顶空-气相色谱法测定到手香提取物11种溶剂残留量.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3295DOI:10.19803/j.1672-8629.20230521 中图分类号：R917文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）03-0295-05基金项目：国家重点研发计划（2022YFC3501505）。作者简介：王丹丹，女，本科，药物分析。为并列第一作者。*通信作者：马双成，男，研究员 博导，中药民族药物质基础与质量安全评价研究。E-mail:#为共同通信作者。到手香（Coleus amboinicus Lour.）别名碰碰香、延命草、印度薄荷，为唇形科马鞘蕊花属多年生草本植物1。因用手碰触后留有浓烈的辛香味而得名。原产于印度尼西亚，广泛分布与亚洲、非洲和南美洲，在民间即可作为香料，亦可作为药用植物用于杀菌、祛风和解毒等 2-3。到手香提取物为到手香干燥药材粉末用一定比例的醇溶剂萃取，再经二乙烯苯型大孔树脂层析，最后再用一定比例的醇溶液抽提、浓缩干燥获得4-5。到手香提取物有降糖、降血脂血压和顶空-气相色谱法测定到手香提取物 11 种溶剂残留量王丹丹，王莹，姚令文，刘芫汐，金红宇#，马双成*（中国食品药品检定研究院中药民族药检定所，北京 102600）摘要：目的建立顶空-气相色谱法测定中药到手香提取物中苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、氯苯、苯乙烯和二乙烯苯 11 种溶剂残留的分析方法。方法供试品经顶空进样器85平衡 45 min，分流比 101（VV），采用 DB-WAX 聚乙二醇为固定相的弹性石英毛细管柱（长 30 m，内径 0.32 mm，膜厚 0.5 m），FID 氢火焰离子化检测器进行分析。结果11 种挥发性有机物分离效果较好，在0.2223.86 gmL-1的浓度范围内线性关系良好（r 0.99）；方法定量限为 0.008 4 gmL-1 LOQ 0.543 2 gmL-1；低、中、高水平下各成分的平均回收率为84%103%之间；相对标准偏差10%（n=6），经方法学验证后该方法符合实验要求。3 批样品中甲苯、间二甲苯、邻二甲苯及二乙烯基苯有检出，低于定量限，均未超标。结论该方法易于操作，结果可靠，可用于中药到手香提取物中的残留溶剂检测，亦为其他中药提取物中残留溶剂分析提供方法参考，确保用药安全。关键词：到手香；提取物；挥发性化合物；溶剂残留；顶空-气相色谱法；大孔树脂；质量控制；药物警戒Determination of residual solvents in extract of Coleus amboinicus by headspace-gas chromatographyWANG Dandan,WANG Ying,YAO Lingwen,LIU Yuanxi,JIN Hongyu#,MA Shuangcheng*(Institute for Control of Chinese Traditional Medicine and Ethnic Medicine,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102600,China)Abstract:Objective To establish a headspace-gas chromatography method for the determination of residues of benzene,acrylonitrile,methyl methacrylate,toluene,1,2-dichloroethane,p-xylene,m-xylene,o-xylene,chlorobenzene,styrene and divinylbenzene in Coleus amboinicus extracts,which is a traditional Chinese medicine(TCM).Methods The samples were balanced by a headspace injector at 85 for 45 min,and the split ratio was 10:1(V:V).The DB-WAX capillary column(30 m long,0.32 mm wide,and 0.5 m thick),which was fixed using polyethylene glycol,was used to separate samples,while a flame ionization detector(FID)was used for analysis.Results The eleven volatile organic compounds were well-separated.Experimental results showed that the linearity of these volatile organic compounds ranged from 0.22 gmL-1 to 23.86 gmL-1 with correction coefficients above 0.99.The limit of quantification was between 0.008 4 gmL-1 and 0.543 2 gmL-1.The average recovery of the target compounds ranged from 84%to 103%at three spike levels,with relative standard deviations less than 10.0%(n=6),which met the requirements of trace determination.Toluene,m-xylene,o-xylene and divinylbenzene were detected in three batches of samples,but below the limit of quantitation and the standard.Conclusion This method is simple,reliable,and applicable to the detection of residual solvents in the extract of Coleus amboinicus,which can facilitate the analysis of residual solvents in other TCM extracts and medication safety.Keywords:Coleus amboinicus;extracts;volatile organic compounds;solvent residues;headspace-gas chromatograph;macroporous resin;quality control;pharmacovigilance抗菌等功效6-8。国外有文献报道到手香提取物可进行银纳米颗粒的胞外合成9。国内到手香提取物在市面上有生产流通，功效标注为广泛，在药品、保健食品、日用商品等都有应用。到手香提取物的生产工艺中药材一般需经大孔树脂分离纯化4。大孔树脂具有吸附量大、操作简便、可再生等特点，作为一款绿色、环保材料在中药提取物中被广泛应用10，然而在使用大孔树脂过程中未聚合的苯乙烯单体，致孔剂甲苯、二甲苯等挥发性有机化合物（volatile organic compounds,VOCs）可能会随着提取进入中药产品中，存在一定的安全隐患。国家药品监督管理局对生产过程中使用大孔树脂分离纯化中药提取液时对树脂残留做了相关技术要求，要求“苯（2 ppm）、甲苯（890 ppm）、二甲中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3296苯（2 170 ppm）、苯乙烯、烷烃类、二乙烯基苯类（二乙烯基）及树脂残留物总量检查”11。在 2020 年版 中华人民共和国药典（2020 年版）（简称“中国药典”）一部12中使用大孔树脂提取制备的中药品种有 11个（银杏叶提取物、人参总皂苷、人参茎叶皂苷、三七总皂苷，三七三醇皂苷、山楂叶提取物、龙胆总苷、灯盏花素、乌鸡白凤丸、复脉定胶囊、银丹心脑通软胶囊），其中三七总皂苷、三七三醇皂苷、灯盏花素、复脉定胶囊 4 个品种规定了树脂残留检测项，检测包括正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等树脂残留指标13。到手香提取物在制备过程亦涉及二乙烯苯型大孔树脂分离步骤，最终提取物中是否存在树脂残留，目前报道较少。中国药典四部通则“0861 残留溶剂测定法”规定了药品中常见的残留溶剂限度，但苯乙烯、二乙烯基苯等部分指标未见收录12。故本研究采用顶空-气相色谱法,围绕常见树脂残留物，建立了到手香提取物中 11 种大孔树脂有机残留物(苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、氯苯、苯乙烯和二乙烯苯）的测定方法，对其树脂残留情况进行分析，以期为到手香提取物标准制定提供依据，保障用药安全，同时建立的方法为其他品种中药提取物中树脂残留物的测定提供方法参考。1 材料与方法1.1 试药与仪器到手香提取物，来自3 家企业，阴凉干燥保存。甲醇（中国DIKMA公司，批号：R142433，纯度 99.9%）；二甲基亚砜（DMSO，北京百灵威科技有限公司，批号：950646，纯度 99.99%）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，中国 DIKMA 公司，批号：50114，纯度 99.8%）；苯（批号：2255195，纯度：99.9%）、丙烯腈（批号：2202935，纯度：99.8%）、甲基丙烯酸甲酯（批号：E2027019，纯度：99.5%）、1，2-二氯乙烷（批号：2203491，纯度：99.9%）、对二甲苯（批号：2203096，纯度：99.9%）、间二甲苯（批号：2203314，纯度：98.8%）、邻二甲苯（批号：2203306，纯度：99.3%）、氯苯（批号：2203095，纯度：99.6%）、苯乙烯（批号：2203024，纯度：99.9%）、二乙烯苯（批号：2355310，纯度：80.7%），均购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司；甲苯（坛墨质检科技股份有限公司，批号：C22050025，纯度：99.9%）；超纯水。气相色谱仪（安捷伦科技有限公司，型号：8890）、顶空进样器（安捷伦科技有限公司，型号：7697A）；电子天平（METTLER TOLEDO 中国，型号：XSE205DU）；超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）；超纯水仪（Millipore 公司，型号：Milli-Q Advantage A10）。1.2 实验与方法 1.2.1 对照品溶液的制备 单标储备液：取“1.1”项下所示对照试剂适量，精密称定，置于量瓶中，加甲醇分别配置成每1 mL含 6 mg 的单标储备液，即得。混合对照品溶液：取单标储备液适量，置于100 mL 量瓶中，加甲醇配置成每1 mL含苯 6 g，含丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1,2-二氯乙烷、二甲苯（邻、间、对二甲苯）、氯苯、苯乙烯及二乙烯苯为 60 g的混合对照品溶液，即得，记作 RS。1.2.2 标准曲线的配制 精密量取“1.2.1”项下RS 溶液适量，置于10 mL量瓶中，加稀释剂取纯水245 mL，加入二甲基亚砜（DMSO）250 mL，再加入 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）5 mL，摇匀后放冷至室温 配置成每1 mL含苯为 0.18、0.3、0.6、0.9、1.2、1.8 g、含丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1,2-二氯乙烷、二甲苯（邻、间、对二甲苯）、氯苯、苯乙烯及二乙烯苯依次为1.8、3、6、9、12、18 g 混合标准曲线溶液，分别记为 R1、R2、R3、R4、R5、R6。照气相色法（通则0521），以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。1.2.3 检测限与定量限 精密量取“1.2.1”项下的混合对照品溶液适量，逐级稀释，按“1.3”项下的试验条件进行测定，记录峰面积。以信噪比 31 时测得检测限（LOD）；以信噪比 101 时测得定量限（LOQ）。1.2.4 供试品溶液制备 取供试品约 200 mg，精密称定，置 20 mL 顶空瓶中，精密加入稀释剂 2 mL，压盖密封，超声15 min 即得。1.2.5 回收溶液配制 加标 30%（记作 AAC-L）：取供试品约 200 mg，精密称定，置 20 mL 顶空瓶中，精密吸取标曲 R1 溶液 2 mL，压盖密封，超声 15 min 后上样分析。加标 100%（记作 AAC-M）：取供试品约200 mg，精密称定，置 20 mL 顶空瓶中，精密吸取标曲R3 溶液2 mL，压盖密封，超声15 min后上样分析。加标150%（记作 AAC-H）：取供试品约 200 mg，精密称定，置 20 mL 顶空瓶中，精密吸取标曲 R4 溶液2 mL，压盖密封，超声15 min 后上样分析。上述 3 个水平溶液，各平行制备 3 份进行测定。1.2.6 重复性和耐用性实验 按“1.2.5”项下ACC-M溶液配制方法制得，重复进样 6 次。按“1.2.5”项下中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3297ACC-M 溶液配制方法制得，考察进样口温度（215、220、225），起始色谱柱温度（38、40、42）及色谱柱流速（1.15、1.20、1.25 mLmin-1）波动情况对实验结果的影响。1.3 色谱条件以聚乙二醇为固定相的弹性石英毛细管柱，色谱柱型号为 DB-WAX（30 m320 m0.5 m）。分流比 101，恒流模式下流速1.2 min-1，柱温为程序升温：起始温度 40（3 min），5 min-1升温至 70，15 min-1升温至180（5 min），20 min-1升温至 200（3 min），FID 检测器 250,加热器220。顶空加热箱温度 80，定量环温度 90，传输线温度100，顶空平衡时间 45 min，进样持续时间 0.06 min，GC 循环时间 33 min。2 结果2.1 检测限与定量限11 种常见的有机溶剂的检测限与定量限均符合中国药典四部“通则 9101”相关要求，采用信噪比法确定，整体结果呈现较好。检测限：0.002 5 gmL-1LOD 0.163 0 gmL-1，定量限：0.008 4 gmL-1LOQ0.543 2 gmL-1。2.2 线性关系结果表明在 0.2223.86 gmL-1 的浓度区间内均呈现出良好的线性，r 0.997（表 1）。2.3 回收率11 种溶剂残留的回收率在 84%103%，总体符合中国药典80%120%的回收率要求，符合方法学验证要求（表 2）。2.4 重复性采用 100%加标样品，重复进样 6 次。11 个目标化合物重复性 RSD 在 0.81%2.78%，符合中国药典 中重复性 RSD8%的要求（表 2）。2.5 耐用性采用100%加标样品，改变同一参数，重复进表1 到手香提取物中11个检测指标对照品溶液的线性关系Table 1 Linear relationships of 11 detection indexes in extracts of Coleus amboinicus化合物回归方程r线性范围/gmL-1LOD/gmL-1LOQ/gmL-1苯y=4.269 4x0.131 00.998 70.222.220.002 5 0.008 4 丙烯腈y=0.618 5x+0.226 40.997 51.9219.280.163 0 0.543 2 甲基丙烯酸甲酯y=1.011 6x+0.162 70.998 81.8218.210.113 4 0.378 2 甲苯y=3.959 3x 0.593 70.999 22.0520.540.026 6 0.088 6 1，2-二氯乙烷y=0.680 3x+0.008 40.998 52.2022.040.110 7 0.369 0 对二甲苯y=3.630 9x 0.307 40.999 42.0520.520.022 0 0.073 3 间二甲苯y=3.627 8x 0.240 20.999 32.1221.230.022 1 0.073 7 邻二甲苯y=2.933 5x+0.029 00.999 22.0820.870.024 5 0.081 7 氯苯y=2.036 5x+0.058 10.998 91.8918.960.018 7 0.062 2 苯乙烯y=1.959 8x+0.173 90.999 32.3823.860.031 3 0.104 3 二乙烯苯y=0.427 2x+0.107 20.999 41.7617.640.031 40.104 8表 2 到手香提取物中11个检测指标成分加样回收率和精密度实验结果（n=6）Table 2 Results of recovery and precision tests of 11 components in extracts of Coleus amboinicus(n=6)化合物加标量/gmL-1平均回收率/%RSD/%化合物加标量/gmL-1平均回收率/%RSD/%苯2.2293.672.78间二甲苯2.1293.001.737.417.0811.1110.62丙烯腈1.9388.331.41邻二甲苯2.0993.671.316.436.969.6410.44甲基丙烯酸甲酯1.8297.001.53氯苯1.9094.331.656.076.329.119.48甲苯2.0591.002.21苯乙烯2.3994.330.816.857.9510.2711.931，2-二氯乙烷2.2095.331.16二乙烯苯1.7692.001.787.355.8811.028.82对二甲苯2.0592.671.746.8410.26中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3298样2次，11个目标化合物峰面积 RSD 在1.71%7.36%（表 3）。符合中国药典中耐用性 RSD15%的要求，表明此方法耐用性较好。2.6 样品测定3 个企业的 3 批样品，照上述实验方法测定见图1所示，结果表明其中甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、二乙烯苯有检出，但检出量低于线性最低点，其余成分未检出（表 4）。对照品溶液色谱图（图 2）。3 讨论采用顶空低温平衡，抽取气液平衡后的气体进样分析，可以专一性的收集样品中的 VOCs，减少基体对待测成分的干扰。实验曾对比直接进样检测，待测成分响应低于顶空进样，且部分指标峰形较差。顶空法测定 VOCs常用溶剂主要有 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、水等。到手香提取物多为加水或乙醇经大孔树脂柱分离纯化获得的脂溶性混合物,以稀释剂（取纯水 245 mL，加入二甲基亚砜 250 mL，再加入 N,N-二甲基甲酰胺表 3 加标 100%到手香提取物方法耐用性实验Table 3 Results of durability test for the labeled 100%extracts of Coleus amboinicus化合物耐用性条件RSD/%化合物耐用性条件RSD/%苯起始柱温度4.45间二甲苯起始柱温度3.59进样口温度1.93进样口温度1.78流速2.88流速3.26丙烯腈起始柱温度4.32邻二甲苯起始柱温度3.74进样口温度3.89进样口温度2.21流速4.44流速3.58甲基丙烯酸甲酯起始柱温度5.96氯苯起始柱温度3.51进样口温度5.64进样口温度1.93流速6.37流速3.41甲苯起始柱温度3.91苯乙烯起始柱温度3.29进样口温度1.71进样口温度2.26流速2.89流速3.541，2-二 氯 乙烷起始柱温度3.08二乙烯苯起始柱温度7.36进样口温度2.35进样口温度6.48流速6.79流速7.21对二甲苯起始柱温度3.68进样口温度1.75流速3.16 5 mL，摇匀后放冷至室温）为溶剂，即减少有机溶剂的使用和溶剂峰对样品的干扰，亦可满足样品的快速溶解，便于检测14-16。实验考察了不同起始柱温、进样口温度及流速对树脂残留物测定的影响。结果表明，起始柱温，进样口温度及流速5%的波动范围内对检测结果影响较小，最终选择起始柱温 40，进样口温度220，流速1.20 mL min-1。大孔树脂作为一款使用便捷，低价环保的材料，近年被广泛应用在中药提取物、中成药的提取制备中17-18，但大孔树脂因制备工艺所残留的苯、甲苯等VOCs 会进入到制备样品中，存在一定的安全风险。本文建立了到手香提取物中 11 种 VOCs 残留物的检测方法，该方法灵敏、快捷、准确性好。验证表明该方法符合实验要求，为后续对中药材到手香提取物质量标准的完善提供方法依据，同时为其他中药品种中树脂残留物检测的质控监管提供参考。图1 到手香提取物色谱图Figure 1 Chromatogram of samples of extracts of Coleus amboinicust/min中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3299表 4 到手香提取物样品测定结果Table 4 Results of determination of extract samples in Coleus amboinicus 化合物编号企业 含量/%化合物编号企业 含量/%苯S1A-间二甲苯S1A*S2B-S2B*S3C-S3C*丙烯腈S1A-邻二甲苯S1A*S2B-S2B-S3C-S3C-甲基丙烯 酸甲酯S1A-氯苯S1A-S2B-S2B-S3C-S3C-甲苯S1A*苯乙烯S1A-S2B*S2B-S3C*S3C-1，2-二氯 乙烷S1A-二乙烯苯S1A*S2B-S2B-S3C-S3C-对二甲苯S1A-S2B-S3C-注：“-”表示未检出；“*”表示有检出，但低于线性范围（最低线性范围对应甲苯含量 0.000 2%，间二甲苯含量 0.000 2%，邻二甲苯含量 0.000 2%，二乙烯苯含量 0.000 18%）Note:“-”.Not detected not detected;“*”.Less than the linear range(the lowest linear range corresponds to toluene content 0.000 2%,m-xylene content 0.000 2%,o-xylene content 0.000 2%,divinylbenzene content 0.000 18%)参考文献1 WANG L,GUAN SY,ZHUO J.Study on antibacterial activity of water soluble extractive of Coleus amboinicus LourJ.Lishizhen 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