DB65∕T 4519-2022 动物包虫病防治技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 11.220CCS B 41B65新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/T 45192022动物包虫病防治技术规程Techn ical r egul ation f or con tr ol of an imal hydatid disease2022-10-10 发布2022-12-09 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布DB 65/T 45192022透:货蓝士举嬴衣透逐港举微热次嚷整/2酸瓷泰寇森漆於*Q/-,1,刖 B本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）提出。本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）。本文件主要起草人：张壮志、王冰洁、赵莉、班万里、郭宝平、郭凯、艾尔肯艾沙、张佳睿、段 兰利、郭璐、陈云英、徐晶、穆尼拉特列吾汗、王延、喻昌盛、刘志强、古丽扎提塔力甫汗、努尔库 尔玛那里。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究 中心）。对文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市天山区新华南路408 号）、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）（新疆乌鲁木齐市新市区 冬融街726号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（新疆乌鲁木齐市天山区新华南路167号）。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830004新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830013新疆维吾尔自治区市场监督管理局 联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830004IDB 65/T 45192022动物包虫病防治技术规程1范围本文件规定了动物包虫病的术语和定义、临床诊断、实验室诊断、结果判定和防治的要求。本文件适用于新疆境内从事犬类和家畜饲养、屠宰、加工、经营以及从事动物疾病防治活动的单位 或个人。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。NY/T 1168畜禽粪便无害化处理技术规范病死及病害动物无害化处理技术规范农医发201725号3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1包虫病 hydatid disease由棘球属绦虫的中绦期幼虫引起的一种人兽共患寄生虫病，在我国主要有两种，即囊型包虫病（细 粒棘球蝌病）和泡型包虫病（多房棘球蝴病）；世界动物卫生组织（OIE）将其列为多种动物共患病，:我国将其列为三类动物疫病。-.3.2病原 pathogen棘球绦虫（Echin ococcus）。在新疆,最常见的棘球绦虫有两种：细粒棘球绦虫比。cocc”granulosus 和多房棘球绦虫（Echinococcus multilolocularis）,相应的幼虫分别为细粒棘球蝴和多房棘球蝴，主要 特征见附录A。3.3生活史life cycle依赖绵羊等中间宿主和犬等终末宿主完成幼虫和成虫的生长发育。4临床 诊断4.1 流行病学分析4.1.1 传染源犬、狼、狐是传染源，即终末宿主。1DB 65/T 451920224.1.2 传播途径虫卵传播主要通过终末宿主排出的粪便污染饲料、食物、水等媒介，中间宿主经消化道感染，在体 内脏器（特别是肝/肺）中发育成幼虫期（中绦期），包囊或囊泡内长出原头节。粪便中的孕卵节片可 进行有节奏的收缩与松弛排出虫卵或使节片播散到离粪便较远的地方；同时，鸟、苍蝇、甲虫和蚂蚁等 可将虫卵传播至更远。含棘球蜘病包囊或囊泡的中间宿主内脏，被终末宿主吞食，在小肠内发育为成虫，产生孕卵节片或 虫卵。4.1.3 易感动物4.1.3,1细粒棘球绦虫的终末宿主：犬；中间宿主：绵羊和耗牛。4.1,3.2多房棘球绦虫的终末宿主：犬和狐狸；中间宿主：田鼠和仓鼠等啮齿动物。4.2临床症状4.2.1 轻度感染或初期感染都无症状，症状的轻重取决于棘球蜗的大小、寄生部位及数量。4.2.2 患病绵羊严重感染时，表现为消瘦、被毛逆立、脱毛、咳嗽、倒地不起；肺部感染时，咳后卧 地，不愿站立；肝脏感染时，腹部明显膨大，叩诊浊音，触诊和按压肝区时出现疼痛。4.2.3犬科动物感染棘球绦虫一般无明显的临床表现。4.3病理变化4.3.1棘球蜗寄生于肝/肺时，可见由宿主结缔组织包裹形成的包囊或囊泡，用手触摸具波动感，或在 器官深层也可摸到似球状的液体感肿块。有时也可在其它脏器如脾、肾等处发现同类包囊。剖检图见附 录B中图B.104.3.2终末宿主尸体剖解后，将小肠沿纵向剪开，肠内壁上可见寄生的棘球绦虫虫体。剖检图见附录 C中图C.Io5实验室诊断5.1 病原学诊断5.1.1棘球黝检查5.1.1.1 剖检重点检查肝、肺和肾等实质器官，发现棘球坳包囊，可初步判定为包虫病。若肉眼不能鉴别，可经 形态学和病理学检测确定包囊性质，见附录B中B.1。5.1.1.2 形态学鉴定包囊切开后，囊液略带黄色、透明，包囊组织与肝、肺交界处可见乳白色包囊壁，囊壁分两层，其 中外侧一层为角质层，内侧一层为生发层。抽取囊液，在光学显微镜下观察沉淀物，发现沉淀物中存在 原头蝴，体形呈圆形或椭圆形，顶突和吸盘内陷，也有部分头部翻出，形态见附录B中图B.2。5.1.1.3 病理学鉴定2DB 65/T 45192022病变组织经病理切片检查，在显微镜下观察，肝/肺细粒棘球蝌包囊外层（即外囊）呈典型的特殊 肉芽肿病变，由纤维组织和上皮样细胞构成，结构致密、无血管。肝包囊周围的肝细胞受压迫而发生萎 缩；肝间质结缔组织大量增生，小胆管显著增生。肺包囊周围的肺间质增生、伴随大量淋巴细胞浸润，发生炎症反应；外层包含肺组织和小气管。病理切片的具体操作见附录B中B.2,组织切片结果见附录B 中图B.3。5.1.2棘球绦虫检查5.1.2.1 剖检剖检犬、狐狸等，观察其小肠内是否有棘球绦虫成虫及其感染程度。具体操作见附录C中C.1。5.1.2.2氢滨酸槟榔碱下泻通过氢浪酸槟榔碱对犬进行导泻，检查排泄物中有无棘球绦虫虫体。具体操作见附录C中C.2。5.1.2.3形态学鉴定虫体染色的具体操作见附录C中C.3,虫体染色后置显微镜下观察。结果见附录C中图C.2。5.1.3双抗体夹心酶联免疫吸附试验（Sandwich-ELISA）按犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测方法对犬粪样进行检测。具体操作见附录D。5.2分子生物学诊断通过荧光定量PCR方法，分别对中间宿主寄生包囊/原头蝴等组织样品及终末宿主含虫卵/成虫等犬 粪/样品进行鉴定。荧光定量PCR检测的具体操作见附录E,荧光定量PCR的检测结果见附录E中图E.1。6结果判定包虫病感染的诊断要根据流行病学史、临床症状、病理变化和实验室诊断等的结果综合判定：a）在包虫病流行区具有4.2中的症状，可判定为包虫病疑似病例；b）符合4.3或5的诊断结果为阳性，可确诊为包虫病感染病例。7防治7.1 预防7.1.1 养犬管理和驱虫在流行区，对犬实行登记制度，限养、拴养犬只，定期为家/牧犬驱虫，犬驱虫后5 d内的犬粪按照 NY/T 1168的要求进行深埋、焚烧等无害化处理。7.1.2 屠宰场点管理加强对屠宰场点的动物检疫监督管理，发现病畜按照病死及病害动物无害化处理技术规范中的 相关规定处理。不应在屠宰场/点内养犬，防止犬只进入屠宰场/点。7.1.3 家畜免疫3DB 65/T 45192022在包虫病流行区对新生羔羊进行2次“羊棘球蝌（包虫）病基因工程亚单位疫苗”免疫接种，采用皮 下注射，选择颈部肩胛前缘位置，兽用9号针头45。角进针，注射剂量1mL/只。首次免疫28 d后加强免 疫1次；其后，成年羊每年加强免疫1次。7.1.4 宣传教育加大包虫病防治的健康教育和宣传工作。7.2 驱虫按照“犬犬投药，月月驱虫”的防控模式，用口比嘴酮对犬进行驱虫，按5 mg/kg10mg/kg的剂量一次 性口服，每月驱虫1次。如用毗唆酮咀嚼片，可按大型犬1片，小型犬0.5片的剂量投药。做好犬驱虫登 记记录。7.3 监测7.3.1牲畜感染（流性病学调查）以县为单位，至少选择20个县级牛羊屠宰场，每年选择屠宰高峰期检查2次，每次抽检200头（只）屠宰牛羊，检查肝肺包虫囊感染情况，填写登记表，并调查该屠宰场家畜购销、屠宰量、畜龄等情况,没有定点屠宰场的少数高发县，可选择冬季屠宰期进行屠宰牛羊的肝肺检查。见公式（1）。x=xl 00%.（1）Z式中：X 羊（或牛）感染率，单位为百分比（）；y棘球蝴感染羊（或牛）数，单位为只（或头）；z检查数，单位为只（或头）。7.3.2犬只感染通过剖检或粪抗原检测/观察犬的感染变化，见公式（2）ox=zxl 00%.（2）Z式中：X 犬感染率，单位为百分比（）；7阳性犬数（剖检或粪抗原），单位为只；z检查数，单位为只。7.3.3无害化处理在屠宰场对病变脏器实施无害化处理（高温高压、焚烧或深埋）。私自屠宰户，应将病变脏器切碎煮沸30 min,或在一 10。以下冻存1周，或焚烧或深埋，进行无害 化处理。4DB 65/T 45192022附录 A（规范性）中间宿主棘球蛾感染的病原学诊断A.1两种棘球蝴病病原学与流行病学特征比较见表A.1。表A.1两种棘球黝病病原学与流行病学特征比较所致疾病与流行病学内容细粒棘球蝴病/囊型包虫病多房棘球黝病/泡型包虫病病原细粒棘球绦虫多房棘球绦虫易感中间宿主羊，耗牛，骆驼，人田鼠，仓鼠，人易感终末宿主犬狐，犬体长/mm2-71.2 1.3节片数3个4个4个5个头节顶突伸缩力强，28个48个小钩顶突小，13个34个小钩成节睾丸45个65个睾丸26个36个孕节生殖孔常偏后，子宫具不规则的分支和侧囊子宫无侧囊幼虫称细粒棘球蝴，单房性，内含生发囊，原头坳,子囊，孙囊，囊液等，囊壁分2层，囊壁外有 宿主纤维组织包绕称泡球蝴，囊泡状团块，由无数大小囊泡相连 聚集而成，囊泡内含囊液（呈胶状元）和原头 坳在终末宿主体内成熟时间38 445 d28 d 32 d5DB 65/T 45192022附录 B（规范性）中间宿主棘球蝴感染的病原学诊断B.1剖检B.1.1家畜剖检在屠宰场通过眼观和触诊的方法检查屠宰家畜体腔内心、肝、肺、肾及脾等脏器外表面有无包囊或 小白点形的囊状物。将带包囊和小白点状物的脏器取出，用清水洗去血污，密封后放入样品保存箱，在 四周包上冰块保持4。（3状态，带回实验室。取出脏器，清洗并消毒患病脏器表面，置于瓷盘上，首先肉 眼逐区观察脏器表面，表层明显可见的包囊先切开看其结构。用手逐区触摸脏器，发现脏器有实质内囊 状物时，切开深层囊，观其结构。对于较大包囊，应先用20mL或50mL注射器抽出适量囊液，再剪开 包囊，观察其结构，具有囊壁和囊液结构应判定为包虫病。对于呈小白点状，囊径V0.5cm,不易观察,生长在脏器表面和内部的包囊，应先肉眼逐区观察，将表面所有可疑小白点囊状物以“铲字型切下，放 入平皿，保存于4%多聚甲醛，待病理学鉴定。B.1.2啮齿类动物剖检颈椎脱臼处死后，浸入75%乙醇中体表灭菌3 min。用无菌剪刀打开胸、腹腔，检查体腔内心、肝、肺、肾及脾等脏器外表面有无包囊或小白点形的囊状物，其他操作同附录B中B.1。脏器检查完后煮沸 或焚烧做无害化处理。B.2病理学鉴定病理切片的制作步骤如下：a）取材固定:所取肝、肺组织标本体积约为1.0cmX1.0cmX0.5cm,生理盐水冲洗，迅速置于 4%多聚甲醛中固定48 h。b）脱水透明:标本经4%多聚甲醛固定和冲洗后，进行脱水，乙醇溶液浓度依次为80%、90%、95%、100%,每隔25 min充分脱水，再分别放入脱蜡液I和脱蜡液II中，每次透明30min。c）浸蜡包埋:将透明后的标本放入蜡缸中浸蜡2 h,再将浸透后的组织融于石蜡中，待石蜡凝固 后，组织即被包在其中。d）切片:将包埋的蜡块固定在切片机上进行切片，厚度4 Rn5 Rm,先冷水,再温水展片，用载 玻片捞起切片，置于烤片机上烘烤30 min。e）组织标本HE染色：1）将烤好的载玻片分别置于脱蜡液I和脱蜡液H中脱蜡10 min；2）将脱蜡后的载玻片分别转入100%、95%、85%、70%乙醇中，1 min/次,经蒸储水冲洗1 min,转入染液；3）将载玻片浸入苏木素染色5 min,再用自来水冲洗约2 min；4）用1%盐酸乙醇分化约20 s,镜检下控制，直至核内染色质和细胞核达到清晰为止；5）用自来水冲洗约2 min,蒸储水洗1 min；6）将载玻片浸入到伊红染色1 min2 min,分别经70%、85%、95%、100%乙醇脱水，10 s/次；7）脱蜡液透明2次，约10 min/次；8）用滤纸吸干切片边缘多余的脱蜡液，滴加适量的中性树胶，加盖玻片封固；6DB 65/T 451920229）显微镜下观察组织HE染色变化，将切片于置于100倍视野下，并随机选择5个无重复的 视野，观察每个视野下的病理变化Ja）细粒棘球蝴感染羊肝图B.1细粒棘球蝴感染羊、牛和多房棘球蝴感染田鼠解剖图（眼观）a）细粒棘球蝴中原头蝴形态图 b）多房棘球蝴中原头蝴形态图注：图中箭头所示为原头蝴，显微镜下放大100倍观察。图B.2细粒棘球蝴和多房棘球坳中原头蝴形态图a）细粒棘球坳感染羊肝组织切片图 b）多房棘球黝感染田鼠肝组织切片图图B.3细粒棘球黝和多房棘球蝴感染的组织切片图（100X）7DB 65/T 45192022附录 C（规范性）终末宿主棘球绦虫感染的病原学诊断C.1剖检被检动物处死后，应尽快取出小肠，结扎两端放入密封袋中，编号后，尽快送往实验室。长距离运 输时，可将样品袋置于样品保存箱，在四周包上冰块保持4 P状态，或将结扎好的小肠内注入4%10%的福尔马林固定液。如病料不能冷冻或固定，应迅速检查，避免虫体会在数小时内被消化。未经固定的 小肠，可冷冻后再进行检查，注意虫卵对低温的抵抗力较强，在一70。条件下3 d7 d才能被杀灭。将新鲜小肠纵向剪开，可借助放大镜观察附着在肠壁上的成虫，并计数。为精确计数，未固定的小肠宜被剪成（46）段，浸泡于37。生理盐水中30 min,以便虫体脱落。内容物被冲洗至另一方搪瓷盘中，仔细检查。同时，用刮舌板刮肠壁，全部材料煮沸，用（80100）目铜筛过滤除去颗粒，冲洗下来的内容物和碎屑置于黑底托盘，用放大镜和体式显微镜作虫体计数。通 常可在小肠的前1/3段发现细粒棘球绦虫成虫，多房棘球绦虫成虫一般寄生在小肠的中/后部。C.2氢溪酸槟榔碱下泻C.2.1下泻步骤投药前禁食12 h,按0.5 mL/kg（1.5%氢滨酸槟榔碱混悬液）剂量,从犬口腔灌入药液。服药后40 min-60 min,被检犬在排出大量正常粪便后，会排出标准粪样（带粘膜的黏液）；超过60 min,被检犬还未 排出标准粪样，应第2次投药，投药剂量为第1次的一半。少量犬服药后出现心搏过速、抽搐、虚脱等症 状，短时间内会自行消失；反应严重时，应使用硫酸阿托品治疗，齐（J量为0.05mg/kgl mg/kg。取4 mL黏液样品用清水稀释至100 mL,并盖上一薄层约1 mL液体石蜡，煮沸5 min。静置，待温度 降低后，倾去上清液，再用大量生理盐水或自来水反复冲洗沉淀物，直至上清液中大部分絮状物去除为 止，其后将沉淀物缓慢倒入带黑底搪瓷盘中加适量的生理盐水或清水，检查虫体。0.2.2结果判定C.2.2.1 虫体检查用1%盐水清洗搪瓷盘中标准粪样，沉淀片刻，弃上清，晃动盘，肉眼判定有无虫体，发现虫体吸 入平皿，逐条计数、登记。检完后，认真清洗粪检盘，避免重检。C.2.2.2感染强度分三级。I轻度vio条，n中度io条l oo条，皿重度ioo条。C.2.3消毒处理为保障操作人员和环境的安全，氢澳酸槟榔碱下泻和检查后应按如下操作进行消毒处理：a）粪便收集完后，将犬继续固定12 h。粪便扔入废物坑，撒入石灰，并用土埋实，避免犬将坑 内废弃物刨出造成污染；b）被犬粪接触的地面、铁锹、铁钎、铁链等一律用喷灯焚烧；c）防护服、胶靴、手套、帽子、口罩等检查用品使用后按无污染解脱法，分别装入结实塑料袋 中（每袋体积不能大于高压锅所能容纳的体积），严格高压消毒处理；8DB 65/T 45192022d）应密切注视每一个环节，发现问题及时处理；外人不应进入场地，消毒应彻底。C.3形态学鉴定虫体染色的制作步骤如下：a）取材固定：用巴氏吸管将虫体移到生理盐水中，洗去杂质，静置约30min,虫体活动全部停 止，吸去液体，置于4%多聚甲醛中固定24鼠b）虫体标本HE染色：1）标本经4%多聚甲醛固定后，移入流水中冲洗l h后用去离子水冲洗数次；2）将冲洗后的虫体置于稀释好的苏木素染液中染色过夜；3）染色后的虫体分别转入30%、40%、50%、60%70%乙醇中脱水，30 min/次；4）用1%盐酸乙醇分化约20 s,镜检下控制，虫体褪色至颜色合适为止；5）再用自来水冲洗约2 min,蒸储水洗1 min；6）将虫体转入到伊红染液中染色1 min2 min,7）染色后的虫体分别转入80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，15 min/次；8）用1：1无水乙醇和脱蜡液混合液透明30 min,然后用脱蜡液原液透明20 min；9）用滤纸吸干切片边缘多余的脱蜡液，滴加适量的中性树胶，加盖玻片封固；10）显微镜下观察虫体HE染色结果。a）细粒棘球绦虫感染犬小肠 b）多房棘球绦虫感染犬小肠图C.1细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染犬小肠解剖图（眼观）a）细粒棘球绦虫虫体染色图b）多房棘球绦虫虫体染色图图C.2细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫虫体染色图（40 X）9DB 65/T 45192022附录 D（规范性）犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测方法D.1用法D.1.1平衡将试剂盒从冷臧环境中取出，置于室温平衡至15 P25（后使用，液体试剂用前轻轻旋转或震荡 混匀。D.1.2洗涤液配制使用前浓缩洗涤液（25x）用蒸储水或纯化水25倍稀释（40mL浓缩洗涤液（25x）加入960mL纯化 水）。在无菌条件下配制（无菌水和无菌容器）的洗涤液可在2 P89条件下保存7 d。D.1.3样品的准备将采集的新鲜样品在一70 P冷冻一周室温解冻后取1g样品，力UmL样品稀释液，振荡混匀，4000 上清用于检测，用样品稀释液10倍稀释离心后的上清液（例如：15匹样品上清液加 135匹样品稀释液）。注：不用稀释阴、阳性对照。每个样品在添加到包被板前应混匀。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品 在板上的位置。D.1.4操作步骤分以下几步：a）取出包被板（根据待检样品的多少，可将板条拆开分次使用），加入100皿阴性、阳性对照,每次检测各加2孔；在相应的孔中加入100 pL已稀释好的样品；b）在37。条件下温育（301）min；c）将各孔的液体弃入废液筒，用300 rL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗涤后应弃去孔内 的液体。在最后1次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干；d）每孔加入100|1L酶结合物；e）在37 P条件下温育（301）min；f）重复步骤c；g）每孔加入50匹显色液A和50 gL显色液B；h）在37 P条件下温育（151）min；i）每孔加入50 gL的终止液，终止反应。测量并记录样品和对照的OD值（450 n m）,在15 min 内读OD值（450 n m）有效。D.2结果判定D.2.1试验成立条件犬Eg阴性对照OD450nm值V0.2,犬Eg阳性对照OD450 nm值21.5。如试验无效，操作过程有异议，应按操作说明书重做一次试验。D.2.2结果判定10DB 65/T 45192022若S/P值202样品应判定为抗原阳性；若S/P值V0.2,样品应判定为抗原阴性。S/P值的计算见公 式 D.1。S/P=2S/(PC1+PC2).(D.1)式中：S-检测样品的OD45O nm值；PC1第1个犬Eg阳性对照OD450n m值;PC2第2个犬Eg阳性对照OD450 nm值。11DB 65/T 45192022附录 E（规范性）包虫病荧光定量PCR检测方法E.1设备、材料和试剂高速冷冻离心机、恒温水浴锅、涡旋仪、移液器（10 rL、1002、1000 L）、吸头（10诲-100 gL 1000 gL）.荧光定量PCR仪、八连管、EP管、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、粪便DNA提取试剂盒（离心柱型）、2T叫PCRMaster Mix。E.2样品采集、处理及基因组DNA提取从疑似感染包虫病的中间宿主肝、肺和终末宿主小肠采用剖检法收集包囊、原头黝及成虫样品，终 末宿主采用氢澳酸槟榔碱下泻法收集犬粪、虫卵样品。将获得包囊、原头蜿、成虫和虫卵样品装入离心 管中，用组织研磨器研磨到肉眼观察呈稀糊状即可。将研磨好的组织按血液/细胞/组织基因组DNA提取 试剂盒（离心柱型）的操作说明提取样品基因组DNA,见附录F；将犬粪按粪便DNA提取试剂盒（离心 柱型）的操作说明提取样品基因组DNA,见附录G；并将提取的DNA置于一20 P保存备用。E.3荧光定量PCR的检测方法E.3.1引物和探针序列设计针对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫NADH3基因保守区，使用Ol igo 6.0软件设计特异性引物和探针，见附录E中表E.1。表E.1荧光定量PCR引物和探针种名靶基因引物及探针序列产物大小细粒棘球蝴/绦虫NADH3F：5-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3187 bpR：5-CCACAATTAAAAAAATAAATAAC-3P：5-(FAM)ATACTATGGTCCATATATCTATATTAAGAGCTGAG(TAMRA)-3多房棘球坳/绦虫5-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3189 bp5-CCAGAATTAAAAAAATAAATAAC-3P：5-(VIC)ATTTTGACTCATATATCTAATGTTGCGAAGAGCT(TAMRA)-3E.3.2反应体系和反应条件在八连管内配置荧光定量PCR反应液，采用20匹反应体系：其中2xSuper Real Pr eMix 10 nL,上、下游引物（l OimoL）各0.52，探针（l On moL）0.25 pL,DNA模板1 rL,灭菌ddBO 7.752，同时 设置不含DNA模板的阴性对照。反应条件为：95。预变性10 min；95 P变性15 s,60。退火1 min,40个循环，FAM通道检测细粒 棘球物/绦虫探针扩增曲线，VIC通道检测多房棘球蝴/绦虫探针扩增曲线，观察实时荧光定量PCR检测 结果。E.3.3结果分析12DB 65/T 45192022根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值V35判为阳性；Ct 值介于3540为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值V35为阳性，Ct值刍35为阴性，见附录E中注：1、3-7：检测结果为阳性的临床样品；2：Eg标准质粒；851：检测结果为阴性的临床样品；52：阴性对照。图E.1细粒棘球蝴/绦虫荧光定量PCR检测结果注：112：检测结果为阳性的临床样品；13：Em标准质粒；1451：检测结果为阴性的临床样品；52：阴性对照。图E.2多房棘球蝴/绦虫荧光定量PCR检测结果13DB 65/T 45192022附录 F（规范性）组织基因组DNA提取F.1采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），方法如下：a）处理材料：动物组织应先打碎处理为细胞悬液，10000 r pm离心1 min,倒尽上清，加200匹 缓冲液GA,振荡至彻底悬浮；b）加入20 rL Pr otein ase K溶液，混匀，置于56。&直至组织溶解，瞬时离心以去除管盖内壁的 水珠，再进行下一步骤；c）加入200nL缓冲液GB,充分颠倒混匀，70 P放置10 min,溶液应变清亮，瞬时离心以去除 管盖内壁的水珠；d）加人200 rL无水乙醇，充分振荡混匀15s,可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁 的水珠；e）将上一步所得溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）,12000 r pm 离心30 s,倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；f）向吸附柱CB3中加入500 rL缓冲液GD,12000 r pm离心30 s,倒掉废液，将吸附柱CB3放 入收集管中；g）向吸附柱CB3中加入600匹漂洗液PW,12000 r pm离心30 s,倒掉废液，将吸附柱CB3放 入收集管中；h）重复操作步骤g；i）将吸附柱CB3放回收集管中，12000 r pm离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；j）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50|iL200 pL洗脱 缓冲液TE,室温放置2 min5 min,12000 r pm离心2 min,将溶液收集到离心管中，即样品 DNAo14DB 65/T 45192022附录 G（规范性）粪便基因组DNA提取G.1采用粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），方法如下：a）称取粪便样本180 mg220 mg至2 mL离心管中，并将离心管置于冰上；b）向样本中加入500 rL缓冲液SA,100 rL缓冲液SC,15 pL Pr otein ase K,0.25 g的研磨珠间 歇振荡1 min至样本充分混匀；c）70 C孵育15 min,孵育期间震荡2次3次；d）涡旋15 s,12000 r pm离心3 min,转移上清至新的离心管，向上清中加入10 rL的RNase A,震荡混匀后室温放置5 min；e）加入200 rL缓冲液SH,震荡混匀，置冰上5 min；f）12000 r pm 离心 3 min；g）将上一步所得上清液转移至新的1.5 mL离心管，加入等体积缓冲液GFA；h）将上一步所得溶液加入吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12000 r pm离心30 s,倒掉废 液，将吸附柱CR2放入收集管中；i）向吸附柱CR2中加入500叱缓冲液GD,12000 r pm离心30 s,倒掉废液，将吸附柱CR2放 入收集管中；j）向吸附柱CR2中加入700心漂洗液PW,12000 r pm离心30 s,倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中；k）重复操作步骤j；1）将吸附柱CR2放回收集管中，12000 r pm离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；m）将吸附柱CR2转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50 flL洗脱缓冲液TB,室温 放置2 min5 min,12000 r pm离心2 min,将溶液收集到离心管中，即样品DNA。15