gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211046基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响王利丽，张春晓，张闫，孙欣艺，侯冠欣，陶勇，赵奇，张志强*，史秋梅*(河北科技师范学院 河北省预防兽医重点实验室，河北 秦皇岛066004)摘要：为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响，本研究利用姿-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株基因缺失株CE129驻(KO)和基因回补株CE129驻(RS)，并均经PCR及测序鉴定，结果显示，基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线，利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性；利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性；利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示，3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI)，分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力，并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示，WT与KO菌株的体外CI为0.32，表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示，相对于WT、RS菌株，KO菌株BF的形成能力极显著降低(0.001)，且KO菌株BF的主要组成成分curli菌毛有明显变化，表明基因参与APEC BF中curli菌毛的形成，而3株菌在含荧光增白剂琼脂板的荧光强度均一致，表明基因与APEC BF中纤维素的形成无关。采用细菌计数法统计WT、KO、RS菌株在6种应激条件下的生存率，结果显示，除氧化应激条件下3株菌的生存率无显著差异外，在酸、碱、热、铁饥饿应激环境中，与WT和RS菌株相比，KO菌株的生存率均极显著降低(0.001、0.0001)。在50 mg/L、100 mg/L NaNO2中，KO菌株的生存率显著降低(0.01)；在150 mg/L NaNO2中，KO菌株的生存率极显著降低(0.001)。采用菌落计数法测定WT和KO菌株抗不同浓度血清的杀菌作用，结果显示，在高浓度的血清中(50%100%)，WT、KO菌的数量显著高于DH5琢对照菌株(0.05)；但在不同浓度血清中KO菌的数量与WT菌的数量差异不显著。本研究结果首次证实基因参与APEC部分生物学特性的形成，为进一步阐释基因功能及该菌的致病机制奠定了基础。关键词：禽致病性大肠杆菌；基因缺失；生物学特性中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0690-08Effect ofgene deletion on biological characteristics of avianpathogenicWANGA Li-li,ZHANG Chun-xiao,ZHANG Yan,SUN Xin-yi,HOU Guan-xin,TAO Yong,ZHAO Qi,ZHANG Zhi-qiang*,SHI Qiu-mei*(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province,Hebei Normal University ofScience and Technology,Qinhuangdao 066004,China)收稿日期：2022-11-24基金项目：河北省重点研发计划项目(19226629D)；河北省高等学校科学技术研究项目(BJ2021055)作者简介：王利丽(1995-)，女，河北张家口人，硕士研究生，主要从事兽医传染病学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorAbstract:To investigate the impact of the gene encoding the glutamate transporter protein GltS on the biologicalcharacteristics of avian pathogenic(APEC),thegene was removed from APEC strain CE129(WT)toconstruct CE129驻(KO)using姿-Red homologous recombination method,and the pBR322-was constructed andtransformed into the deletion mutant resulting in the complementary strain CE129驻/(RS).The results of PCR identificationand sequencing showed that both strains were correctly constructed.The growth curves of WT,KO,and RS strains were plotted bycontinuously measuring the OD600nmvalues of each strain for 10 hours,the biochemical characteristics of the three strains weredetermined using the Merier automatic biochemical identification system,the sensitivity of the three strains to 16 drugs categoriedto 8 types was detected using K-B disk method,and the motility of three strains was detected by semi-solid medium.The resultsshowed that there were no significant differences in the growth curves,biochemical characteristics,drug sensitivity,and exercisecapacity of the three strains.Thecompetition of WT and KO strains was detected by bacterial plate counting method andthe competition index(CI)was calculated to analyze whether KO strains were weakened.The biofilm biofilm(BF)formationability of the three strains was determined using crystal violet staining,and the formation of curli pili and cellulose in BF wasdetected using Congo red plates and agar plates containing fluorescent whitening agent,respectively.The results showed that the CIof WT and KO strains was 0.32,indicating mild weakening of KO strains.The BF formation test results showed thatcompared to WT and RS strains,the BF formation ability of KO strain was significantly reduced(0.001).The main componentof BF in KO strain,curli pili,showed significant changes,indicating that thegene is involved in the formation of curli pili inBF of APEC.The fluorescence intensity of the three strains on agar plates containing fluorescent whitening agent was consistent,indicating that thegene is not related to the formation of cellulose in BF of APEC.The survival rates of WT,KO,and RSstrains under six stress conditions were calculated using bacterial counting method,and it showed that there was no significantdifference under oxidative stress among the three strains,and the survival rate of KO strain significantly reduced compared to WTand RS strains in acid,alkali,heat,and iron starvation stress environments(0.001,0.0001).The survival rate of KO strainsignificantly decreased in 50 mg/L and 100 mg/L NaNO2(0.01),and in 150 mg/L NaNO2(0.001).The resistance of WT andKO strains to bactericidal activity of serum at different concentrations was measured using colony counting method.The resultsshowed that the number of WT and KO strain in high concentration serum(50%-100%)was significantly higher than that of DH5琢control strain(0.05).However,there was no significant difference in the number of KO and WT strains in differentconcentrations of serum.This study confirmed for the first time that thegene is involved in some of the biologicalcharacteristics of APEC,laying a foundation for further elucidating the function of thegene and the pathogenic mechanism ofthis bacterium.Key words:avian pathogenic;-knockout;biological characteristics细菌的代谢能力与其致病力密切相关，多项研究表明，细菌的部分糖和氨基酸的吸收、分解代谢功能的缺失会引起其毒力的显著下降1。谷氨酸作为生命体重要的营养物质，不仅为细菌生长代谢必需的氨基酸，还可以作为细菌嘌呤与嘧啶合成的原料2。对大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌的研究发现，细菌通过钾离子调节渗透压所积累的正电荷，需要其氨基酸代谢产生的谷氨酸来抵消3。敲除伯克霍尔德菌的基因结果表明谷氨酸对渗透压调节起关键作用4。研究发现，谷氨酸代谢在细菌应对各种环境应激中发挥关键作用，尤其是酸性应激中5。禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic，APEC)基因是Na+-H+-谷氨酸共转运体操纵子的结构基因，编码谷氨酸转运蛋白GltS，为分子量35 000 ku的细菌外膜蛋白，疏水性较强6，APEC含多种谷氨酸转运蛋白，GltS蛋白即为其中之一，谷氨酸转运系统是谷氨酸进入该菌的主要途径。GltS蛋白只在与Na+偶联的情况下转运L-谷氨酸。敲除棒杆菌谷氨酸编码基因后，该菌对L-谷氨酸的吸收率明显降低7，上述研究表明基因可能调控细菌的多种功能。本研究通过构建APEC基因缺失株，分析其生长特性、生化特性、体外竞争能力、耐药性、运动能力、生物被膜(BF)形成能力、应激耐受、血清杀菌能力等的变化，为APEC的致病性研究奠定基础。王利丽，等.基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响第7期6911材料与方法1.1主要实验材料质粒pKD3、pKD46、pCP20由吉林农业大学康元环教授惠赠；APEC参考株CE129(WT)、质粒pBR322均由扬州大学朱国强教授惠赠。限制性内切酶及T4 DNA连接酶均购自NEB公司；刚果红、考马斯亮蓝、荧光增白剂、琼脂糖DNA回收试剂盒均购自Tiangen公司；ID32E试纸条为法国梅里埃公司产品。SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。1.2姿-Red同源重组引物设计根据NCBI中登录的APEC基因组序列(CP032078.1)采用Primer Premier 5设计引物(表1)，P1/P2用于扩增打靶基因片段，由两部分组成，P1加下划线的基因序列与待敲除基因序列同源，P2加下划线的基因序列与氯霉素抗性基因两侧序列互补。P3/P4引物位于基因开放阅读框外侧，用于缺失菌株的鉴定。P5/P6引物用于构建回补质粒并利用P3/P4引物鉴定回补菌株。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3APEC基因缺失株及回补株的构建与鉴定参照文献8，利用姿-Red同源重组方法敲除基因。以质粒pKD3为模板，采用P1/P2引物扩增打靶基因片段；将pKD46电转化APEC CE129株，构建重组菌株pKD46/CE129，再将扩增的打靶基因电转化pKD46/CE129株，在含氯霉素抗性的LB平板上挑取菌落并采用P3/P4引物经PCR鉴定无误后，将菌株于42水浴5 h6 h，获得在氯霉素抗性的LB平板生长而在氨苄抗性的LB平板不生长的菌株以消除pKD46，获得含基因的缺失株CE129驻:。将质粒pCP20电转化CE129驻:菌株中，以消除基因，再将含pCP20质粒的缺失株在42水浴5 h6 h后获得在LB平板生长，而在氨苄抗性的LB平板不生长的菌株，并利用P3/P4引物经PCR和测序鉴定，得到基因缺失菌株CE129驻(KO)。以提取的CE129株为模板，采用P5/P6引物经PCR扩增基因片段后克隆至pBR322质粒中，构建重组质粒pBR322-，经PCR鉴定的阳性质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定无移码错位突变后再电转化CE129驻菌株，构建回补株CE129驻/(RS)并采用P3/P4引物经PCR和测序鉴定。1.4各菌株生长曲线的测定及生化特性的鉴定将CE129、CE129驻及CE129驻菌株分别接种于LB与含氨苄抗性的LB液体培养基，37振荡培养过夜，次日将各菌株按1颐50分别转接至LB、M9培养基，37同步振荡培养，每隔1 h吸取菌液，测定OD600nm值，连续测10 h，绘制生长曲线，分析各菌株生长特性。根据说明书利用梅里埃自动生化鉴定系统对WT、KO、RS菌株进行生化特性鉴定。1.5缺失株的体外竞争也即毒力致弱试验参考文献9，将培养到对数期的WT和KO菌株以1颐1的比例混匀，接种于5 mL LB液体培养基中，37培养4 h，10倍倍比稀释后分别涂布LB平板及含氯霉素抗性的LB平板，37培养12 h后菌落计数。根据竞争指数（Competitive index，CI=输出量的比率(4 h时缺失菌数量/野生菌数量)/输入量的比率(0 h时缺失菌数量/野生菌数量)，参照文献10标准判定缺失株的致弱程度：CI值在0.11，缺失株毒力轻度致弱；CI值在0.010.1，缺失株毒力中度致弱；CI值在00.01，缺失株毒力高度致弱。1.6各菌株的药敏试验参照CLSI试验标准，利用K-B纸片法检测WT、KO、RS菌株对大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、茁-内酰胺类、酰氨醇类、多肽类等8类16种抗生素的敏感性。表1PCR引物信息引物名称Primers nameP1P2P3P4P5P6引物序列(5-3)Primers sequences(5-3)GAAGTATGACGAGTATGAAAGAGTGATGCGGATACAAAGGAGTAACTATGTTATCTCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGACGCGGTAAAAGCCCATTATTGACAGACCGTTGCTCAGAATCACGCCAACAAACAGTACAATGGGAATTAGCCATGGTCCAAAGAGTGATGCGGATACAAAGGATAGAACGCTGGATGCCGGAGACATCGAAAACAATCCCGTGGTAGCATTAACCGGCAAAAATCGGCAACAT扩增片段长度(bp)Amplicon length(bp)6006001200/600*：KO菌株扩增片段大小*:Amplicon length of KO strain中 国 预 防 兽 医 学 报2023年6921.7各菌株运动能力检测参照文献11，将WT、KO、RS菌株分别接种至LB液体培养基中，37振荡培养过夜，次日各取5滋L菌液，穿刺接种于半固体培养基平板的中心部位，37培养6 h后测量各菌株的运动直径，每个菌株平行做3次，分析其运动能力。1.8各菌株BF形成能力及其组分的检测结果参照文献12通过试管结晶紫法和96孔板微量结晶紫法(OD570nm值)分别定性、定量检测WT、KO、RS菌株BF的形成能力。另外，参照文献13将各菌株分别接种于刚果红培养基(160 mg/L刚果红、10 mg/L考马斯亮蓝)，28培养48 h，观察各菌株菌落形态和颜色，产生curli菌毛的菌株形成表面边缘粗糙多皱的红色菌落，不产生curli菌毛的菌株形成表面光滑的白色菌落；将各菌株分别接种含荧光增白剂(200 mg/L)的培养基，28培养48 h，在OD366nm紫外线下比较菌落荧光强弱，分析菌落BF的纤维素含量。1.9各菌株抗环境应激能力检测参考文献14，将WT、KO、RS菌株 在LB液体培养基中培养 至OD600nm值为1，按1颐100比例分别转接到具有酸性应激(pH4.0)、碱性应激(pH10.0)、氧化应激(10 mmoL/LH2O2)、热应激(42)、铁饥饿条件(200滋mmoL/L2.2-联砒啶(Dipyridyl)、硝化应激(50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L NaNO2)条件下培养1 h，对其10倍倍比稀释后涂布LB板，37培养12 h，通过菌落计数分析各菌株的生存率，生存率=(培养1 h后菌数/初始菌数)伊100%，分析各株菌抗环境应激能力。1.10各菌株抗不同浓度血清杀菌试验血清抵抗力与APEC感染期间的毒力相关。采集SPF鸡血清，用pH7.2的PBS缓 冲液 稀释 至含 血清 分别 为5%、12.5%、25%、50%、100%，同时与未稀释的血清在56金属浴30 min灭活，即为灭活血清(HI)。设大肠杆菌DH5琢作为对照。分别吸取WT、KO菌液各10滋L(含106cfu各细菌)接种于上述190滋L含不同浓度血清的悬液中，混匀后37培养30 min。10倍倍比稀释后涂布LB平板，37培养12 h后菌落计数，每个试验组重复检测3次。1.11数据的统计与分析利用GraphPad prism 8软件统计与分析各组实验数据，采用 检验分析各组实验数据的差异性。*：0.05表示差异显著，*：0.01、*：0.1王利丽，等.基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响第7期6952.6各菌株BF的形成能力及其组分的检测结果通过结晶紫法分别定性、定量检测WT、KO、RS菌株BF的形成能力。试管结晶紫法定性检测结果显示，KO菌株在气液交界处形成的紫色菌环明显少于WT、RS菌 株(图4A)；96孔 板 结 晶 紫 定 量 检 测(OD570nm值)结果显示，相对于WT、RS菌株，KO菌株BF的形成能力极显著降低(0.001)(图4B)。表明GltS参与APEC BF的形成。利用刚果红琼脂板检测各菌株curli菌毛的形成，结果显示，WT、RS菌落均能够在刚果红的琼脂板上形成表面边缘粗糙且带有明显褶皱的红色菌落，而KO菌落表面边缘均较光滑且呈微红色(图4C)。表明GltS参与APEC BF成分中curli菌毛的形成。利用含荧光增白剂的琼脂板检测各菌株BF纤维素的合成，结果显示，WT、KO、RS菌株的荧光发光强度均一致(图4D)。表明GltS与APEC BF成分中纤维素的形成无关。*:0.01;*:0.001图5各菌株抗环境应激能力的检测结果A：试管法检测各菌株BF的形成能力；B：96孔板法检测各菌株BF的形成能力；C：各菌株在刚果红琼脂板形成的菌落形态；D：含荧光增白剂琼脂板菌落形态的观察A:Comparison of biofilm formation ability by tube method;B:Comparison of biofilm formation ability by 96-well plate method;C:Observation of colonymorphology of congo red agar plate;D:Observation of bacterial liquid morphology of agar plate containing fluorescent whitening agent图4基因对各菌株BF的形成及对BF成分影响的测定结果WTKORSWTKORSWTKORSABCD0.200.150.100.050WT KO RS*:0.0012.7各菌株抗环境应激能力的检测结果将WT、KO、RS菌株在各种应激条件下培养，统计各菌株的生存率，结果显示，WT和RS菌株在各应激条件下均无显著差异，与WT和RS菌株相比，KO菌株的氧化应激能力无显著差异，而在酸、碱、热、铁饥饿应激环境中，KO菌株的生存率均极显著降低(0.001、0.0001)；在硝化应激环境中，在50 mg/L、100 mg/L NaNO2中KO菌 株 的 生 存 率 显 著 降 低(0.01)；在150 mg/L NaNO2中，KO菌株的生存率极显著降低(0.001)(图5)。表明GltS参与和调控APEC对抗各种条件下的应激反应。2.8各菌株抗不同浓度血清杀菌试验分别将WT、KO菌株接种于不同浓度的血清中，37培养30 min后经细菌计数。结果显示，在5%25%浓度的血清中，WT、KO菌株与对照菌株DH5琢的数量均无显著差异，而在50%100%浓度的血清中，WT、KO菌株的数量显著高于DH5琢对照菌株(0.05)；而在不同浓度血清中KO菌株与WT菌株的数量差异均不显著；在HI中，WT、KO及DH5琢菌株的数量均无显著差异(图6)，表明基因并不影响APEC的抗血清杀菌作用。50mg/L,100mg/L,150mg/L NaNO2200滋mol/L 2,2-Dipyridy110mmol/L H2O2pH10.0pH4.02001501005002001501005004030201008060402006040200252015105050mg/L150mg/L100mg/LWT KORSWT KORS WT KORSWTKORSWTKORSWTKORSWTKORSWTKORS42123讨论在病原菌感染过程中，机体会通过限制营养等各种方式控制病原菌的增殖，而病原菌能否获取足够的营养对其的感染及致病至关重要，因此，病原菌衍生出各种营养转运系统以更大程度地获取营养15。氨基酸、碳水化合物和脂类等是病原菌新陈代谢和生命活动的基础营养物质，谷氨酸是革兰氏阳性和阴性菌中细菌细胞壁肽聚糖的重要成分，GltS是一种参与D-谷氨酸和L-谷氨酸转运至大肠杆菌中的蛋白质16，有研究表明GltS对于细菌获取谷氨酸极为重要17-18。谷氨酸是主要的氮库，可以提供细菌高达85%的氮需求19。有研究表明基因缺失后会导致细菌摄取谷氨酸的能力下降20，由此推测基因缺失可能会影响APEC的生长特性及生化特性。但本研究结果显示，无论在营养丰富的培养基中还是在限制营养的M9培养基中，WT、KO和RS菌株的生长趋势及生长特性均无明显差别。尽管如此，本研究通过菌株毒力的致弱试验，即在同一种培养基培养各菌株，发现基因缺失株为轻度致弱，表明基因能够影响APEC的毒力，但基因缺失后对APEC的生化特性无显著影响，其具体机制有待进一步研究。APEC的外膜系统与其耐药性、保护其免受环境应激有关21，其中外膜蛋白可以通过改变细胞外膜的通透性诱导细菌耐药性的形成22。因此，本研究对外膜蛋白GltS是否影响APEC对抗生素的敏感性做了检测，结果显示WT、KO和RS菌株对所检测抗生素的敏感性均无显著影响，表明GltS不参与APEC耐药机制的调控。细菌的运动机制及运动器官的形成机制很复杂，鞭毛是细菌的主要运动器官，在黏附及感染宿主细胞的过程中发挥重要作用23。但本研究发现基因缺失后APEC的运动能力并未显著减弱，因此推测GltS可能不参与APEC鞭毛的合成。细菌为了抵抗外界不良应激环境而进化出一系列的调节机制以形成稳定的BF24。有研究表明，谷氨酸会影响细菌BF的形成及毒力25。本研究结果显示，基因缺失后影响细菌BF的形成能力，推测在不同的应激环境下，其生存能力也会下降，有研究表明EnvZ/OmpR,CpxA/CpxR和RcsC/RcsD/RcsB等双组分调控系统是细菌能够应对不同生存条件，保持其原有生命力和致病力等生理特性的重要系统26，本研究结果显示基因的缺失使APEC的多种抗应激能力均不同程度下降，提示基因有可能影响双组分调控系统的调节作用。当细菌处于高酸碱等不利条件时双组分系统会起到非常重要的调控作用27-28。有研究表明，APEC具有复杂的耐酸系统，且其耐酸系统与其致病力密切相关，而且热应激、饥饿等环境会使细菌的耐酸性增强29。本研究结果表明基因参与APEC的耐酸应激，因此推测，基因影响APEC抗应激能力的同时，对其致病力也会产生一定影响。APEC对血清的抗性主要受胞外多糖、脂多糖和一些外膜蛋白的调节，谷氨酸转运体是所有细菌细胞表面的微小蛋白，GltS作为谷氨酸的转运蛋白，其缺失后对血清杀菌的抵抗力并未显著减弱，由此推测GltS蛋白并不是影响血清抗性的主要转运蛋白。综上，本研究结果证实，谷氨酸转运蛋白GltS编码的基因缺失可以引起APEC体外竞争能力(表现为一定程度的致弱)、BF形成能力以及抗环境应激能力的改变，本研究为进一步探究APEC基因功能及其致病机制奠定了基础。参考文献：KAWA 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