多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202204022中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选Vol.45,No.12Dec.2023王怡涤，庞碧寒，宋吉健，关丽君，薛云，司丽芳12，赵战勤1,2（1.河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室，河南洛阳47 10 0 3；2.河南科技大学动物科技学院/兽医生物制品工程实验室，河南洛阳47 10 0 3)摘要：为筛选产毒素多杀性巴氏杆菌(T*Pm)亚单位疫苗的优势保护性抗原，本研究根据多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)的结构和功能区将其编码基因toxA分为1个全长片段和7 个子片段(N端2 个、C端5个)，设计相应引物，分别经PCR扩增后克隆至pET-28a载体中构建各重组质粒，分别利用原核表达系统，诱导表达后经SDS-PAGE和Westernblot检测各重组蛋白的表达情况和反应原性。SDS-PAGE结果显示，正确表达了全长蛋白rPMT，N端rPMT-N1和rPMT-N2，以及C端rPMT-C3r PM T-C 7 共8 个重组蛋白；各蛋白的表达量占菌体总蛋白的6.2 9%33.74%，其中rPMT以可溶性形式表达，rPMT-C5以可溶性和包涵体两种形式表达，其他6 个重组蛋白均以包涵体形式表达。Western blot结果显示，8 个重组蛋白均具有一定的反应原性，其中PMT C端的重组蛋白rPMT-C3、rPMT-C4、r PM T-C6 和rPMT-C7的反应原性较强。因此，分别制备上述PMTC端4个重组蛋白的ISA201佐剂疫苗，分别对小鼠进行2 次免疫，并分别在小鼠首免前和二免后14d采血、分离血清，通过rPMT-ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平；分别以4个不同致死剂量(LDi)的天然PMT对各组小鼠进行腹腔攻毒，统计各重组蛋白制备的亚单位疫苗对小鼠的攻毒保护率。rPMT-ELISA结果显示，二免后各重组蛋白免疫组小鼠的几何平均抗体效价分别为1:445、1:37、1:7 3和1:2 56。攻毒试验结果显示，ISA201佐剂对照组和PBS对照组小鼠均于攻毒后2 4h内全部死亡；rPMT-C6疫苗的保护效力最强，4个攻毒剂量对小鼠的免疫保护率均为10 0%（4/4)；其次是rPMT-C7疫苗，除最高剂量(56 LDioo)攻毒组死亡1只小鼠外，其他组小鼠均全部存活；rPMT-C3和rPMT-C4疫苗的保护力较弱，在3LDio0和15LDioo攻毒剂量时对小鼠的保护率均为10 0%，在30 LDi0和56 LDi0o攻毒剂量时对小鼠的保护率分别为25%（1/4)和0。本研究经原核系统表达了PMT全长片段及7 个子片段(N端2 个、C端5个），首次证实PMTC端重组蛋白rPMT-C6和rPMT-C7具有作为亚单位疫苗保护性抗原的潜力，该结果为T+Pm亚单位疫苗的研发提供了参考依据。关键词：产毒素多杀性巴氏杆菌；toxA；多杀性巴氏杆菌毒素；表达；保护效力中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 7 9-0 8Screening of protective antigenic peptides ofPasteurella multocida toxinWANG Yi-di,PANG Bi-han,SONG Ji-jian,GUAN Li-jun,XUE Yun,SI Li-fang2,ZHAO Zhan-qin!.2*(1.Laboratory of Veterinary biologics Engineering,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Luoyang Key Laboratory of Prevention and Control Technology of Zoonotic Bacterial Infectious Diseases,Collegeof Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)*Corresponding author收稿日期：2 0 2 2-0 4-15基金项目：国家自然科学基金项目(32 0 7 2 8 99)；中牧实业股份有限公司开放科研课题(ZM20200526)作者简介：王怡涤(1997-)，女，河南禹州人，硕士研究生，主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者：E-mail：z h a o z h a n q i n 12 6.c o m1280中国预防兽医学报2023年Abstract:In order to screen the dominant protective antigens of toxin-producing Pasteurella multocida subunit vaccine,P.multocida toxin(PMT)was designed into 1 full-length fragment and 7 sub-fragments(2 N-terminal and 5 C-terminus)based onthe structure and functional region of PMT.The BL21/pET28a system was used for recombinant expression,and the expressionand reactogenicity of each recombinant protein were detected by SDS-PAGE and western blot assays.The results of SDS-PAGEshowed that a total of 8 recombinant proteins including the full-length protein toxA,N-terminals rPMT-N1 and rPMT-N2,and 5C-terminal proteins rPMT-C3-rPMT-C7 were correctly expressed.Their expression amount accounted for 6.29%-33.74%of thetotal bacterial protein,among which toxA was expressed in soluble form,rPMT-C5 was expressed in both soluble form andinclusion body,and the other six recombinant proteins were expressed in inclusion body.Western blot results showed that all eightrecombinant proteins showed a certain degree of reactogenicity,among which the recombinant proteins rPMT-C3,rPMT-C4,rPMT-C6 and rPMT-C7 at the C-terminus of PMT had strong reactogenicity.ISA 201 adjuvant vaccines of four recombinantproteins at the C-terminal of PMT were prepared respectively,and the mice were immunized twice.Blood was collected before thefirst immunization and 14 days after the second immunization and serum was separated.The antibody levels of mice in each groupwere detected by rPMT-ELISA.Mice were intraperitoneally challenged with four different lethal doses(LDoo)of natural PMT,andthe challenge protection rate of each group was calculated.The results of rPMT-ELISA showed that the geometric average antibodytiters of mice in the recombinant protein immunization group after the second immunization were 1:445,1:37,1:73 and 1:256,respectively.The results of challenge test showed that all mice in the ISA201 adjuvant control group and PBS control group diedwithin 24 hours after challenge;the rPMT-C6 vaccine had the strongest protective efficacy,with a protection rate of 100%(4/4)atthe four challenge doses;followed by the rPMT-C7 vaccine,which protected all the mice except for one in the challenge groupwith the highest dose(56LDioo).The protection of rPMT-C3 and rPMT-C4 vaccines was weak,with 100%protection at both 3LDio0and 15LDioo challenged doses,and 1/4 and 0 protection rates at 30LDioo and 56LDioo challenged doses,respectively.This studyrecombinantly expressed and purified the PMT full-length fragment and 7 sub-fragments(2 N-terminal fragments,5 C-terminalfragments),and confirmed for the first time that the PMT C-terminal recombinant proteins rPMT-C6 and rPMT-C7 have thepotential to serve as subunit vaccine protective antigens,thus providing a reference for the development of subunit vaccines againsttoxin-producing Pasteurella multocida.Key words:toxigenic Pasteurella multocida;toxA;Pasteurella multocida toxin;expression;protective efficacy产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurellamultocida，T+Pm)与其他巴氏杆菌的主要区别是其能产生一种不耐热的皮肤坏死毒素，称为多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PM T)。产毒素多杀性巴氏杆菌主要感染猪和反动物1-3，偶尔也感染兔、犬、家禽和人类4。在猪群中，产毒素多杀性巴氏杆菌的感染能导致猪发生进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PA R)，该病以鼻甲骨萎缩、鼻梁变形和生长迟缓为主要特征。PMT是PAR发生过程中产生的必要毒力因子，单独接种天然或重组的PMT就能复制出PAR的典型临床症状和病理变化5。因此，PMT被认为是一种有意义的亚单位疫苗抗原因子6 。但是，天然PMT仅占菌体总蛋白的0.6%左右，产量很低且难于纯化和灭活7 。因此，通过截短毒素抗原基因制备重组PMT是研制产毒素多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效途径。PMT属于细菌A-B毒素家族中的皮肤坏死毒素18 ,由噬菌体toxA基因编码，该基因38 55bp，编码12 8 5个氨基酸，蛋白分子量为146 ku。PM T 的N端(aalaa505)为细胞受体结合区域，与同家族大肠杆菌的细胞毒性坏死因子CNF1(Cytotoxic necrotizing factor 1)和CNF2具有一定的同源性6.9。PMT的C端(aa506aal285)包含C1、C2 和C33个结构域。C1结构域(aa575a a 7 2 0)的作用是通过与脂质体结合定位于细胞膜上；C2结构域(aa720a a l10 5)由2 个或折叠子域组成，其具体功能尚不清楚；C3结构域(aal 106a a l 2 8 5)是PMT的催化活性区域，可以激活钙信号通路和有丝分裂信号通路，从而发挥生物毒性作用10 。本研究以产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株的基因组DNA为模板，对toxA基因的不同片段进行克隆表达，并通过western blot鉴定其反应原性，将其制备为亚单位疫苗，并对小鼠进行免疫攻毒试验，为PMT保护性抗原片段的筛选以及亚单位疫苗的研发奠定基础。第12 期王怡涤，等.多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选12811材料与方法1.1主要实验材料96 只56 周龄SPF级雌性KM小鼠购自河南省实验动物中心。产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株、大肠杆菌DH5、BL2 1感受态细胞、pET-28a载体等，均由河南科技大学兽医生物制品工程实验室保存。猪PMT抗血清由本实验室通过将产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株感染猪后制备。TSA、TSB培养基购自美国BD公司；LB(胰蛋白陈、酵母粉)培养基购自OXOID公司；PrimeSTAR?Max高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自生工生物工程基因名称(nt)Gene name(nt)toxA(1-3855)toxA-N1(1-750)toxA-N2(1-1218)toxA-C3(1372-2958)toxA-C4(2194-3855)toxA-C5(1372-3855)toxA-C6(2956-3855)toxA-C7(2509-3837)toxA-N(aal-aa505)NtoxA-N1(aal-aa750)RtoxA-N2(aal-aa1218)R2F3toxA-C5(aa1372-aa3855)toxA(aal-a3855)图1toxA分段克隆策略Fig.1The strategy of toxA segmented cloning1.3重重组表达载体的构建及鉴定利用DNA凝胶回收试剂盒回收各PCR产物，经双酶切(酶切位点参考表1)后分别克隆至pET-28a表达载体中，构建8 个(上海)股份有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(IgG-HRP)购自Proteintech公司。1.2引物的设计合成及toxA基因的PCR扩增参考GenBank中登录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因(CP003313.1)，利用生物学软件TMHMM2.0预测PMT信号肽和跨膜区(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)后采用Primer5.0设计8 对引物(表1)。提取产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6株的基因组DNA为模板，采用各引物和高保真DNA作聚合酶分别经PCR扩增toxA基因全长片段和7 个子片段(图1)，对扩增产物采用凝胶电泳检测后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。表1本研究中所用引物Table 1The PCR primers used in this study引物序列(5-3)产物/bpPrimer sequence(5-3)ProductsF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACA3855R4:CTGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACAR1:GCAAGCTTGTATCCATAGATATCTAGF1:GCGGATCCATGAAAACAAAACAR2:GCAAGCTTTGCTGGTACTAACATATCF3:GTGGATCCATTTCGGAAACCGCAGAAR3:ATGTCGACCAGAAGCTTTCTGAAAGCF4:GTGGATCCGGTGCGATTCCAGAGGCAR4:CTGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCF3:GTGGATCCATTTCGGAAACCGCAGAAR5:ATGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCGAGF5:GTGGATCCCTGCAATCAGCAAAAGAR5:ATGAGCTCTTATAGTGCTCTTGTTAAGCGAGF6:CGGGATCCGAAGTACAAGGTGATTTAGGR6:CCGCTCGAGTTAAGGCTTTGTGAAAAGAGGAGGtoxA(1285aa 3855bp)aa406-aa457transinembraneF3酶切位点Restriction siteBamH ISac I750BamH IHind II1218BamH IHind III1587BamH ISac I1662BamH ISacI2484BamH ISacI900BamH ISacI1329BamH IXho I重组表达质粒，命名为pET28a-toxA、p ET 2 8 a-N1toxA-C(aa506-aa1285)pET28a-N2和pET28a-C3p ET 2 8 a-C7。将上述重组质粒均经PCR和双酶切鉴定后由上海生工生物工程技术服务有限公司郑州分公司测序。toxA-C3(aa1372-aa2958)R3F4toxA-C4(aa2194a3855)toxA-c7(aa2509-a3837)F6退火温度/Annealingtemperature4752525760575757.R4FsloxA-C6(a2956-a3855)R5R6R4/R5R41.4各重组蛋白的表达及纯化将重组质粒pET28a-toxA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，37、180 r/min振荡培养至对数生长期(ODomm=0.61.0),加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37 诱导培养7 h。离心收集菌体，超声破碎后离心分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE检测后采用His6标签蛋白纯化试剂盒纯化，并使用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定各蛋白的浓度，经条带灰度分析评估各蛋白的表达量和纯度。将纯化蛋白命名为rPMT。按同样的方法，1282中国预防兽医学报2023年将另外7 种重组质粒pET28a-N1p ET 2 8 a-N2 和pET28a-C3pET28a-C7分别转化BL21感受态细胞后诱导表达和纯化，并经SDS-PAGE检测7 种重组蛋白后分别命名为rPMT-N1 r PM T-N2 和 rPMT-C3 rPMT-C7。采用BCA法测定各重组蛋白的浓度。1.5各重组蛋白的westernblot鉴定将未纯化的8个重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转膜至硝酸纤维素膜，以产毒素多杀性巴氏杆菌感染阳性猪血清(1:1000)为一抗，羊抗猪IgG-HRP(1:5 000)为二抗，进行western blot鉴定，并采用Bio-Rad Quantity One软件检测并判定其反应强度。1.6小鼠免疫及攻毒保护试验根据1.5的westermblot鉴定结果，选择反应原性相对较强的4个重组蛋白，按照佐剂说明书分别制备ISA201佐剂疫苗，疫苗中各蛋白含量均为2 50 g/mL。将96 只56 周龄SPF级雌性KM小鼠随机均分为6 个大组，每个大组均分为4个小组，第14大组分别经小鼠皮下注射制备的4个重组蛋白疫苗(0.2 mL/只），第56 大组分别经相同方式注射ISA201佐剂和无菌PBS作为对照组。21 d后采用相同的方法二免。一免前(0)和二免后14d,从各大组中取5只小鼠经尾根静脉采血分离血清，以纯化的重组蛋白rPMT为包被抗原(10 0 ng/孔)，通过间接ELISA方法 测定其抗体效价。于二免后14d，对各大组中的两个小组小鼠分别经腹腔注射0.2 mL含3LDi00、15LD i o o 的天然PMT12；于二免后16 d和18d，分别对各大组中另外两个小组小鼠均经腹腔注射0.2 mL含30 LDi0056LDi的天然PMT；攻毒后观察并记录小鼠的发病和死亡情况，实验期为2 1d，计算各组小鼠保护率。1.7数据统计分析通过SPSS20.0软件对试验数据统计学分析，采用Duncan氏法多重比较各组之间的差异性；采用t-检验(Students t test)和单因素方差分析(One-wayANOVA)，比较各免疫组免疫前和二免后抗体水平的差异性(P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著)。2 结 果2.1toxA基因及其分段的PCR扩增结果PCR扩增结果显示，toxA基因各片段均与预期大小一致，测序结果显示，N端2 个基因片段toxA-N1和toxA-N2分别为7 50 bp和12 18 bp，C端5个基因片段toxA-C3t o x A-C7分别为158 7 bp、16 6 2 b p、2 48 4 b p、90 0 b p 和1329bp，t o x A 基因全长38 55bp，各基因序列均与参考序列一致(图2)。表明获得了各目的蛋白的基因。MN1 N2 C3 C4 C5C6C7 toxA5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp800bp500bp300bpM:DL5000 DNA Marker;N1-N2:PCR amplification of toxA-N1,toxA-N2;C3-C7:toxA-C3-toxA-C7;toxA:toxA图2 toxA及其分段基因的PCR扩增结果Fig.2 Amplification of toxA and its antigen fragments by PCR2.2重组表达载体的鉴定结果构建的8 个重组质粒pET28a-N1p ET 2 8 a-N2、p ET 2 8 a-C3p ET 2 8 a-C7和pET28a-toxA经菌落PCR和双酶切鉴定，结果显示均能获得预期大小的DNA片段(图略)。测序结果显示，8 个重组质粒插入的基因片段均与GenBank登录的相应toxA基因序列CP003313.1、EF441531.1、X57775.1的同源性均为10 0%，与其他toxA基因序列的同源性均在99.6 3%以上，表明重组质粒均正确构建，且该基因高度保守。2.3重组蛋白的表达、纯化SDS-PAGE检测结果SDS-PAGE检测结果显示，重组质粒pET28a-N1pET28a-N2、p ET 2 8 a-C3p ET 2 8 a-C7 和 pET28a-toxA转化BL21感受态细胞并经IPTG诱导后各重组蛋白均获得了表达，各蛋白表达量占菌体总蛋白的6.2 9%33.7 4%，其中重组全长toxA蛋白以可溶性形式表达，rPMT-C5以可溶性和包涵体两种形式表达，其他6 个重组蛋白均以包涵体形式表达(图3)。经纯化后8 个重组蛋白的纯度介于34.13%9 4.6 7%，浓度为0.41mg/mL2.99m g/m L(图4、表2)。在亚单位疫苗中抗原蛋白的含量是影响疫苗保护效力和经济效益的关键因素12 。本研究中PMT7个子片段重组蛋白的表达量均达到了菌体总蛋白的16.44%及以上(16.44%33.7 4%)，表明各重组蛋白均能够满足后期亚单位疫苗的制备及生产的需要。2.4各重组蛋白的western blot鉴定结果利用western blot检测各重组蛋白的反应原性，结果显示，8个重组蛋白均可与产毒素多杀性巴氏杆菌阳性猪第12 期王怡涤，等.多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选1283血清特异性结合(图5)，表明这8 个重组蛋白均具有一定的反应原性。经分析确定rPMT-C6、r PM T-N1的反应原性最强，其次依次是rPMT-C4、r PM T-N2、rPMT-C3、r PM T-C7，而rPMT-C5和rPMT的反应原性MN1UN1IN1SNIL28aC5UC5I130ku100ku70ku50ku35ku25ku20ku15kC61C6S130ku100ku70ku50ku35ku25ku20ku15kuM：蛋白Marker；2 8 a：经IPTG诱导的pET28a/BL21菌液；NIU：未经IPTG诱导的pET28a-N1/BL21菌液；N1I：经IPTG诱导的pET28a-N1/BL21的菌液；N1S：经IPTG诱导并超声破碎后pET28a-N1/BL21菌液上清；NIL：经IPTG诱导并超声破碎后的pET28a-N1/BL21M:Protein Marker;28a:Whole-cell lysate of pET28a/BL21 induced by IPTG;N1U:Whole-cell lysate of pET28a-N1/BL21 without IPTG;N1S:Supernatant of pET28a-N1/BL21 induced by IPTG after ultrasonic disruption;N1L:Lysate of pET28a-N1/BL21 induced by IPTG afterN1M N1C6C7C3ioku130ku70ku50ku35ku25ku20ku15kuM:蛋白质Marker；N1N2：r PM T-N1r PM T-N2;C3C7:rPMT-C3rPMT-C7M:Protein Marker;N1-N2:rPMT-N1-rPMT-N2;C3-C7:rPMT-C3-rPMT-C7图4各重组蛋白纯化的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein purification最弱(表2)。本实验在同一试验条件下比较了8 个重组蛋白反应原性的强弱顺序，解决了PMT相关研究中各抗原区域片段之间缺乏系统比较的问题，具有重要的指导意义和参考价值。C5SC5LC6LM28aC7U菌体裂解物；其余同pET28a-N1/BL21。箭头指向目的蛋白表达的位置N1I:Whole-cell lysate of pET28a-N1/BL21 induced by IPTG;ultrasonic disruption;The rest is the same as pET28a-N1/BL21.The arrows point to the recombinant protein图3各重组蛋白表达的SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expressed recombinant proteinM toxAC5C4C3C4C7N2C5toxAC3LC3SC71C7SC3IC7LPMTLPMTSPMTIPMTU130ku100ku70ku50ku35kuM:蛋白Marker；N1N2:r PM T-Nl、r PM T-N2;C3C 7：r PM T-C 3r PM T-C 7；箭头指示为目的条带M:Protein Marker;N1-N2:rPMT-N1,rPMT-N2;C3-C7:rPMT-C3-rPMT-C7,The arrows point to the recombinant protein图5各重组蛋白反应原性的westernblot鉴定结果Fig.5Western blot analysis of the recombinant proteinsC3U28aN2LN2SN2IN2UC4LC4SC7C41N2C6C4U28a1284中国预防兽医学报2023年表2 各重组蛋白的表达及鉴定结果Table 2 Protein expression and identification results重组蛋白名称片段长度/bpRecombinantPredicted molecular Actual molecular ExpressionAmplicon size/bpprotein namerPMT-N1TPMT-N2rPMT-C3rPMT-C4rPMT-C5rPMT-C6rPMT-C7toxA注：“1”表示该重组蛋白以包涵体形式表达的表达量与以可溶性蛋白形式表达量的比例。“2”表示重组蛋白与猪阳性血清的特异性结合强度，“+”、“+、“+”分别表示反应原性为强、中、弱。Note:1:The expression ratio represents the ratio of the expression of the recombinant proteins in the form of inclusion body to the soluble protein.2:Reactogenicity represents the specific binding strength of recombinant protein to antiserum;+,+and+,indicated that thereactogenicity of the recombinant protein was strong,moderate and weak,respectively2.5免疫小鼠抗体水平的间接ELISA检测2.4结果，选择PMTC端的重组蛋白rPMT-C3、rPMT-C4、r PM T-C6 和rPMT-C7分别制备亚单位疫苗，对小鼠免疫后分别于一免前及二免后14d通过间接ELISA方法测定各组小鼠的血清抗体水平。结果显示，二免后各重组蛋白免疫组小鼠抗体水平均明显升高，几何平均抗体效价分别为1:445、1:37、1:73和1:2 56。其中rPMT-C3蛋白免疫组小鼠的抗体效价最高，其次是rPMT-C7组和rPMT-C6组，rPMT-C4组小鼠抗体水平最低；各免疫组之间的抗体效价均差异显著(P0.05)，且rPMT-C3组和rPMT-C7组小鼠抗体水平均极显著高于rPMT-C6组和rPMT-C4组(P0.01)。ISA 2 0 1佐剂对照组和PBS空白对照组的抗体水平均为阴性(表3)。表明这4种重组蛋白均可诱导小鼠产生针对PMT的较强的体液免疫反应，但其诱导能力存在明显差异。表3各组小鼠血清IgG抗体水平的ELISA检测结果Table 3 Results of ELISA detection of IgG antibody levelinmouse serumsamples重组蛋白小鼠血清抗体效价分组RecombinantGroupprotein1rPMT-C32rPMT-C43rPMT-C64rPMT-C75ISA2016PBS2.6小鼠攻毒保护试验结果使用不同致死剂量(LDio)的天然PMT进行腹腔攻毒。结果显示，PBS和ISA201佐剂对照组小鼠精神萎靡、预测分子量/ku实际分子量/ku表达量weight/kuweight/ku75034.5121852.6158765.6166266.0248497.090036.0132953.33855150.0Antibody titer of mouse serum121:5121:5121:1281:5121:10241:4451:321:16 1:321:1281:321:641:1281:1281:321:641:2561:2561:2561:2561:25611各组小鼠免疫后分别表达形式比例(%)Expression ratio(%)Protein purity(%)Reactogenicity?quantity34.017.74%52.018.42%70.027.04%64.024.09%97.016.44%36.033.74%53.020.65%150.06.29%根据食欲废绝、双眼蒙蔽、运动减少，对外界刺激无明显反应等；不同剂量天然PMT攻毒后小鼠均在2 4h内全部死亡。使用3LDio剂量的天然PMT攻毒后，4个重组蛋白疫苗组均能对免疫小鼠提供完全保护(4/4)；15 LD i o 剂量攻毒后，除rPMT-C4能够为免疫小鼠提供3/4的免疫保护率外，其他3个重组蛋白也均能为免疫小鼠提供完全保护(4/4)；当攻毒剂量增至30 LD1o0时，rPMT-C6和rPMT-C7仍能为免疫小鼠提供完全保护(4/4)，而rPMT-C3和rPMT-C4对免疫小鼠的保护率均为1/4；当攻毒剂量增至56 LDioo时，rPMT-C6仍能为免疫小鼠提供完全保护(4/4)，rPMT-C7对免疫小鼠的保护率为3/4，而rPMT-C3和rPMT-C4对免疫小鼠的保护率均为0（表4)。表明重组蛋白rPMT-C6和rPMT-C7对免疫小鼠具有较强的免疫保护效力，有望作为产毒素多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗候选蛋白。表44个重组蛋白对小鼠免疫保护试验结果Table 4 Immunological protection of four subunitvaccines in mice几何平均不同剂量 PMT 攻毒后对小鼠的抗体效价疫苗种类免疫剂量抗原含量341蛋白纯度(%)100:086.29%100:082.45%100:087.21%100:089.22%47:5334.13%100:094.67%100:085.72%0:10084.22%保护率5GMT1:371:731:256反应原性?+Types ofImmunizingvacinedoseTPMT-C30.2mLrPMT-C40.2mLrPMT-C60.2mLrPMT-C70.2mL250ug/mLISA2010.2mLPBS0.2mL注：攻毒后2 1d观察期内，小鼠存活即判定为保护。Note:During the 21-day observation period after challenge,the survivalof mice was judged as protection.AntigenProtective rates at different challengecontent3LD10015LDi0030LD10056LD100250g/mL4/4250g/mL4/4250g/mL4/44/40/40/4doses with PMT4/41/43/41/44/44/44/44/40/40/40/40/40/40/44/43/40/40/4第12 期王怡涤，等.多杀性巴氏杆菌毒素中保护性抗原肽的筛选12853 讨 论目前，有关