Chapter-7-南工大生物分离工程(ppt文档).ppt

Chapter 7色谱技术色谱技术Chromatography本章主要知识点本章主要知识点uu什么是色谱分离技术？什么是色谱分离技术？uu色谱分离技术的分类色谱分离技术的分类uu什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？uu吸附色谱及其分类和基本原理吸附色谱及其分类和基本原理uu什么是分配色谱？什么是分配色谱？uu离子交换色谱的分类及应用离子交换色谱的分类及应用uu凝胶色谱的分离原理及分类凝胶色谱的分离原理及分类uu离子交换及疏水作用层析的原理离子交换及疏水作用层析的原理uu高效液相色谱的分离原理及应用高效液相色谱的分离原理及应用uu蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？色谱技术（分配色谱）uu概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有谱柱的一般结构含有固定相固定相（多孔介质）和（多孔介质）和流动流动相相(气体或液体气体或液体)，根据物质在两相间的，根据物质在两相间的分配行为分配行为不同不同（由于亲和力差异），（由于亲和力差异），经过多次分配经过多次分配（吸附（吸附-解吸解吸-吸附吸附-解吸解吸），达到分离的目的。），达到分离的目的。色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：有以下几种：吸附色谱吸附色谱利用物理吸附性能的差异，吸附力不同利用物理吸附性能的差异，吸附力不同分配色谱分配色谱 利用两液相间分配系数的不同利用两液相间分配系数的不同离子交换色谱离子交换色谱 利用离子交换原理，化学亲和力不同利用离子交换原理，化学亲和力不同凝胶色谱凝胶色谱 利用分子大小或形状差异（排阻作用力的不利用分子大小或形状差异（排阻作用力的不同）同）色谱法简单分类色谱法简单分类色谱系统的基本组成色谱分离的基本概念uu分配系数分配系数uu可由可由LangmuirLangmuir方程得出方程得出uuK Kd d-分配系数分配系数uuq q、c-c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度uu保留时间（保留时间（t tR R）和保留体积（和保留体积（V VR R）uu反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一程的基本热力学参数之一uu阻滞因子阻滞因子R Rf fuu阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相固定相没有亲和力的流动相 KKd d=0=0）的迁移率之比的迁移率之比uu体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小，体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小，A As s:固定相固定相固定相固定相平均截面积，平均截面积，平均截面积，平均截面积，A Amm:流动相平均截面积流动相平均截面积流动相平均截面积流动相平均截面积uu洗脱体积洗脱体积V Ve euu色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积为洗脱体积uu不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异脱体积也有所差异,V Vmm:色谱柱中流动相体积，色谱柱中流动相体积，色谱柱中流动相体积，色谱柱中流动相体积，V Vs s色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积色谱柱中固相体积uu色谱柱的理论塔板数、塔板高度色谱柱的理论塔板数、塔板高度uu反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系柱高之间的关系uu理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：uuN-N-理论塔板数理论塔板数 t tR R-保留时间保留时间uuWW1/21/2-半峰宽半峰宽 WWb b-峰底宽度峰底宽度uu理论塔板高度：理论塔板高度：L-L-柱长柱长吸附色谱uu原理原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离，的差异而实现分离，吸附吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反复多次洗脱反复多次洗脱被测组被测组分分配系数不同分分配系数不同 差速迁移差速迁移 分离分离uu关键要素：吸附剂和展开剂的选择关键要素：吸附剂和展开剂的选择关键要素：吸附剂和展开剂的选择关键要素：吸附剂和展开剂的选择uu吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH-OH和和和和-NH-NH2 2 分离机制：分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离Adsorption chromatography常用的吸附剂：常用的吸附剂：u氧化铝：氧化铝：有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。碱性氧化铝，混有碳酸钠等成分而带有碱性，碱性氧化铝，混有碳酸钠等成分而带有碱性，适用分离一些碱性成分适用分离一些碱性成分，如，如生物碱类，但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离，因为有时生物碱类，但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质，冲洗至中性。仍属于碱性吸附中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质，冲洗至中性。仍属于碱性吸附剂的范畴，剂的范畴，不适用于酸性成分的分离。不适用于酸性成分的分离。酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物，并使氧化铝颗粒酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物，并使氧化铝颗粒表面带有表面带有 NO3-或或 Cl-的阴离子，从而具有离子交换剂的性质，的阴离子，从而具有离子交换剂的性质，酸性氧化铝适酸性氧化铝适合于酸性成分的柱色谱。合于酸性成分的柱色谱。u硅胶：硅胶：适用于中性或酸性成分的柱色谱。硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂适用于中性或酸性成分的柱色谱。硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，通过离子交换反应吸附化合物。其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，通过离子交换反应吸附化合物。硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，能用于极性和非极性化合物的分离能用于极性和非极性化合物的分离u活性炭：活性炭：柱色谱用的活性炭，最好选用颗粒活性炭。柱色谱用的活性炭，最好选用颗粒活性炭。活性炭是非极性吸活性炭是非极性吸附剂，其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和附剂，其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱，因此水的洗脱能力能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱，因此水的洗脱能力最弱而有机溶剂较强。最弱而有机溶剂较强。主要分离水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。主要分离水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。u聚酰胺：聚酰胺：为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。醋酸及甲酸。聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通过分子中的，通过分子中的酰酰胺羰基胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离氨基游离氨基与醌类、与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种吸附的强弱则取决与各种化合物与之形成氢键缔合的能力。化合物与之形成氢键缔合的能力。主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、有机酸类、鞣质类等成分。有机酸类、鞣质类等成分。展开剂的选择uu展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大uu因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果得最佳的分离的效果uu展开剂选择的原则：展开剂选择的原则：（1 1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小性应比被分离物质的极性略小（2 2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力常用展开剂的洗脱能力及极性比较uu见书上151152一般吸附色谱的操作程序uu根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相分子结构）选择合适的固定相和流动相uu吸附操作：选择合适的操作条件（温度、吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pHpH值、值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数品含量以调整操作参数uu洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pHpH值以及体系值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物离子强度，最大限度地回收目标产物分配色谱分配色谱uu原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法的方法的方法的方法uu要素：要素：要素：要素：固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相固定相、载体、流动相 固定相固定相机械吸附在惰性载体上的液体机械吸附在惰性载体上的液体 流动相流动相必须与固定相不为互溶必须与固定相不为互溶 载体载体惰性，性质稳定，惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应不与固定相和流动相发生化学反应uu分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大,或溶或溶或溶或溶解度相差较大解度相差较大解度相差较大解度相差较大,或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物u分离机制：利用组分在流动相和固定相间溶解度差别进行分离分离机制：利用组分在流动相和固定相间溶解度差别进行分离uu载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体uu载体种类：载体种类：硅胶硅胶 硅藻土硅藻土 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶uu固定相：固定相：通常选取各组分溶解度大的通常选取各组分溶解度大的溶剂溶剂作为作为固定相固定相uu展开剂的选择展开剂的选择:选择各组分溶解度相差大的溶选择各组分溶解度相差大的溶剂剂 展开剂事先用固定相饱和展开剂事先用固定相饱和,防止破坏固定相防止破坏固定相uu流动相可以是流动相可以是极性的极性的（反相色谱反相色谱法），也可以法），也可以是是非极性非极性的（的（正相色谱正相色谱）*反相色谱固定相是非极性的反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的流动相是极性的离子交换色谱uu以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂定相，选择合适的溶剂定相，选择合适的溶剂定相，选择合适的溶剂作为流动相，作为流动相，作为流动相，作为流动相，uu分离机制：使溶质按照分离机制：使溶质按照分离机制：使溶质按照分离机制：使溶质按照其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法同而得到分离的方法同而得到分离的方法同而得到分离的方法常用的离子交换树脂uu葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶型 DEAE-DEAE-SephadexSephadex A-25 A-25，QAE-QAE-SephadexSephadex A-25 A-25，CM-CM-SephadexSephadex C-25 C-25，SP-SP-SephadexSephadex C-25 C-25uu纤维素系列离子交换剂纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel DEAE-Sephacel CellexCellex系列系列 uu琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂 SepharoseSepharose系列系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Sepharose CL-6B,Sepharose Fast FlowFlow Bio-Gel A Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂系列交联琼脂糖离子交换剂uuSource Source 系列离子交换剂系列离子交换剂uu特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低uu阳离子交换树脂阳离子交换树脂 S S系列系列uu阴离子交换树脂阴离子交换树脂 Q Q系列系列uuMonoBeadsMonoBeads 系列离子交换剂（系列离子交换剂（PharmaciaPharmacia）uu特点：介质为亲水性聚醚，具有和特点：介质为亲水性聚醚，具有和SourceSource系列相系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同的优点，但动态载量更大，寿命更长。uu同样分为同样分为Q Q系列和系列和P P系列系列Mini Q PC 3.2/3:Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting materialPeak 2Expanded Bed离子排斥色谱法uu待分离组分携带电荷与离子交换树脂骨架相同待分离组分携带电荷与离子交换树脂骨架相同,而相互排斥而相互排斥,不同组分排斥力而获得分离不同组分排斥力而获得分离uu碱性抗生素带正电荷碱性抗生素带正电荷,采用强碱性树脂可进行离采用强碱性树脂可进行离子排斥色谱法分离子排斥色谱法分离,如卡那霉素如卡那霉素ABCABC的分离的分离.(分子筛)凝胶色谱uu在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离使不同相对分子量的组分得以分离 固定相固定相多孔性凝胶多孔性凝胶 流动相流动相水水凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 流动相流动相有机溶剂有机溶剂凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱uu优点：优点：操作简便操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和分离条件温和应用广泛应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低分辨率低分离机制分离机制：利用分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离利用分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离分子筛凝胶色谱原理Desalting proteinsproteinssalts凝胶色谱填料uu葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶SephadexSephadex G-G-系列系列uu聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 SephacrylSephacryl系列系列uu琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶SepharoseSepharose系列系列SuperoseSuperose系列系列纸层析纸层析uu是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析分析uu介质：滤纸介质：滤纸uu操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹取下滤纸，晾干，染色显迹展开剂的选择展开剂的选择uu展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂uu常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸甲酸-水（水（1515：3 3：2 2）uu展开方式：展开方式：上行色谱，溶剂自下向上流动上行色谱，溶剂自下向上流动 下行色谱，溶剂自上向下流动，该法适合性质相近组分的下行色谱，溶剂自上向下流动，该法适合性质相近组分的分离分离 径向色谱径向色谱显迹：可采用化学试剂显色，如氨基酸层析体系中常用茚三显迹：可采用化学试剂显色，如氨基酸层析体系中常用茚三酮试剂显色酮试剂显色薄层色谱法薄层色谱法uu将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法的方法uu常用的固定相有：常用的固定相有：硅胶和氧化铝硅胶和氧化铝uu优点：优点：设备简单、操作方便设备简单、操作方便 快速快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析）灵敏度高（较纸层析）可以大量制备可以大量制备HPLC,高效液相色谱高效液相色谱HPLC 分离原理分离原理u液固吸附色谱液固吸附色谱:按照极性大小顺序先后分离按照极性大小顺序先后分离,非极性溶非极性溶质先流出质先流出u液液分配色谱液液分配色谱:类似于液类似于液-液萃取液萃取,同分配色谱同分配色谱u离子交换色谱离子交换色谱:与离子交换中心的不同亲和力与离子交换中心的不同亲和力u空间排斥色谱空间排斥色谱:类似于分子筛效应类似于分子筛效应,小分子易渗透保留小分子易渗透保留在凝胶内在凝胶内.30m15m5m反相液相色谱u液液-液色谱有正相和反相之分。液色谱有正相和反相之分。如果采用极性固定相和相对非极性流动相，如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。弱极性化合物。正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相反相色谱的流出顺序正好相反。另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相之分。之分。u反相液相色谱分离多肽和蛋白质是基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非反相液相色谱分离多肽和蛋白质是基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求。通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大地满足疏水的要求。通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性蛋白质和多肽的疏水性uu载体：微粒多孔硅胶（粒径载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m 5m20 m）Hypersil Spherosil XOB075Hypersil Spherosil XOB075uu固定相：固定相：C C1818、C C8 8烷基链，烷基链，C C8 8适于分离蛋白质适于分离蛋白质 C18C18适于分离核酸适于分离核酸 苯基苯基uu流动相的选择流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃四氢呋喃为什么反相色谱应用广泛?u它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。u适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。u保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。u所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。u选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。蛋白质分离常用的色谱方法uu免疫亲和层析免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离分离免疫亲和层析介质的获得：免疫亲和层析介质的获得：（1 1）获得抗体）获得抗体（2 2）抗体连接到载体上）抗体连接到载体上亲和色谱（Affinity chromatography）载体活化、配基连接、吸附、洗脱载体活化、配基连接、吸附、洗脱Competitive elutionuu疏水层析（疏水层析（HICHIC）在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。而实现多组分的分离。操作要点操作要点:蛋白质的局部变性，盐浓度高疏水作用强蛋白质的局部变性，盐浓度高疏水作用强，但高盐浓，但高盐浓度下的选择性差度下的选择性差洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行，一般采用有机洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行，一般采用有机溶剂或非离子型的洗涤剂。溶剂或非离子型的洗涤剂。Mechanism of HICuu离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点：操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定用阴离子交换，可视具体情况而定pHpI,蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用常采用弱阳或弱阴离子交换剂弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常值，使蛋白质适当解离，通常采用的采用的pH值靠近其等电点值靠近其等电点（不是等电点）（不是等电点）uu缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在1020m mol1020m moluu层析方案的确定，需要视试验情况作适当调层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整整uu洗脱方式：洗脱方式：pHpH梯度梯度 离子强度梯度离子强度梯度u金属螯合层析金属螯合层析 将螯合形成基团与琼脂糖等层析剂耦合，使将螯合形成基团与琼脂糖等层析剂耦合，使层析剂能层析剂能与过渡金属离子结合（如与过渡金属离子结合（如Cu2+,Zn2+,Fe3+）形成吸附中）形成吸附中心，这些金属离子能与一些配基配位，可与氨基酸的心，这些金属离子能与一些配基配位，可与氨基酸的咪唑基和巯基结合，可用于蛋白质的分离。咪唑基和巯基结合，可用于蛋白质的分离。操作要点操作要点金属离子对层析剂的亲和力必须比与待分离物质的配金属离子对层析剂的亲和力必须比与待分离物质的配位亲和力强才能保持待分离物质被吸附位亲和力强才能保持待分离物质被吸附螯合形成的基团一般为中性或阴离子，洗脱一般采用螯合形成的基团一般为中性或阴离子，洗脱一般采用反离子或降低反离子或降低pH。uu共价作用层析根据巯基化合物与层析剂上二硫键发生共价交换反应而实现分根据巯基化合物与层析剂上二硫键发生共价交换反应而实现分离，蛋白质中含有巯基，可进行分离。离，蛋白质中含有巯基，可进行分离。操作要点操作要点:共价层析操作分为三步：共价层析操作分为三步：（1）吸附，蛋白质的巯基与层析剂上二硫键发生共价交换反应，）吸附，蛋白质的巯基与层析剂上二硫键发生共价交换反应，被吸附在层析剂上被吸附在层析剂上（2）洗脱，用小分子巯基化合物洗脱，将层析剂上二硫键进行交洗脱，用小分子巯基化合物洗脱，将层析剂上二硫键进行交换反应，二硫键层析剂变成巯基层析剂，一部分巯基与蛋白质换反应，二硫键层析剂变成巯基层析剂，一部分巯基与蛋白质结合，实现洗脱。结合，实现洗脱。（3）再生，利用）再生，利用2，2-吡啶基二硫化合物与巯基层析剂作用，重吡啶基二硫化合物与巯基层析剂作用，重新形成二硫键层析剂新形成二硫键层析剂凝胶排阻色谱的放大凝胶排阻色谱的放大凝胶排阻色谱中，溶质与分离介质无吸附作用，属于线性平衡，在该色谱凝胶排阻色谱中，溶质与分离介质无吸附作用，属于线性平衡，在该色谱中，峰宽和塔板数主要受孔隙扩散影响。塔板数恒定，因此放大前后的色中，峰宽和塔板数主要受孔隙扩散影响。塔板数恒定，因此放大前后的色谱柱长谱柱长Lb和和Lx之间的关系如下所示：之间的关系如下所示：dp,b和和dp,x:放大前后的固定相颗粒直径，放大前后的固定相颗粒直径，vb和和vx:放大前后的空隙流速放大前后的空隙流速dcol,b和和dcol,x:放大前后的色谱柱直径，放大前后的色谱柱直径，tb和和tx:放大前后的从进样到洗脱出所有色谱峰的最大放大前后的从进样到洗脱出所有色谱峰的最大分离时间分离时间本章作业uu课后习题课后习题1 P2811 P281uu色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理并简述其原理uu何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？uu简述高效反相液相色谱的工作原理？简述高效反相液相色谱的工作原理？uu简述简述HICHIC的工作原理？的工作原理？uu简述凝胶色谱的工作原理？简述凝胶色谱的工作原理？