蛋白质组学(ppt文档).ppt

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白质组学Proteomics医学分子生物学医学分子生物学 第三章第三章5/25/20241Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 主要内容主要内容l前言与背景前言与背景l第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展l第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法l第三节第三节 蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质组功能模式的研究方法l第四节第四节 蛋白质组学的应用蛋白质组学的应用5/25/20242Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsl蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者动的实际执行者 l几乎所有的生物催化剂几乎所有的生物催化剂-酶，都是蛋白质。构成细胞酶，都是蛋白质。构成细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分也是由蛋白质组成也是由蛋白质组成l蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构再折叠形成一定空间结构前言与背景前言与背景5/25/20243Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 前言与背景前言与背景Solution:从从genome到到proteome:遗传信息从基因遗传信息从基因 mRNA蛋白质，三位一体，构成了遗传信息的流程图蛋白质，三位一体，构成了遗传信息的流程图Topic:基因数量有限性和基因结构的相对稳定性基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 VS 生命生命现象的复杂性和多变性现象的复杂性和多变性 Hotspot:对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务要和重要任务5/25/20244Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsThe era of omics-based science（组学时代组学时代）Genomics（基因组学基因组学）Post-genomic science（后基因组时代后基因组时代）Functional genomics（功能基因组学功能基因组学）Transcriptomics（转录组学转录组学）Proteomics （蛋白质组学蛋白质组学）metabonomicsmetabolomics（代谢组学代谢组学）Structural genomics（结构基因组学结构基因组学）Aim-3D structures of all protein folds!前言与背景前言与背景5/25/20245Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展 l蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组和蛋白质组学的概念l蛋白质组与基因组和功能基因组的关系蛋白质组与基因组和功能基因组的关系l蛋白质组学发展进展蛋白质组学发展进展5/25/20246Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白质组（蛋白质组（proteome）：）：PROTEins+genOME，意思是，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋（基因组表达的所有蛋白质）白质）1994年由澳大利亚科学家年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念，提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质 蛋白质组（原核生物和真核生物）蛋白质组（原核生物和真核生物）第一节 蛋白质组学的概念及发展进展一、一、蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组和蛋白质组学的概念l对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个 或几个蛋白质或几个蛋白质l同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化着的整体在空间和时间上动态变化着的整体l整体性、动态性和系统性整体性、动态性和系统性5/25/20247Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白质组学蛋白质组学(proteomics):指应用各种技术手段来研究蛋白指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律规律.l表达蛋白组学表达蛋白组学：Thestudyofglobalchangesinproteinexpressionl蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式：Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes第一节 蛋白质组学的概念及发展进展一、一、蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组学包括蛋白质组学包括:5/25/20248Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展二、蛋白质组与基因组和功能基因组的关系二、蛋白质组与基因组和功能基因组的关系lThe study of proteins expressed by genomeslCompletion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genomelOnly 2-5%of proteins in human genome have been identified5/25/20249Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展三、三、蛋白质组学发展进展蛋白质组学发展进展l各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：l1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）l美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCI）投资）投资1 000万美元建立肺、直万美元建立肺、直 肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。lNCI和和FDA（美国食品药品管理局）共同投资数百万美元建（美国食品药品管理局）共同投资数百万美元建 立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。5/25/202410Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展三、三、蛋白质组学发展进展蛋白质组学发展进展l英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因 组测序的生物体进行蛋白质组研究。组测序的生物体进行蛋白质组研究。lCelera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人 类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的 蛋白质表达数据库的工作。蛋白质表达数据库的工作。l1997年召开了第一次国际年召开了第一次国际“蛋白质组学蛋白质组学”会议会议l1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 l1999年年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议5/25/202411Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展三、三、蛋白质组学发展进展蛋白质组学发展进展l我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会 l2003成立了中国人类蛋白质组组织（成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别），并分别于于2003年年9月、月、2004年年8月以及月以及2005年年8月召开了中国蛋白质月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年年10月在中国北月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。京召开了第三届国际蛋白质组学会议。5/25/202412Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重列为重点项目。点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。的进展。北京师范大学、中国协和医科大学、上海交通大学等八家院校和科北京师范大学、中国协和医科大学、上海交通大学等八家院校和科研机构对外宣布，成立研机构对外宣布，成立“高等学校蛋白质组学研究院高等学校蛋白质组学研究院”，成为我国，成为我国向生命科学最前沿领域的蛋白质组学的研究迈出标志性的一步，为向生命科学最前沿领域的蛋白质组学的研究迈出标志性的一步，为疾病早期诊断、药物精确筛选、发现疾病相关蛋白等有关课题提供疾病早期诊断、药物精确筛选、发现疾病相关蛋白等有关课题提供突破性的解决方案，具有巨大的经济和社会效益。突破性的解决方案，具有巨大的经济和社会效益。2008年年6月，引进大院名校项目：温州医学院高等学校蛋白质月，引进大院名校项目：温州医学院高等学校蛋白质组学研究院联合实验室成立组学研究院联合实验室成立第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展三、三、蛋白质组学发展进展蛋白质组学发展进展5/25/202413Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics研研 究究 意意 义义DNA RNA 蛋白质蛋白质存在存在3个层次的调控个层次的调控转录水平调控转录水平调控翻译水平调控翻译水平调控翻译后水平调控翻译后水平调控蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的行蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性的真实体现。性的真实体现。5/25/202414Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白质组的研究的机遇和挑战蛋白质组的研究的机遇和挑战机遇：基因组计划的快速进行，大量基因序列和机遇：基因组计划的快速进行，大量基因序列和EST的确定的确定为蛋白质的快速鉴定提供了良好的基础。为蛋白质的快速鉴定提供了良好的基础。挑战：从单一蛋白质的研究转变到细胞和组织的整体蛋白质挑战：从单一蛋白质的研究转变到细胞和组织的整体蛋白质研究，在理论和技术上提出了挑战。研究，在理论和技术上提出了挑战。5/25/202415Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第二节第二节蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法l蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备l蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离l常见蛋白质显色技术常见蛋白质显色技术 l凝胶的图像处理分析和胶内酶切凝胶的图像处理分析和胶内酶切l质谱分析质谱分析l蛋白质序列测定蛋白质序列测定5/25/202416Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsWestern blot、免疫组化验证蛋白质并确定其定位根据氨基酸序列合成寡核苷酸探针，克隆基因蛋白质功能研究，包括蛋白质生物活性、抗体制备、蛋白质相互作用等方面蛋白质样品电泳前蛋白质样品的处理双向电泳分离 Western blot检测选择目标蛋白斑点，胶内酶切质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）获得肽质量指纹谱或肽序列标签数据库检索鉴定蛋白质电转印到膜上 图像分析 样品处理蛋白质分离蛋白质鉴定 蛋蛋白白质质组组学学研研究究流流程程图图第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202417Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和图像扫描和初步分析初步分析感兴趣蛋白感兴趣蛋白点的切取点的切取质谱的多肽质谱的多肽指纹图、微指纹图、微测序分析测序分析质谱结果的质谱结果的生物信息学生物信息学分析和比对分析和比对新新蛋白质蛋白质的发现的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证5/25/202418Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法一一、蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备l通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。分析。l可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。分成不同部分，分别进行研究。l样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度检测灵敏度5/25/202419Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法l蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等l蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等l蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体、蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体、细胞核、细胞骨架等，用于蛋白质组研究细胞核、细胞骨架等，用于蛋白质组研究 样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。量和检测灵敏度。一一、蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备5/25/202420Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法一一、蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备 蛋白质溶解性蛋白质溶解性-分部提取法分部提取法 用不同的蛋白质提取液分部抽提细胞或组织裂解液，先用不同的蛋白质提取液分部抽提细胞或组织裂解液，先用水溶液抽提，离心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用水溶液抽提，离心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用对膜蛋白具有中等溶解度的提取液抽提沉淀，离心后上清用对膜蛋白具有中等溶解度的提取液抽提沉淀，离心后上清液中含中等疏水性的蛋白质，包括膜表面蛋白和膜相关蛋白；液中含中等疏水性的蛋白质，包括膜表面蛋白和膜相关蛋白；最后用强溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性强的蛋白质。最后用强溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性强的蛋白质。5/25/202421Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsConventional urea,CHAPS,DTTImproved urea,thiourea,CHAPS,SB 3-10,TBP100 g of E.coli protein 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202422Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法组织水平上的蛋白质组样品制备组织水平上的蛋白质组样品制备l临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂l激光捕获显微切割激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM)：1996年年基因公司发明能从临床病理切片标本中切下病变细胞，获得纯净的细胞基因公司发明能从临床病理切片标本中切下病变细胞，获得纯净的细胞群。可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群群。可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群一一、蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备5/25/202423Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5/25/202424Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5/25/202425Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5/25/202426Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法二二、蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。各种蛋白质的方法。5/25/202427Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等电聚焦第一向：等电聚焦5/25/202428Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics+pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：第二向：SDS-PAGE电泳电泳Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distance5/25/202429Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics双向电泳的流程双向电泳的流程双向电泳的流程主要包括：双向电泳的流程主要包括：l样品制备样品制备l第一向等电聚焦第一向等电聚焦l第二向第二向SDS-PAGEl凝胶上蛋白的检测凝胶上蛋白的检测l蛋白的软件的检测蛋白的软件的检测第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法二二、蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离5/25/202430Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法双向电泳特点双向电泳特点l可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质l高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率l便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 l与质谱分析匹配与质谱分析匹配 2-DE技术的缺点技术的缺点l极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白白质质，极极大大蛋蛋白白质质、极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰丰度度蛋蛋白白质质用用此此种种技技术术难难于于有有效效分分离。离。l胶胶内内酶酶解解过过程程费费时时、费费力力，难难于于与与质质谱谱联联用用实实现现自自动动化。化。二二、蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离5/25/202431Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法新型非凝胶技术新型非凝胶技术l液相色谱法液相色谱法liquid chromatography，LCl毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CE二二、蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离5/25/202432Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法二二、蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分的分离，然后进入离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。多维色谱技术（多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）根据蛋白质带电性及疏水性不同，用根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。分离多肽复合物。5/25/202433Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三三、常见蛋白质显色技术常见蛋白质显色技术 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 蛋白质样品经蛋白质样品经2DE分离后，凝胶分离后，凝胶上的蛋白质斑点须上的蛋白质斑点须用一定的方法使其用一定的方法使其显现出来显现出来5/25/202434Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三三、常见蛋白质显色技术常见蛋白质显色技术 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色方法。考马斯考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色方法。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后亮蓝染色的最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定，但不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样续的质谱鉴定，但不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样品用量大。品用量大。5/25/202435Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 三三、常见蛋白质显色技术常见蛋白质显色技术 银染色银染色 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法的的100倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。5/25/202436Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 三三、常见蛋白质显色技术常见蛋白质显色技术 荧光染料染色荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。其染色方法操作简便，灵敏度高达荧光来检测蛋白质。其染色方法操作简便，灵敏度高达110ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定，是一种较理想的蛋白质染色方法，不影响后续的质谱鉴定，是一种较理想的蛋白质染色方法，但价格较昂贵。但价格较昂贵。5/25/202437Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法考染和银染的比较考染和银染的比较5/25/202438Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202439Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202440Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics四四、凝胶的图像处理分析和胶内酶切凝胶的图像处理分析和胶内酶切 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法l凝胶图像的扫描：凝胶图像的扫描：l图像加工：图像加工：l斑点检测和定量：斑点检测和定量：l凝胶配比：凝胶配比：l数据分析：数据分析：l数据呈递和解释：数据呈递和解释：l2-DE数据库的建立数据库的建立：5/25/202441Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5/25/202442Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsl目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析:MelanieII(BioRad),PD Quest(BioRad),Phoretix 2D Full,(Amersham Pharmacia Biotech)ImageMaster 2d Platinuml这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法四四、凝胶的图像处理分析和胶内酶切凝胶的图像处理分析和胶内酶切5/25/202443Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5/25/202444Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics正常肝细胞正常肝细胞和肝癌细胞和肝癌细胞的蛋白质组的蛋白质组双向电泳差双向电泳差异表达谱异表达谱圆点标记圆点标记的点为两的点为两者的差异者的差异蛋白蛋白数字号码数字号码为蛋白质为蛋白质点在参考点在参考胶中的索胶中的索引号引号5/25/202445Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白质的胶内酶切蛋白质的胶内酶切 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程内蛋白质的酶切等过程5/25/202446Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics五五、质谱分析质谱分析（mass spectrometry,MS）第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的）的差异来分离并确定分子量差异来分离并确定分子量定性定性定量定量质谱质谱m/z离子化离子化5/25/202447Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法基本原理基本原理五五、质谱分析质谱分析质谱分析法（质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分子电离）是指在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后通过测定这些离子的质荷比（成离子，然后通过测定这些离子的质荷比（m/z）和强度来）和强度来进行定性和定量的一种分析方法进行定性和定量的一种分析方法质谱分析法的过程为：将样品气化并电离成带电离子，然质谱分析法的过程为：将样品气化并电离成带电离子，然后通过一定方法将不同后通过一定方法将不同m/z的离子分开，并测定其强度，绘的离子分开，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定量方面的信息量方面的信息 5/25/202448Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2020世纪初世纪初世纪初世纪初2020世纪世纪世纪世纪4040年代年代年代年代2020世纪世纪世纪世纪6060年代年代年代年代2020世纪世纪世纪世纪8080年代年代年代年代J.J.Thomson制成第一台质谱仪制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析主要是用来进行同位素测定和无机元素分析开始用于有机物分析开始用于有机物分析出现了气相色谱出现了气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪成为有机物分析的重要仪器成为有机物分析的重要仪器质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪感应耦合等离子体质谱仪质谱技术发展过程质谱技术发展过程 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法五五、质谱分析质谱分析5/25/202449Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsJoseph John Thomson-1906年诺贝尔物理奖年诺贝尔物理奖主要贡献：气态下离子导电的理论和实验探索Frederick Soddy-1921年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使我们对放射活性物质的认识大大提高，另外他对同位素的起源和性质也作了出色工作。Francis William Aston-1922年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱方法大规模的研究非放射性元素的同位素；提出整数规则。Hans G.Dehmelt and Wolfgang Paul-1989年同获诺贝尔物理奖年同获诺贝尔物理奖主要贡献：开发了离子阱质谱技术。Robert F.Curl Jr.and Sir Harold W.Kroto&Richard E.Smalley-1996年分享诺贝尔化学奖年分享诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱发现富洛伦尼斯（C60-C80，足球烯）John Fenn and Koichi Tanaka and Kurt Wuthrich-2002年分享诺贝年分享诺贝尔化学奖尔化学奖主要贡献：发展了可用于分析生物大分子的软电离方法。质质谱谱相相关关工工作作的的成成就就 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202450Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 完整的现代质谱仪由完整的现代质谱仪由进样系统进样系统、离子源离子源、质量分析器质量分析器、离子检测离子检测器器、数据处理数据处理及及控制系统控制系统五部分组成，此外还有一个保持质谱仪高真五部分组成，此外还有一个保持质谱仪高真空度的真空系统。空度的真空系统。离子源和质量分析器离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件，是质谱仪最重要的两个部件，也是不同质谱仪的主要差别所在。也是不同质谱仪的主要差别所在。电喷雾质谱（电喷雾质谱（ESI）和和基质辅助激基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（光解吸电离飞行时间质谱（MALDI）为离子源的质谱技术已广泛应用为离子源的质谱技术已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具，因此于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具，因此被称为生物质谱（被称为生物质谱（BMS）进样进样系统系统离子源离子源质量质量分析器分析器检测器检测器数据采集数据采集及分析及分析真空系统真空系统质谱仪模块组成质谱仪模块组成 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法5/25/202451Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics真空系统真空系统 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法l质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。的准分子离子，从而得到分子量。l由机械真空泵由机械真空泵(前极低真空泵前极低真空泵)，扩散泵或分子泵，扩散泵或分子泵(高真空高真空泵泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。l只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。真空度不够则灵敏度低。5/25/202452Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsl在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。l气体可通过储气器进入离子源。