按 DB64/T 1024、GB/T 8321 和 NY/T 1276 执行。6.4.2 测定潜伏期病菌分子病指确定最佳防治时期：依据对田间样品的 MDI 值和田间病情 DI 的相关性分析，MDI 均与采样 15d 后的 DI 拟合性最高（见附录 C.3）。MDI 大于 0.0035 时，12d15d 后葡萄霜霉病在果园零星发生，作为当地酿酒葡萄霜霉病防治预警指标。防治按 DB64/T 1024、GB/T 8321 和NY/T 1276 执行。DB64/T 18652023 6 A A 附录A （规范性）葡萄霜霉病病害调查资料 A.1 葡萄霜霉病空中孢子数量调查记载 葡萄霜霉病空中孢子数量调查见表A.1。表A.1 葡萄霜霉病空中孢子数量记载表 调查日期 捕捉孢子数（个/视野）天气状况 备注 视野 1 视野 2 视野 3 平均 累计 A.2 葡萄霜霉病田间调查严重度分级标准 葡萄霜霉病田间调查严重度分级标准见表A.2。表A.2 葡萄霜霉病田间调查严重度分级标准 级别 描述 0 无病斑 1 病斑面积占整个叶面积的 10%以下 2 病斑面积占整个叶面积的 11%25%3 病斑面积占整个叶面积的 26%40%4 病斑面积占整个叶面积的 41%65%5 病斑面积占整个叶面积的 65%以上 A.3 葡萄霜霉病系统调查记载 葡萄霜霉病系统调查记载表见表A.3。表A.3 葡萄霜霉病系统调查记载表 调查 日期 果园类型 油斑期 各级病叶数/片 病叶率/%病情指数 AUDPC 备注 0级 1级 2级 3级 4级 5级 幼果园 盛果园 老果园 平均 DB64/T 18652023 7 A.4 葡萄霜霉病普查记载 葡萄霜霉病普查记载表见表A.4。表A.4 葡萄霜霉病普查记载表 调查日期 地点 调查面积/品种 各级病叶数/片 病情指数 病叶率/%备注 0级 1级 2级 3级 4级 5级 DB64/T 18652023 8 B B 附录B （规范性）葡萄霜霉病监测预警数据收集 B.1 葡萄栽培数据收集 不同酒庄葡萄园葡萄栽培数据收集见表B.1。表B.1 酿酒葡萄栽培相关数据 酒庄 位置 种植品种 栽培模式 树龄 栽培面积 生育期 灌溉方式 备注 B.2 葡萄霜霉病发生防治基本情况 记载葡萄霜霉病发生防治基本情况见表B.2。表B.2 酿酒葡萄栽培相关数据 酒庄 发生田块位置 发生特点 发生率/%发生程度 防治面积 防治措施 备注 DB64/T 18652023 9 C C 附录C （规范性）葡萄霜霉病监测预警汇报 C.1 葡萄霜霉病发生程度分级标准 葡萄霜霉病发生程度划分标准见表C.1。表C.1 葡萄霜霉病发生程度划分标准 发生级别（级）一 二 三 四 五 发生程度 轻发生 中等偏轻 中等发生 中等偏重 大发生 最高病情指数 1.0 1.117 17.134 34.150 50 最高病叶率/%5 5.130 30.155 55.180 80 注：最高病情指数是指在病害不同发生等级中数值最大的值。C.2 葡萄霜霉病孢子释放期和流行程度预警 葡萄霜霉病孢子释放期和流行程度预警模式汇报见表C.2C.5。表C.2 6 月份葡萄霜霉病模式电报组建表 上报时间：7月5日前 序号 查报内容 查报结果 1 截止 6 月 30 日孢子释放高峰数（次）2 截止 6 月 30 日累计孢子释放量（个/视野）3 累计孢子释放量比历年同期平均值增减比率（%）4 田间霜霉病始见期（月/日）5 霜霉病始见期比历年平均值早晚（天）6 6 月 28 日平均病叶率（%）7 6 月 28 日平均病叶率比历年同期平均值增减比率（%）8 6 月 28 日平均病指 9 6 月 28 日平均病指比历年同期平均值增减比率（%）10 7 月份降雨量预报值（mm）11 7 月份降雨量预报值比历年同期平均值增减（mm）12 预计 7 月份霜霉病侵染盛期（月/日）13 预计 7 月份霜霉病发生程度（级）14 传真单位 DB64/T 18652023 10 表C.3 7 月份葡萄霜霉病模式电报组建表 上报时间：8月5日前 序号 查报内容 查报结果 1 7 月份孢子释放高峰数（次）2 7 月份累计孢子释放量（个/视野）3 累计孢子释放量比历年同期平均值增减比率（%）4 7 月 28 日平均病叶率（%）5 7 月 28 日平均病叶率比历年同期平均值增减比率（%）6 7 月 28 日平均病指 7 7 月 28 日平均病指比历年同期平均值增减比率（%）8 8 月份降雨量预报值（mm）9 8 月份降雨量预报值比历年同期平均值增减（mm）10 预计 8 月份霜霉病侵染盛期（月/日）11 预计 8 月份霜霉病发生程度（级）12 传真单位 表C.4 8 月份葡萄霜霉病模式电报组建表 上报时间：9月5日前 序号 查报内容 查报结果 1 8 月份孢子释放高峰数（次）2 8 月份累计孢子释放量（个/视野）3 累计孢子释放量比历年同期平均值增减比率（%）4 8 月 28 日平均病叶率（%）5 8 月 28 日平均病叶率比历年同期平均值增减比率（%）6 8 月 28 日平均病指 7 8 月 28 日平均病指比历年同期平均值增减比率（%）8 8 月份霜霉病发生程度（级）9 9 月份降雨量预报值（mm）10 9 月份降雨量预报值比历年同期平均值增减（mm）11 预计秋季霜霉病侵染盛期（月/日）12 预计秋季霜霉病发生程度（级）13 传真单位 DB64/T 18652023 11 表C.5 全年葡萄霜霉病模式电报组建表 上报时间：10月30日 序号 查报内容 查报结果 1 全年孢子释放高峰数（次）2 全年孢子释放高峰数比历年平均值增减（次）3 全年累计孢子释放量（个/视野）4 累计孢子释放量比历年平均值增减比率（%）5 全年最高病叶率（%）6 最高病叶率比历年平均值增减比率（%）7 全年最高病指 8 全年最高病指比历年平均值增减比率（%）9 全年霜霉病平均施药防治次数（次）10 全年霜霉病发生程度（级）11 传真单位 C.3 测定潜伏期病菌分子病指（MDI）的方法 C.3.1 田间样品的采集 在叶片未显症前采样，采样时在每个样区内按Z字形5点采样的方法每点固定选择5株葡萄树，分上、中、下部任意采集3片叶，每个样区共计15片叶，混合后作为一个样区进行DNA提取。C.3.2 田间样品DNA的提取 利用E.Z.N.A.HP Plant DNA Kit说明提取每样区葡萄叶片总DNA，-20 保存备用。C.3.3 Realtime PCR定量检测叶片DNA和样品中病原菌DNA C.3.3.1 使用 Primer Premier 5.0，根据 GenBank 中葡萄 EF1-基因（登录号：XM002284888.3）设计葡萄引物 F-g-6/R-g-6 扩增酿酒葡萄叶片 DNA。根据葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计的引物 F-cox-Pv/R-Pv 扩增葡萄霜霉菌 DNA。使用荧光定量 PCR 仪，进行 real-time PCR 扩增，引物序列见表 C.6。表C.6 引物序列 引物 序列（5-3）Tm 值()长度(bp)F-g-6 CAGCACAATCTGCCTGTGAGGTAC 60.50 24 R-g-6 GTCGACTACCACTGGTCACTTGATC 59.28 25 F-cox-Pv TCGTGTATTGATTACTGCGTCAAA 53.86 24 R-Pv ACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT 52.43 25 C.3.3.2 Real-time PCR 反应体系（20 L）：2TransStart Tip Green SuperMix 10 L，正反引物DB64/T 18652023 12（10 molL-1）各 0.4L，DNA 模板 1L，ddH2O 补足。酿酒葡萄叶片和葡萄霜霉菌 real-time PCR 反应条件（三步法）均为：94预变性 30s；94变性 5s，59退火 15s，72延伸 30s，40 个循环。C.3.3.3 标准曲线的建立：根据已知浓度酿酒葡萄叶片和葡萄霜霉菌的 DNA 浓度以及 CT 值，分别计算得到酿酒葡萄叶片和葡萄霜霉菌的标准曲线，其中葡萄霜霉菌的线性方程为y1=18.01-3.60 x1（R2=0.99297），x1为葡萄霜霉菌 DNA 浓度的对数值（log10C），y1为葡萄霜霉菌的 CT 值；酿酒葡萄叶片的线性分析方程为y2=26.38-3.06x2（R2=0.99598），其中x2为酿酒葡萄叶片 DNA 浓度的对数值（log10C），y2为酿酒葡萄叶片的 CT 值。同时得到葡萄霜霉菌 DNA 浓度定量检测的最小检测限为 1.010-4ngL-1，而酿酒葡萄叶片最小检测限为 1.010-2ngL-1。注：MDI 的计算 将葡萄霜霉菌标准曲线由Ct值换算得到病原菌的量以pg为单位，将葡萄叶片标准曲线由Ct值换算得到寄主的量以ng为单位。分别计算每样区的MDI。MDI=葡萄霜霉菌 DNA 量（pg）/酿酒葡萄叶片 DNA 量（ng）(C.1)式中：MDI 为分子病指，代表葡萄叶片中潜伏期病菌的含量。