SN∕T 5388-2021 烟草线条病毒检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 82 0 2 1 烟草线条病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f T o b a c c o s t r e a k v i r u s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准烟草线条病毒检疫鉴定方法S N/T 5 3 8 82 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址 www.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 9千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 8 3 定价1 6.0 0元前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福州市金山公园管理处、中华人民共和国哈尔滨海关、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国厦门海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:沈建国、刘向国、邓真、刘洪义、李为民、廖富荣、李敏、张永江、陈细红、陈寿铃。S N/T5 3 8 82 0 2 1烟草线条病毒检疫鉴定方法1 范围 本文件规定了烟草线条病毒的检疫鉴定方法。本文件适用于可能携带烟草线条病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 烟草线条病毒基本信息 中文名:烟草线条病毒 学名:T o b a c c o s t r e a k v i r u s;T S V。分类地位:雀麦花叶病毒科(B r o m o v i r i d a e)、等轴不稳环斑病毒属(I l a r v i r u s)成员。烟草线条病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。5 原理 烟草线条病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。6 仪器设备、用具及试剂6.1 仪器设备 p H计、酶标仪、高速冷冻离心机、电子天平、P C R仪、荧光P C R仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、常规冰箱、超低温冰箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、研磨仪等。6.2 用具 各种量程的可调移液器(1 0 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 L、2 0 L、1 0 L、2 L)、P C R反应管、无R N a s e离心管(1.5 m L)、研钵、酶联板等。1S N/T5 3 8 82 0 2 16.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中相关规定。双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)试剂按照附录B执行、R T-P C R试剂按照附录C执行、实时荧光R T-P C R试剂按照附录D执行。7 检测与鉴定7.1 抽样检查 按照S N/T 2 1 2 2给出的方法进行抽样、取样,并检查植株是否有矮化、畸形,叶片花叶、斑驳等疑似病毒危害症状。7.2 样品制备7.2.1 种子类样品 选取外观畸形或不成熟的种子,单独挑选出来作为一个样品进行检测;若种子无明显异常,则随机称取1 g 3 g种子,按11 0(质量体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨,4 下1 0 0 0 0 g离心1 0 m i n,上清即为样品提取液,用于D A S-E L I S A、R T-P C R和实时荧光R T-P C R检测;或称取0.1 g样品提取核酸后用于R T-P C R、实时荧光R T-P C R检测。7.2.2 植株类样品 植株类样品分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样;无症状植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5 g1.0 g样品组织按11 0(质量体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨,4 下1 0 0 0 0 g离心1 0 m i n,上清即为样品提取液,用于D A S-E L I S A检测、R T-P C R和实时荧光R T-P C R检测;或称取0.1 g样品提取核酸后用于R T-P C R、实时荧光R T-P C R检测。7.3 D A S-E L I S A 具体方法按照附录B。7.4 R T-P C R 具体方法按照附录C。7.5 实时荧光R T-P C R 具体方法按照附录D。7.6 序列测定与比对 P C R产物纯化后,直接测序或者克隆测序,利用N C B I网站上的B L A S T软件把测序所得到的核苷酸序列与已知T S V序列进行比对。8 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。2S N/T5 3 8 82 0 2 1 D A S-E L I S A初筛结果为阴性,且R T-P C R或实时荧光R T-P C R方法检测结果为阴性,则判定样品不携带T S V。D A S-E L I S A初筛结果为阳性,则采用R T-P C R或实时荧光R T-P C R方法进行验证。若验证结果为阳性,则判定样品携带T S V;若验证结果为阴性,则判定样品不携带T S V。D A S-E L I S A初筛结果为阴性,但R T-P C R检测为阳性,则需进一步序列测定。序列测定结果经比对分析为T S V,则判定样品携带T S V。R T-P C R检测结果为阳性,且实时荧光R T-P C R检测结果为阳性,则判定样品携带T S V。9 结果记录与样品保存9.1 结果记录 记录好各项实验数据,包括样品来源、种类、获得时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告,分子生物学检测结果保留电泳照片、序列测定分析报告及实时荧光结果图片。9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-2 0 或-8 0 冰箱中,并做好登记和标记工作,以备复核用。3S N/T5 3 8 82 0 2 1附 录 A(资料性)烟草线条病毒的背景资料A.1 寄主范围 已报道的寄主范围较广,可侵染3 0个科的2 0 0多种单子叶和双子叶植物。A.2 病害症状 T S V侵染寄主后,能够对其产量造成较大影响,引起的症状因寄主不同存在一定的差异,如引起烟草系统性坏死条斑,大丽花、棉花、红车轴草、草木樨斑驳,番茄黄色环斑和畸形,芦笋矮化,玫瑰脉黄化,大豆、豌豆、辣椒系统性坏死,马铃薯轻花叶,草莓坏死休克等。见图A.1。(引自P a u l B a c h i,U n i v e r s i t y o f K e n t u c k y R e s e a r c h a n d E d u c a t i o n C e n t e r,B u g w o o d.o r g)图A.1 T S V侵染烟草引起的症状A.3 分布地区 主要分布于巴西、秘鲁、丹麦、法国、英国、阿根廷、美国、加拿大、澳大利亚和新西兰等国家。A.4 传播途径 机械接种传播;种子、花粉传播;蓟马传播。A.5 粒体形态 等轴对称二十面体到准等轴对称颗粒,直径为2 7 n m3 5 n m。见图A.2。4S N/T5 3 8 82 0 2 1(引自B r u n t,1 9 6 8)图A.2 T S V病毒粒体A.6 病毒基因组 三分体线形正义s s R NA,R NA 1、R NA 2 和R NA 3全长分别约3.5 k b、2.9 k b和2.2 k b。5S N/T5 3 8 82 0 2 1附 录 B(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)B.1 试剂B.1.1 包被抗体 特异性的烟草线条病毒抗体。B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的烟草线条病毒抗体。B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pN P P)。B.1.4 1 P B S T缓冲液(p H 7.4)氯化钠(N a C l)8.0 g磷酸二氢钾(KH2P O4)0.2 g磷酸氢二钠(N a2HP O4)1.1 5 g氯化钾(K C l)0.2 g吐温-2 0(T w e e n-2 0)0.5 mL溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.5 抽提缓冲液(p H 7.4)亚硫酸钠(N a2S O3)1.3 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0.0 g溶于9 0 0 mL的1 P B S T中,并用1P B S T定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.6 包被缓冲液(p H 9.6)碳酸钠(N a2C O3)1.5 9 g碳酸氢钠(N a HC O3)2.9 3 g溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(p H 7.4)牛血清白蛋白(B S A)2.0 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0.0 g溶于9 0 0 mL 1P B S T中,并用1P B S T定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.8 底物缓冲液(p H 9.8)二乙醇胺9 7 mL氯化镁(M g C l2)0.1 g6S N/T5 3 8 82 0 2 1溶于8 0 0 mL灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HC l)调p H至9.8,定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.2 程序B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。B.2.2 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照,并且至少一个重复,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。阴性对照为健康的植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品一致),阳性对照为感染T S V的植物组织,空白对照为样品抽提缓冲液。B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液,按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。B.2.4 加底物 将底物pN P P加入到底物缓冲液中使终浓度为1 m g/mL(现配现用),按1 0 0 L/孔,加入到酶联板中,室温避光孵育。B.2.5 读数 阳性对照孔明显显色后,酶标仪在4 0 5 n m处读O D值。B.3 结果判断B.3.1 质量控制要求 满足阴性对照孔的O D4 0 5值5;同一样品的重复性基本一致,数值差别2,判定为阳性;样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值在阈值附近,判定为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值2,判定为阴性。若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判定。7S N/T5 3 8 82 0 2 1附 录 C(规范性)R T-P C R检测C.1 试剂C.1.1 T r i z o L试剂C.1.2 5T B E缓冲液 T r i s碱 5 4.0 g 硼酸(H3B O3)2 7.5 g 0.5 m o l/L E D TA(p H 8.0)2 0.0 mL 补充蒸馏水至1 0 0 0 mL。用时加蒸馏水稀释至0.5T B E。C.1.3 6加样缓冲液 0.2 5%溴酚蓝 4 0%(W/V)蔗糖水溶液。C.1.4 引物序列 根据已报道的T S V外壳蛋白基因序列设计1对用于特异性扩增的引物。正向引物T S V-F:5-C C C T C AAG C GAAGA C AT C G T T-3 反向引物T S V-R:5-GAG G C A C C AGA C GATAG C T C T-3 P C R扩增片段大小为3 5 5 b p。C.2 R T-P C R检测C.2.1 总R N A提取 取0.1 g样品组织,加入液氮充分研磨至粉末状后迅速移入1.5 mL离心管,再加入1 mL T r i z o L试剂(或取样品提取液1 0 0 L置于1.5 mL离心管中,再加入1 mL T r i z o L试剂),剧烈振荡摇匀3 m i n;4 下1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n,取上清;加入二氯甲烷3 0 0 L,剧烈振荡1 5 s,室温静置5 m i n,4 下1 2 0 0 0 g离心1 5 m i n,取上层水相;加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置1 5 m i n,4 下1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n,弃上清;加入1 mL 7 5%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4 下7 5 0 0 g离心3 m i n,弃上清;R NA沉淀干燥后,用2 0 L4 0 L经D E P C(焦碳酸二乙酯)处理过的d d H2O溶解,-8 0 保存备用。注:总R NA的提取也可以采用商品化试剂盒。C.2.2 c D N A合成 在P C R管中加入3 L总R NA,随机引物(1 0 0 m o l/L)1 L或反向引物T S V-R 1 L,d d H2O 7 L,7 0 水浴1 0 m i n,迅速冰浴5 m i n,再加入下列试剂:5R T缓冲液5 L、d NT P s(1 0 mm o l/L)2 L、M-ML V R T(2 0 0 U/L)1 L、R N a s i n(4 0 U/L)1 L。4 2 水浴6 0 m i n,7 0 水浴1 0 m i n,自然冷却至室温,-2 0 保存备用。注:c D NA合成也可以采用商品化试剂盒。8S N/T5 3 8 82 0 2 1C.2.3 P C R扩增 P C R反应体系见表C.1,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。P C R反应条件:9 4 预变性3 m i n,然后9 4 变性3 0 s、5 7 退火4 5 s、7 2 延伸4 5 s,3 5个循环,最后一个循环结束后7 2 继续延伸1 0 m i n。预期扩增片段大小3 5 5 b p。表C.1 P C R反应体系名称加样量/Lc D NA3.0 T S V-F(1 0 m o l/L)1.0T S V-R(1 0 m o l/L)1.0 2T a q P C R m i x1 2.5d d H2O7.5总体积2 5.0 注:P C R扩增也可以采用商品化试剂盒。C.2.4 琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,对P C R产物进行电泳,电压3 V/c m5 V/c m,缓冲液0.5 T B E。电泳结束后,在溴化乙锭(E B,浓度为0.5 g/mL)溶液染色1 0 m i n后,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期大小的特异性D NA电泳带,拍照并做记录。注:也可以采用其他核酸染料替代E B。C.2.5 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在3 5 5 b p大小处有扩增条带,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阳性。如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在3 5 5 b p大小处有扩增条带,待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阴性。9S N/T5 3 8 82 0 2 1附 录 D(规范性)实时荧光R T-P C R检测D.1 试剂 总R NA提取试剂同C.1.1。T a qM a n P C R m i x。D.2 引物及探针 根据已报道的T S V外壳蛋白(C P)和依赖于R NA的R NA聚合酶(R d R p)基因序列设计用于实时荧光R T-P C R检测的特异性引物及探针,引物及探针序列见表D.1。表D.1 实时荧光R T-P C R检测引物及探针名称序列(5-3)T S V-F 1C A T C C A T C C AA C G C C A T G TT S V-R 1C AAG T T G G G C A T C T G C T G T T R T TT S V-F 2T C C G T TWTMAA R AA C C T C A T Y G T GT S V-R 2WAA T C AG C C G G Y T CWA TA C C R AA TT S V-P 1F AM-C G T R C TAA C AA C C G C-MG BT S V-P 2F AM-A C T T GAGWAGA C R AA T T G-MG B 注:M=A/C;R=A/G;W=A/T;Y=C/TD.3 总R N A提取 方法同C.2.1。D.4 c D N A合成 在P C R管中加入3 L总R NA,随机引物(1 0 0 m o l/L)1 L,d d H2O 7 L,7 0 水浴1 0 m i n,迅速冰浴5 m i n,再加入下列试剂:5R T缓冲液5 L、d NT P s(1 0 mm o l/L)2 L、M-ML V R T(2 0 0 U/L)1 L、R N a s i n(4 0 U/L)1 L。4 2 水浴6 0 m i n,7 0 水浴1 0 m i n,自然冷却至室温,-2 0 保存备用。注:c D NA合成也可以采用商品化试剂盒。D.5 实时荧光P C R反应 P C R反应体系见表D.2,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。反应程序:9 5 2 m i n,9 5 1 5 s,6 0 1 m i n,共4 0个循环。01S N/T5 3 8 82 0 2 1表D.2 实时荧光P C R反应体系名称加样量/L2T a qM a n P C R m i x1 2.5T S V-F 1(1 0 m o l/L)1.0T S V-R 1(1 0 m o l/L)1.0T S V-F 2(1 0 m o l/L)1.0T S V-R 2(1 0 m o l/L)1.0T S V-P 1(5 m o l/L)2.0T S V-P 2(5 m o l/L)2.0c D NA2.0d d H2O2.5总体积2 5.0 注:实时荧光P C R也可以采用商品化试剂盒。D.6 结果判定 在空白对照及阴性对照无C t值且无扩增曲线、阳性对照C t值3 0并出现典型扩增曲线的条件下:待测样品的C t值4 0时,判定T S V阴性;待测样品的C t值3 5时,判定T S V阳性;待测样品的C t值小于4 0而大于3 5时,应重新进行测试;如果重新测试的C t值4 0,判定T S V阴性;如果重新测试的C t值小于4 0而大于3 5,则判定T S V阳性。S N/T5 3 8 82 0 2 1S N/T 5 3 8 82 0 2 1参 考 文 献 1 B h a t B N.D e t e c t i o n o f T o b a c c o s t r e a k v i r u s i n f e c t i n g s u n f l o w e r b y E L I S A a n d R T-P C R m e t h o d.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f P l a n t P r o t e c t i o n,2 0 1 5,8(1):9 9-1 0 3.2 B r u n t A A.T o b a c c o S t r e a k V i r u s i n D a h l i a s.P l a n t P a t h o l o g y,1 9 6 8,1 7(3):1 1 9-1 2 2.3 D i j k s t r a J.T o b a c c o s t r e a k v i r u s i n s u n f l o w e r(H e l i a n t h u s a n n u u s).N e t h e r l a n d s J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y,1 9 8 3,8 9(4):1 5 3-1 6 9.4 G a w a n d e S P,K.P.R,M o n g a D,e t a l.R a p i d d e t e c t i o n o f T o b a c c o s t r e a k v i r u s(T S V)i n c o t t o n(G o s s y p i u m h i r s u t u m)b a s e d o n R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n L o o p M e d i a t e d I s o t h e r m a l Am p l i f i c a-t i o n(R T-L AMP).J o u r n a l o f V i r o l o g i c a l M e t h o d s,2 0 1 9,2 7 0:2 1-2 5.5 H o s s e i n i S,H a b i b i M K,M o s a h e b i G H,e t a l.F i r s t r e p o r t o n t h e o c c u r r e n c e o f t o b a c c o s t r e a k v i r u s i n s u n f l o w e r i n I r a n.J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y,2 0 1 2,9 4(3):5 8 5-5 8 9.6 P r a d e e p K,S a t y a V K,S e l v a p r i y a M,e t a l.E n g i n e e r i n g r e s i s t a n c e a g a i n s t T o b a c c o s t r e a k v i r u s(T S V)i n s u n f l o w e r a n d t o b a c c o u s i n g R NA i n t e r f e r e n c e.B i o l o g i a P l a n t a r u m,2 0 1 2,5 6(4):7 3 5-7 4 1.7 S h a r m a n M,P a g e n d a m D E,P e r s l e y D M,e t a l.F i e l d e v a l u a t i o n o f t o l e r a n c e t o T o b a c c o s t r e a k v i r u s i n s u n f l o w e r g e r m p l a s m,a n d o b s e r v a t i o n s o f s e a s o n a l d i s e a s e s p r e a d.A n n a l s o f A p p l i e d B i o l o g y,2 0 1 6,1 6 8:3 9 0-3 9 9.8 洪健,李德葆,周雪平.植物病毒分类图谱.北京:科学出版社,2 0 0 1:1 5 0-1 5 2.12028835 T/NS版权专有 侵权必究*书号:1 5 5 1 7 56 8 3定价:1 6.0 0元