鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212022鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用郭鹏宇，赵妍*，刘胜旺*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室 禽呼吸道传染病创新团队，黑龙江 哈尔滨150069)摘要：鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒gG蛋白的间接竞争ELISA方法，本研究以原核系统表达ILTV gG蛋白，并采用切胶纯化该重组gG蛋白(rgG)后经western blot检测纯化的rgG(P-rgG)与本研究室制备的gG蛋白单克隆抗体(MAb)3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8)，利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示，P-rgG与MAb 3C8发生了特异性反应，在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1颐51 200。以P-rgG作为包被抗原，以纯化的HRP-3C8作为检测抗体，通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV gG蛋白间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示，P-rgG包被量为12.5 ng/孔，HRP-3C8抗体稀释度为1颐10 000，将待检样品与HRP-3C8抗体在37孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min，TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)逸31.08%判为阳性；采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV)，通过计算PI，评估该方法的特异性；按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID50)，再将该病毒2倍倍比稀释(1颐101颐2 560)后，以该ic-ELISA方法检测，评估该方法的敏感性；利用同批次和不同批次P-rgG分别包被ELISA板，采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品，评估该方法的重复性。结果显示，该方法除了能检测ILTV外，其余相关病毒均为阴性结果；将ILTV稀释至1颐320时检测结果仍为阳性，相当于75 EID50/0.1 mL；批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR(qPCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗，该方法检测结果显示，阳性检测率为73.3%(44/60)，阴性率为26.7%(16/60)。qPCR的检测结果显示，阳性检测率为81.7%(49/60)，阴性率为18.3%(11/60)，二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%，总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV gG蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好，可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品，为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。关键词：鸡传染性喉气管炎病毒；gG蛋白；单克隆抗体；间接竞争ELISA中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0704-06Establishment and preliminary application of an indirectcompetitive ELISA for detecting the gG protein of infectiouslaryngotracheitis virusGUO Peng-yu,ZHAO Yan*,LIU Sheng-wang*(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Avian Respiratory Diseases Division,收稿日期：2022-12-20基金项目：黑龙江省自然科学基金(团队项目)(TD2021C001)；现代农业产业技术体系岗位科学家专(CARS-40-K18)作者简介：郭鹏宇(1998-)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事禽呼吸道病诊断方法的研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authorHarbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:Infectious laryngotracheitis is an acute and highly contagious respiratory disease caused by infectiouslaryngotracheitis virus(ILTV).In order to establish an indirect competitive ELISA(ic-ELISA)method for the detection of gGprotein of the virus,ILTV gG protein was expressed in prokaryotic system,and the recombinant gG protein(rgG)was purified(P-rgG)by gel slices,and the reactivity of P-rgG with monoclonal antibody(MAb)3C8 of gG protein prepared in our laboratorywas detected by western blot.MAb 3C8 was purified by Protein G affinity chromatography and coupled with HRP(HRP-3C8).The titer of the purified HRP-3C8 was determined by indirect ELISA.The results showed that P-rgG reacted specifically with MAb3C8,and specific bands appeared at 30ku.The titer of purified HRP-3C8 was 1颐51200.The P-rgG and purified HRP-3C8 wereused as the coated antigen and the detection antibody,respectively.An ic-ELISA method for ILTV gG protein was established byoptimizing the reaction conditions.The results showed that the coated amount of P-rgG was 12.5ng/well and the dilution ofHRP-3C8 antibody was 1颐10000.The samples to be tested were incubated with HRP-3C8 antibody at 37for 40min and thenadded to ELISA plate for 20min,and the reaction time of TMB substrate was 10min.The inhibition rate(PI)逸31.08%of testedsamples was considered as positive.The method was used to detect ILTV,Newcastle disease virus,infectious bronchitis virus(IBV)and fowlpox virus(FPV),and the specificity of the method was evaluated by calculating the inhibition rate PI.The 50%egginfectious dose(EID50)of ILTV K317 strain was measured by Reed-Muench method,and then the virus was diluted by a 2伊ratio(1颐10-1颐2560),and then detected by ic-ELISA method to evaluate the sensitivity of the method.The P-rgG from the same batchand different batches were coated with ELISA plates respectively,and the positive and negative ILTV samples were detected bythe ic-ELISA method to evaluate the repeatability of the method.The results showed that the other related viruses were negativeresults except ILTV.When ILTV was diluted to 1颐320,the detection result was still positive,equivalent to 75 EID50/0.1mL.Thecoefficient of variation for both intra-batch and inter-batch repeats tests was less than 10%.The method and fluorescencequantitative PCR(qPCR)were used to detect 50 sample of oropharyngeal swabs and laryngeal tissues of clinically infectedchickens with ILTV,IBV and FPV,and 10 ILTV vaccines,respectively.The ic-ELISA method showed that the positive rate was73.3%(44/60)and the negative rate was 26.7%(16/60).The results of qPCR showed that the positive detection rate was 81.7%(49/60)and the negative rate was 18.3%(11/60).The positive and negative coincidence rates of the two methods were 90.9%and87.8%,respectively,and the total coincidence rate was 88.3%.The ic-ELISA method established in this study has strongspecificity,high sensitivity and good repeatability,which provides a new technical means for detection of various clinical samplesof ILTV-infected chickens and ILTV vaccine in the laboratory.Key words:infectious laryngotracheitis virus;gG protein;monoclonal antibody;ic-ELISA鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病1。该病剖检病变主要为气管黏膜肿胀、糜烂和出血，严重时可导致死亡2。ILTV具有典型的疱疹病毒形态学特征，糖蛋白G(Glycoprotein G，gG)是ILTV的主要囊膜糖蛋白之一，其在琢疱疹病毒中编码的基因序列相对保守3，参与病毒的有效增殖及细胞间扩散等多种生物学过程4。在ILTV感染后2 d即可在气管中检测到gG蛋白，早于机体出现临床症状的时间5。因此，gG蛋白可用于病毒感染早期的检测5。目前，ILTV的检测方法有病毒分离、中和试验、PCR、荧光定量PCR、ELISA6以及琼脂扩散试验7等。其中，荧光定量PCR方法可以在2 h内完成检测，是一种非常快速的检测方法8，但对仪器设备要求较高，现地应用受限。而ELISA方法快速、敏感，操作简便，更适用于临床应用9。但ILTV的间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法目前尚未见报道。因此，本研究利用纯化的ILTV gG蛋白作为竞争抗原，以特异性识别gG蛋白的单克隆抗体(MAb)为检测抗体，并通过各反应条件的优化初步建立ic-ELISA方法，为ILTV的检测提供新的技术支持。1材料与方法1.1主要实验材料及实验动物ILTV活疫苗K317郭鹏宇，等.鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用第7期705株、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、鸡痘病毒(Fowlpox virus，FPV)、48份ILTV阴性样品(包括鸡胚尿囊液，口咽拭子和喉头组织)、50份来自ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、gG蛋白MAb 3C8杂交瘤细胞株、大肠杆菌Rosetta感受态细胞、表达质粒pET-30a-gG均由本实验室保存；10份ILTV活疫苗分别购自哈尔滨维科生物技术有限公司和哈药集团生物疫苗有限公司。SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物资源库提供。SPF级8周龄BALB/c雌性小鼠购自辽宁长生实验动物中心。动物实验由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所伦理审查委员会批准(HVRI-IACUC-2020-213)，并按照相关动物试验规程和动物伦理指南进行。1.2主要试剂RPMI 1640培养基购自Gibco公司；Fetal Bovine Serum/胎 牛 血 清 购 自HyClone公 司；PageRuler预染蛋白Marker、Triton X-100购自ThermoFisher公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5伊)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Protein G亲和层析介质购自金斯瑞生物科技股份有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)偶联试剂盒-Lightning-LinkR购自Abcam公司；酶标板稳定剂I购自湖州英创生物科技有限公司；KPL SureBlue TMB显色底物、KPL TMB终止液、DyLightTM800标记的鼠源lgG(H+L)荧光抗体购自Seracare Life SciencesInc公司；IPTG、弗氏完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20购自Sigma公司。1.3重组gG蛋白(rgG)的诱导表达、纯化与鉴定 将重组质粒pET-30a-gG转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，372.5 h后加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG诱导表达，4 h后10 000 g离心5 min收集菌体，超声破碎后，将上清和包涵体分别经SDS-PAGE分离后，以0.25 mol/L KCl溶液浸泡，切下含目的蛋白的胶条加PBS(0.1 mol/L pH7.4)冻融碾碎，吸出蛋白溶液，用10 ku MWCO超滤管过滤后将缓冲液换成PBS，即为纯化的rgG(P-rgG)。利用BCA法测定P-rgG的浓度。以MAb 3C8腹水(1颐1 000)为一抗，以DyLightTM800标记的鼠源lgG(H+L)荧光抗体(1颐10 000)为二抗，采用western blot检测P-rgG与MAb 3C8的反应原性。1.4gG蛋白MAb 3C8小鼠腹水 的制 备、纯化、HRP标记与效价测定将MAb 3C8的杂交瘤细胞以含10%FBS的RPMI 1640培养至对数生长期，以2伊105个/只注射到用弗氏完全佐剂(0.5 mL/只)致敏7 d的BALB/c小鼠腹腔中。待小鼠腹部膨胀后无菌采集腹水。采用Protein G亲和层析柱纯化小鼠腹水10-11，并采用SDS-PAGE检测。将纯化的MAb 3C8(0.1 mg)按照HRP偶联试剂盒说明书标记后命名为HRP-3C8。以P-rgG包被ELISA板，利用间接ELISA法分别测定2倍倍比稀释(1颐1001颐102 400)的纯化的MAb 3C8和HRP-3C8的抗体效价。1.5ic-ELISA检测方法的建立及反应条件的优化按照如下方式优化该ic-ELISA方法的各反应条件：分别以碳酸盐缓冲 液(CBS)(0.05 mol/L pH9.6)、Tris-HCl缓 冲 液(0.05 mol/L pH8.6)和PBS为包被液；将P-rgG分别以100 ng/孔、50 ng/孔、25 ng/孔、12.5 ng/孔和6.25 ng/孔4包被过夜；以5%脱脂乳、1%BSA和酶标板稳定剂I为封闭液，37作用2 h；以1%Triton X-100和PBS为样品稀释液；将HRP-3C8检测抗体分别稀释1颐5 000、1颐10 000、1颐20 000和1颐40 000；以PBS作为阴性对照，以ILTV疫苗作为阳性对照，将待检样品、阴、阳性对照样品分别与HRP-3C8抗体于37分别预孵育0、20 min、40 min和60 min后，加入ELISA板内37反应15 min、20 min、25 min和30 min；TMB底物反应时间分别为5 min、10 min、15 min和20 min后；终止反应，分别测OD630nm值，计算抑制率(Percentage inhibition，PI)。以PI最高为依据确定上述各最佳反应条件。PI=(阴性对照OD630nm值-检测样品OD630nm值)/(阴性对照OD630nm值-空白对照OD630nm值)伊100%以最佳ic-ELISA反应条件检测48份ILTV阴性样品(包括鸡胚尿囊液、口咽拭子和喉头组织)的OD630nm值，并通过公式计算临界值：临界值=样品PI的平均值(x)+3伊标准差()，计算各样品PI值，如果待检样品PI逸临界值，即判定为阳性。1.6特异性试验以优化后的ic-ELISA反应条件检测ILTV、NDV、IBV和FPV，计算各病毒的PI，评估该方法的特异性。1.7敏感性试验按照Reed-Muench法12测定ILTVK317株的鸡胚半数感染量(EID50)；将ILTV K317株2倍倍比稀释(1颐101颐2 560)后，以最佳ic-ELISA反应条件检测，以高于临界值的最高稀释倍数对应的EID50作为该方法的敏感性。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年7061.8重复性试验利用同批次和不同批次的P-rgG分别包被ELISA板，以最佳ic-ELISA反应条件检测ILTV阳性样品(接种ILTV的细胞培养物和尿囊液)和ILTV阴性样品(接种FPV的细胞培养物和尿囊液)各5份，各设3个重复，计算PI的 和。根据公式：变异系数(CV)=(/x)伊100%，计算批内、批间重复性试验变异系数，评价该方法的重复性。1.9临床样品的检测对50份来自ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织处理：称0.1 g喉头组织，剪碎，匀浆，加入900滋L 1%Triton X-100，再次匀浆，反复冻融3次后8 000 g离心2 min，上清液即为待检组织样品。拭子处理：将采集的拭子在含PBS的离心管中充分按压涡旋，反复冻融2次后8 000 g离心2 min，上清液即为待检拭子样品。按照说明书将10份疫苗分别以PBS稀释到10羽份，即为待检疫苗。以本研究建立的ic-ELISA方法和荧光定量PCR(qPCR)方法13同时检测上述待检样品，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率。2结果2.1rgG 的 表 达、纯 化 与 鉴 定 结 果将 重 组 菌pET-30a-gG/Rosetta经IPTG诱 导 表 达 后，经SDS-PAGE检测。结果显示，在约30 ku处出现目的条带，与rgG的大小相符，且以包涵体的形式存在(图1A)。采用ImageJ方法计算P-rgG的纯度95%。BCA试剂盒测得该蛋白浓度为1.5 mg/mL。Western blot结果显示，在30 ku处出现特异性条带(图1B)。上述结果表明，rgG主要以包涵体的形式获得了表达，且P-rgG能够与MAb 3C8发生特异性反应。2.2MAb 3C8的纯化与HRP标记将制备的MAb3C8小鼠腹水利用Protein G亲和层析纯化后与未纯化的腹水一起采用SDS-PAGE检测。结果显示，未纯化的MAb 3C8杂带多，纯化的MAb 3C8出现清晰的抗体重链和轻链的目的条带，且无杂带(图2)。利用间接ELISA对纯化的MAb 3C8和HRP-3C8抗体测定效价分别为1颐12 800和1颐51 200。表明，获得了纯度及效价均较高的MAb 3C8。2.3ic-ELISA反应条件的优化确定以PI最高为依据优化ic-ELISA的各反应条件，结果显示，确定最佳包被液为CBS；最佳rgG包被量为12.5 ng/孔；封闭液为5%脱脂乳，37封闭2 h；HRP-3C8稀释倍数为1颐10 000；待检样品稀释液为1%Triton X-100；待检样品与HRP-3C8抗体37孵育40 min，加入ELISA板再反应20 min；TMB底物显色时间为3710 min。2.4临界值的判定结果以最佳ic-ELISA反应条件检测48份ILTV阴性样品，计算得到各样品PI，利用SPSS 20.0对48份ILTV阴性样品PI进行正态分布分析，PI介 于1%25%(图3)，为13.14%，为5.98%，+3为31.08%，即PI逸31.08%的样品判定为阳性，PI31.08%的样品判定为阴性。2.5特异性试验结果利用本研究建立的ic-ELISA方法检测ILTV、IBV、FPV和NDV，除了ILTV PI为93%为阳性，IBV、FPV和NDV的PI分别为7.5%、6.3%和5.6%均低于31.08%为阴性(图4)。表明该方法的特异性较强。2.6敏感性试验结果以Reed-Muench法12测定ILTVK317疫 苗 株 的 毒 价 为104.38EID50/0.1 mL。利 用ic-ELISA方法检测1颐101颐2 560稀释的ILTV疫苗株(相当于2 400 EID50/0.1 mL9.375 EID50/0.1 mL)，结郭鹏宇，等.鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用第7期707A：M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导的pET30/Rosetta；24：IPTG诱导的pET30a-gG/Rosetta菌体、包涵体及上清液；5：P-rgGA:M:Protein Marker;1:Induced pET30/Rosetta with IPTG;2-4:Induced of pET30a-gG/Rosetta,inclusion body and supernatantwith IPTG,respectively;5:P-rgG图1rgG的SDS-PAGE检测(A)及P-rgG的western blot鉴定(B)结果55ku40ku35ku25ku55ku40ku35ku25ku30ku30kuM12345M12BAM:Protein Marker;1:MAb 3C8;2:Purified MAb 3C8图2纯化的MAb 3C8的SDS-PAGE检测结果55ku40ku35ku25kuM1215ku70ku100ku表2ic-ELISA方法与qPCR方法的比较结果ic-ELISA阳性样品数Number of positive samples阳性样品总数Total number of positive samples阴性样品数Number of negative samples阴性样品总数Total number of negative samples合计Total拭子Swabs264疫苗Vaccines100喉头组织Laryngeal tissue72拭子Swabs17疫苗Vaccines00喉头组织Laryngeal tissue03合计Total441660阳性样品数Number of positive samples阴性样品数Number of negative samplesFluorescence quantitative PCR4364911011图3阴性样品的正态分布图302520151050PI(%)25.1019.1213.147.161.18图4ic-ELISA方法的特异性试验结果10080604020031.08%937.56.35.6表1ic-ELISA方法的重复性试验结果ILTV阳性样品ILTV positive sampleILTV阴性样品ILTV negative sample样品编号Sample No.1234512345x依(%)93.7依1.892.2依1.793.0依4.881.2依2.089.5依1.123.1依1.314.8依1.313.1依0.33.0依0.25.3依0.5CV(%)1.921.845.162.461.185.638.782.296.679.43x依(%)90.2依6.190.1依0.888.3依1.590.1依0.788.8依2.222.9依1.815.3依0.912.8依0.72.8依0.14.7依0.4CV(%)6.768.881.707.772.487.865.885.473.578.51批内重复试验Intra-batchrepeatability assay批间重复试验Inter-batchrepeatability assay图5ic-ELISA方法的敏感性试验结果31.08%10080604020093918374614326156中 国 预 防 兽 医 学 报2023年708果显示，该疫苗株稀释至320倍时PI为43.12%，仍为阳性(图5)，相当于75 EID50/0.1 mL，表明该方法的敏感性较高。2.7重复性试验结果利用ic-ELISA方法对阴、阳性样品各5份分别进行批内、批间重复性试验。结果显示，批内和批间重复性试验的变异系数分别为1.18%9.43%及1.70%8.88%均小于10%(表1)，表明该方法的重复性较好。2.8临床样品检测结果采用本研究建立的ic-ELISA和qPCR方法分别检测60份临床样品，结果显示，ic-ELISA的检出率为73.3%(44/60)，阴性率为26.7%(16/60)；qPCR的检出率为81.7%(49/60)，阴性率为18.3%(11/60)(表2)。两种 方 法 的阳 性 符 合 率 为87.8%；阴性符合率为90.9%；总符合率为88.3%。本研究建立的ic-ELISA的敏感性虽然低于qPCR方法，但由于不需要昂贵的检测设备，更适用于基层临床样品的检测。郭鹏宇，等.鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用第7期709(下转第728页)3讨论近年来，ILT的暴发遍布世界各国14-16，伊朗在2021年首次报道了该病17。2022年在我国广东、上海等地也均有报道18，给养禽业造成严重的经济损失。因此，快速、敏感、特异、适合于临床应用的ILTV检测方法对于疾病的早期诊断及防控措施的制定尤为重要。钟涛等以纯化的重组TGEV N蛋白和N蛋白MAb建立了一种快速检测TGEV感染猪粪便样品的ic-ELISA方法，为TGEV的早期快速检测提供了新方法19。本研究基于纯化的ILTV rgG蛋白和gG蛋白的MAb 3C8建立了ILTV ic-ELISA检测方法。该方法仅能特异性检测ILTV，而对其他禽呼吸道病病原检测均为阴性结果，特异性较强；严隽端等建立的单抗夹心ELISA方法对纯化的ILTV的检测限为31.0 ng/mL，敏感性相对较高，但因未将该数据换算为TCID50，无法与本研究建立的ic-ELISA方法的敏感性相比20；张小荣等建立的双抗体夹心ELISA方法最低能够检测到100 TCID50/mL的ILTV9，而本研究建立的方法能够检测到相当于75 EID50的ILTV，敏感性更高。利用本研究建立的ic-ELISA方法与qPCR同时检测60份 临 床 样 品 的 阴、阳 性 符 合 率 分 别 为90.9%和87.8%，总符合率为88.3%，存在一定的差异。推测可能有以下两个原因：一是二者检测抗原的种类不同，本研究建立的ic-ELISA方法检测的是ILTV gG蛋白，而PCR检测的是核酸；二是二者检测抗原量的不同，ic-ELISA检测的是样品的起始含量，而PCR检测的是扩增后的最终含量。因此，荧光定量PCR对临床ILTV样品检测的敏感性高于ic-ELISA方法。但由于荧光定量PCR方法对实验人员及设备的要求均相对较高，因此，ic-ELISA方法更适合在基层临床上的应用与推广。本研究建立的ILTV ic-ELISA方法特异、敏感、准确性较高，且检测时间相对较短。70 min内即可完成样品的检测，与传统的病原分离鉴定、中和试验等相比既快速、敏感又省时、省力；与荧光定量PCR相比耗时相当。并且，该方法能够检测细胞培养液、鸡胚尿囊液，鸡的口咽拭子，喉头组织以及ILTV疫苗等样品，检测范围较广，为该病的流行病学调查和早期临床检测提供了新的技术手段。参考文献：殷震.动物病毒学M.北京：科学出版社：1985.BAGUST T J,JONES R C,GUY J S.Avian infectious laryngo-tracheitis J.Rev sci Tech Oie,2000,19(2):483-492.MAHMOUDIAN A,KIRKPATRICK N C,COPPO M,et al.Development of a SYBR Green quantitative polymerase chainreaction assay for rapid detection and quantification of infectiouslaryngotracheitis virus J.Avian Pathol,2011,40(3):237-242.GUY J S,BARNES H J,SMITH L G.Rapid diagnosis of infec-tious laryngotracheitis using amonoclonal antibody-based im-munoperoxidase procedure J.Avian Pathol,1992,21(1):77-86.BENDEZU J,MORALES R S,MONTESINOS R,et al.Glyco-protein G(gG)production profile during infectious laryngotra-cheitis virus(ILTV)infection J.PLoS One,2019,14(8):e0219475.OIE,3.03.03_AVIAN_INF_LARYNGO EB/CD.https:/www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.03_AVIAN_INF_LARYNGO.pdf.,2021.SN/T 1555-2020.鸡传染性喉气管炎检疫技术规范S.王楷宬，王素春，孙亚伟，等.鸡传染性喉气管炎病毒实时荧 光PCR检 测 方 法 的 建 立 与 应 用J.中 国 动 物 检 疫，2020，37(3)：98-102.张小荣，张林，刘怡，等.一种检测传染性喉气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立J.中国家禽，2017，39(9)：16-19.王飞飞，黄凯伦，宋祖晨，等.欧亚类禽H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立J.中国预防兽医学报，2022，44(9)：946-952.向志达，李长尧，张涛清，等.非洲猪瘟病毒A137R蛋白单克 隆 抗 体 的 制 备 与 表 位 鉴 定J.中 国 预 防 兽 医 学 报，2022，44(4)：402-409.REED L J,MUENCH H.A Simple method of estimating fiftyper cent endpoints J.Am J Epidemiol,1938,27(3):493-497.赵妍，孔聪聪，张晓敏，等.鸡传染性喉气管炎病毒-Man real-time PCR检测方法的建立J.中国预防兽医学报，2012，34(8)：642-646.PONNUSAMY P,SUKUMAR K,RAJA A,et al.Characteriza-tion of infectious laryngotracheitis virus isolates from laying hensduring 2019-2020 outbreaks in Tamil Nadu,India J.Arch Vi-rol,2022,167(9):1819-1829.ELSHAFIEE E A,ISHAM I M,NAJIMUDEEN S M,et al.Host responses following infection with Canadian-origin wildtypeand vaccine revertant infectious laryngotracheitis virus J.Vac-cines(Basel),2022,10(5):782-801.ELSHAFIEE E A,HASSAN M,PROVOST C,et al.Compara-12345678910111213141516171819tive full genome sequence analysis of wildtype and chicken em-bryo origin vaccine-like infectious laryngotracheitis virus fieldisolatesfromCanada J.InfectGenetEvol,2022,104:105350-105360.RAZMYAR J,SHOKRPOOR S,BARIN A,et al.Isolation ofinfectious laryngotracheitis virus in broiler chicken in Iran:Firstreport J.Vet Res Forum,2021,12(2):259-262.WU MIN,ZHANG ZHI-FEI,SU XIN,et al.Biological Charac-teristics of infectious laryngotracheitis viruses isolated in ChinaJ.Viruses,2022,14(6):1200-1211.钟涛，唐丽杰，李一经，等.间接竞争ELISA检测TGEV方法的建立J.中国兽医杂志，2007，