第六章-基因工程抗体.pptx

第六章第六章 基因工程抗体基因工程抗体Emil von Behring,1901,antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein,1984,monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987,structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter,1972,structure of antibodyPaul Ehrlich,1908,production of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能5美国美国FDAFDA已批准的治疗抗体药物已批准的治疗抗体药物OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥移植排斥心绞痛心绞痛B B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎类风湿关节炎乳腺癌乳腺癌急性复发性髓性白血病急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性难治性B B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998200020012002一一 抗体抗体分子结构分子结构免疫球蛋白的功能区免疫球蛋白的功能区免疫球蛋白的水解片段免疫球蛋白的水解片段complimentarity determining region,CDRhypervarible region(HVR)(complimentarity determining region,CDR):formation of the Ag binding sitepurple:HV CDR(in both the ribbon and ball and stick views)green:antigen HV sequences contact the antigen.antibodyantigenantigen-antibody complex:epitope13Ig胚系基因结构特点胚系基因结构特点在Ig分子多肽链中，型、型轻链和Ig的重链分别写作Ig、Ig和IgH，基因依次写作IGK、IGL和IGH，其分别位于第2、22和14号染色体上。14重链重链:位于位于14号染色体，可分为号染色体，可分为4组组CV区编码基因:VH(可变区)-48 DH(多样性区)-23 JH(连接区)-6C区编码基因:CH(恒定区):C,C,C等10个片段15轻链轻链(-2号染色体号染色体,-22染色体染色体)V区编码基因:-V,J-40,5 -V,J-30,4C区编码基因:C(1);C(4)二、细胞工程抗体和基因工程抗体二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体第三代：基因工程抗体抗体技术的发展经历了三个阶段抗体技术的发展经历了三个阶段1890年年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。白组分。1975年年Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)。19941994年基因工程抗体年基因工程抗体。1、多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibody;PcAb)多价抗原多价抗原多个多个克隆克隆（致敏的（致敏的B细胞）细胞）多多克隆抗体克隆抗体 实际意义实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清如：破伤风抗毒素血清 抗抗破伤风，破伤风，胎盘球蛋白胎盘球蛋白 抗病毒感染抗病毒感染等，等，副作用：副作用：超敏反应。超敏反应。（2）临床诊断，）临床诊断，如：肥达氏反应如：肥达氏反应-伤寒、副伤寒，伤寒、副伤寒，缺点：特异性差。缺点：特异性差。2、单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）由单一克隆由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。特点：具有高度均一性。特点：具有高度均一性。杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-无限增殖；无限增殖；免疫免疫B细胞细胞-合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。杂交瘤技术杂交瘤技术-HAT培养基：次黄嘌呤培养基：次黄嘌呤(H),氨氨基蝶呤基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)。单抗制备的流程图单抗制备的流程图 实际意义：实际意义：（1）抗原的纯化和结构分析；）抗原的纯化和结构分析；（2）细胞发生、分化及功能的阐明；）细胞发生、分化及功能的阐明；（3）临床疾病的诊断和治疗，）临床疾病的诊断和治疗，如：免疫分子检测；如：免疫分子检测；免疫导向药物治疗恶性肿瘤免疫导向药物治疗恶性肿瘤 -McAb抗癌药物抗癌药物(毒素或毒素或 放射核素偶联放射核素偶联)。多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体来源来源动物免疫血清、恢复期病人血动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群清或免疫接种人群多为鼠源性多为鼠源性特点特点来源广泛、制备容易来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应或无血清交叉反应组成组成针对不同抗原表位的抗体的混针对不同抗原表位的抗体的混合物合物针对单一表位，结构和组成高度针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致均一，抗原特异性及同种型一致应用应用疾病的被动免疫治疗疾病的被动免疫治疗疾病诊断、特异性抗原或蛋白的疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备疗和生物导向药物制备缺点缺点特异性不高、易发生交叉反应，特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较多克隆抗体与单克隆抗体的比较单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌嵌合抗体合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体融合蛋白和双特异性抗体。27基基因因工工程程抗抗体体1 小分子抗体小分子抗体3 鼠单抗人源化鼠单抗人源化基基因因工工程程改改造造的的抗抗体体2 第一代的抗体人源化第一代的抗体人源化嵌合抗体嵌合抗体 从从杂杂交交瘤瘤细细胞胞分分离离出出鼠鼠鼠鼠MAbMAb功功能能性性可可变变区区基基因因，与与人人Ig恒恒定定区区（决决定定免免疫疫原原性性）基基因因连连接接，插插入入适适当当表表达达载载体体，转转染染宿宿主主细细胞胞，表表达达人人-鼠鼠嵌嵌合合抗抗体体。嵌嵌嵌嵌合合合合抗抗抗抗体体体体由由由由于于于于这这这这两两两两部部部部分分分分在在在在空空空空间间间间结结结结构构构构上上上上相相相相对对对对独独独独立立立立，其其其其独独独独特特特特的的的的抗抗抗抗体体体体亲亲亲亲和和和和力力力力保保保保持持持持得得得得很很很很好好好好，但但但但因因因因鼠鼠鼠鼠单单单单抗抗抗抗可可可可变变变变区区区区的的的的存存存存在在在在，应应应应用用用用时时时时仍仍仍仍有有有有较较较较强强强强的的的的免免免免疫疫疫疫排排排排斥斥斥斥反反反反应。应。应。应。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人-鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体第二代的抗体人源化第二代的抗体人源化改型抗体改型抗体 在在在在嵌嵌嵌嵌合合合合抗抗抗抗体体体体的的的的基基基基础础础础上上上上进进进进一一一一步步步步将将将将鼠鼠鼠鼠MAbMAb可可可可 变变变变 区区区区 中中中中 相相相相 对对对对 保保保保 守守守守 的的的的FR(framework FR(framework region)region)替替替替 换换换换 成成成成 人人人人 的的的的FRFR，保保保保留留留留与与与与抗抗抗抗原原原原结结结结合合合合部部部部位位位位决决定定簇簇互互补补 区区（complement complement determinant determinant region)region)部位部位部位部位 (即即即即CDRCDR移植移植移植移植)早期的改型抗体：早期的改型抗体：早期的改型抗体：早期的改型抗体：简单的简单的简单的简单的CDRCDR移植，通过点突变进行移植，通过点突变进行移植，通过点突变进行移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。微调即更换某个位点上的氨基酸。微调即更换某个位点上的氨基酸。微调即更换某个位点上的氨基酸。CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植）小分子抗体小分子抗体 人源化抗体属完全的抗体分子。通过人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子体及多价小分子抗体。抗体。单价小分子单价小分子抗体抗体一一、FabFab抗体抗体FabFabFabFab段由重链段由重链段由重链段由重链V V V V区及区及区及区及CH1CH1CH1CH1功能区与整个轻链以二硫功能区与整个轻链以二硫功能区与整个轻链以二硫功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发键形式连接而成，主要发键形式连接而成，主要发键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。挥抗体的抗原结合功能。挥抗体的抗原结合功能。挥抗体的抗原结合功能。FabFabFabFab抗体只有完整抗体只有完整抗体只有完整抗体只有完整IgGIgGIgGIgG的的的的1/31/31/31/3。二、单链抗体二、单链抗体(ScFv)(ScFv)定义：用基因工程方法，定义：用基因工程方法，将抗体将抗体VHVH和和VLVL（重链和轻链可变（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件特异抗体等的理想而基本的元件 。Ag ScFvScFv应用应用：用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布 基因治疗基因治疗 研究基因结构与功能的关系研究基因结构与功能的关系小小分子抗体分子抗体123免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体链表达载体L链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备抗体分子的制备I Fab antibody molecule抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备II Fv antibody molecule分别构建载体分别构建载体L链表达载体链表达载体H链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备小分子抗体的制备(1)ds-Fv抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备小分子抗体的制备disulfide-stabilized Fv,ds-Fv三、单域抗体三、单域抗体 抗体抗体与抗原的结合主要由与抗原的结合主要由IgIg的的V V区决定，区决定，因此只含因此只含V V区基因片段的小分子抗体，即只区基因片段的小分子抗体，即只有有VHVH或或 VLVL一个功能结构域，也能保持原单一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个IgIg分子的分子的1 11212，故也称之为小抗体。，故也称之为小抗体。四四.超变区超变区多肽多肽 抗体抗原结合是经过补体决定区（抗体抗原结合是经过补体决定区（CDRCDR）来）来实现。因此，实现。因此，CDRCDR是构成抗原抗体结合的最小是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDRCDR多多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个结果。这种只含有一个CDRCDR多肽的抗体，称为多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal(minimal recognition unit,MRU)recognition unit,MRU)。提高抗体提高抗体效应功能效应功能抗体融合蛋白抗体融合蛋白双特异性抗体双特异性抗体偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质细胞内抗体细胞内抗体提高抗体效应功能提高抗体效应功能双特异性抗体双特异性抗体 抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B制备双特异性抗体的方法主要有3种：（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子：LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK 在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（ab）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失 抗体融合蛋白抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，：抗体的一部分被非抗体序列替代，：抗体的一部分被非抗体序列替代，：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。所形成的具有新的特性融合蛋白。所形成的具有新的特性融合蛋白。所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：根据构建方式的不同，主要分为两种形式：根据构建方式的不同，主要分为两种形式：根据构建方式的不同，主要分为两种形式：FcFcFcFc融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白（Fc Fc Fc Fc fusion fusion fusion fusion protein,FcFPprotein,FcFPprotein,FcFPprotein,FcFP）由由由由抗抗抗抗体体体体的的的的Fc Fc Fc Fc 段段段段与与与与某某某某些些些些具具具具有有有有特特特特定定定定功功功功能能能能的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结构构构构域域域域融融融融合合合合而而而而成成成成。如如如如CD4CD4CD4CD4免免免免疫疫疫疫粘粘粘粘附附附附素素素素，就就就就是是是是由由由由抗抗抗抗体体体体的的的的FcFcFcFc段段段段与与与与2 2 2 2个个个个CD4CD4CD4CD4分子的分子的分子的分子的Ig IgIg Ig同源区重组而成同源区重组而成同源区重组而成同源区重组而成抗抗抗抗 原原原原 结结结结 合合合合 融融融融 合合合合 蛋蛋蛋蛋 白白白白（antigen-Binding antigen-Binding antigen-Binding antigen-Binding fusion fusion fusion fusion protein,protein,protein,protein,ABFPABFPABFPABFP）由由由由具具具具有有有有抗抗抗抗原原原原结结结结合合合合功功功功能能能能的的的的抗抗抗抗体体体体结结结结构构构构与与与与其其其其他他他他功功功功能能能能性性性性蛋蛋蛋蛋白白白白融融融融合合合合构构构构成成成成。如如如如免免免免疫疫疫疫毒毒毒毒素素素素，抗抗抗抗体体体体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。免免疫疫粘粘附附素素(immunoadhension)(immunoadhension)：将将将将人人人人抗抗抗抗体体体体恒恒恒恒定定定定区区区区(主主主主要要要要是是是是FcFcFcFc段段段段)N-)N-)N-)N-端端端端连连连连接接接接于于于于人人人人细细细细胞胞胞胞表表表表面面面面的的的的受受受受体体体体分分分分子子子子或或或或细细细细胞胞胞胞粘粘粘粘附附附附分分分分子子子子上上上上，在在在在真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞中中中中表表表表达达达达出出出出正正正正确确确确折折折折叠叠叠叠的的的的融融融融合合合合抗抗抗抗体体体体蛋蛋蛋蛋白白白白分分分分子子子子，这这这这种种种种分分分分子子子子可可可可同同同同时时时时发发发发挥挥挥挥抗抗抗抗体体体体的的的的效效效效应应应应功功功功能能能能及及及及其其其其它它它它相相相相应应应应的的的的效效效效应应应应功功功功能能能能，这这这这种种种种分分分分子子子子又又又又被称为新效能抗体。被称为新效能抗体。被称为新效能抗体。被称为新效能抗体。免免疫疫毒毒素素：又又又又称称称称生生生生物物物物导导导导弹弹弹弹，是是是是由由由由导导导导向向向向性性性性的的的的载载载载体体体体分分分分子子子子与与与与具具具具有有有有毒毒毒毒性性性性的的的的弹弹弹弹头头头头蛋蛋蛋蛋白白白白交交交交联联联联而而而而制制制制成成成成，属属属属于于于于导导导导向向向向药药药药物的一种。物的一种。物的一种。物的一种。免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质连接放射性同位素连接放射性同位素(131131I I、99m99mTcTc）连接植物或细菌毒素（连接植物或细菌毒素（ricinricin、PEPE4040）连接细胞毒性药物（连接细胞毒性药物（C1027C1027、柔红霉素）柔红霉素）CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫细胞因子免疫细胞因子(Immunocytokine)(Immunocytokine)复习题简述真核表达载体的种类及特点。哺乳动物的常用标记有哪些？其原理是什么？哺乳动物表达载体有哪几类？各有何优缺点？常用的核酸探针有哪几类？各有何特点？核酸列举常用的探针标记物及标记方法。简述核酸分子杂交的过程及种类。简述人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略简述制备双特异性抗体的主要方法及其特点