基于1,3-二氯-7-羟基...)的近红外荧光探针研究进展_马延慧.pdf

有机化学有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW *Corresponding authors.E-mail:; Received June 23,2022;revised June 31,2022;published online September 8,2022.Project supported by the Graduate Student Innovation Ability Training Project of Hebei Province(No.CXZZSS2022101).2022 年河北省在读研究生创新能力培养(No.CXZZSS2022101)资助项目.94 http:/sioc- Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 DOI:10.6023/cjoc202206044 综述与进展综述与进展 基于 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)的 近红外荧光探针研究进展 马延慧 武宇乾 王晓旭 高 贵*周 欣*(河北农业大学理工学院 河北沧州 061100)摘要摘要 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)是一种优异的近红外荧光染料,具有近红外发射、低 pKa值(5.0)、高水溶性以及高量子产率(0.39),近年来在荧光探针领域受到广泛关注.研究证明,以该染料设计合成的荧光探针可以在温和的水溶液中工作,具有反应迅速、选择性和灵敏度高、检测限低以及比色信号变化明显等优异的传感性能.此外,该类探针的细胞毒性低,对于活细胞和生物体的检测具有显著的应用价值.综述了基于 DDAO 及其衍生物的荧光探针的研究进展,主要包括探针在生物酶、活性氧、活性氮、蛋白质以及 Pd0的识别检测中的分子设计、作用机理和应用,并对该类荧光探针的发展前景进行了展望.关键词关键词 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO);荧光探针;近红外;检测 Research Progress of Near-Infrared Fluorescent Probes Based on 1,3-Dichloro-7-hydroxy-9,9-dimethyl-2(9H)-acridone(DDAO)Ma,Yanhui Wu,Yuqian Wang,Xiaoxu Gao,Gui*Zhou,Xin*(College of Science and Technology,Hebei Agricultural University,Cangzhou,Hebei 061100)Abstract 1,3-Dichloro-7-hydroxy-9,9-dimethyl-2(9H)-acridone(DDAO)is an excellent near-infrared fluorescent dye with near-infrared emission,low pKa(5.0),high water solubility and high quantum yield(0.39),which has attracted much attention in recent years in the field of fluorescent probes.The researches prove that the fluorescent probes designed and synthesized based on this dye can work in mild aqueous solutions,and have excellent sensing performance,such as rapid reaction,high selectivity and sensitivity,low detection limit and obvious colorimetric signal change.In addition,the low cytotoxicity of this class of probes is of significant application for the detection of living cells and organisms.The research progress of fluorescent probes based on DDAO and its derivatives,mainly including the molecular design,action mechanism and application of probes in the recognition and detection of biological enzymes,reactive oxygen species,reactive nitrogen species,proteins and Pd0,is reviewed,and the development prospect of this type of fluorescent probes is prospected.Keywords 1,3-dichloro-7-hydroxy-9,9-dimethyl-2(9H)-acridone(DDAO);fluorescent probe;near infrared;detection 荧光探针是一种结合了分子识别和荧光技术的生物传感器,通常由荧光团和识别基团通过连接臂以共价键的形式连接而成.对特定的分析物或环境响应时,探针自身的荧光性质会发生改变,以此作为检测和识别的信号1-2.与传统的检测方法(电位法、极谱法或比色法)相比3-5,荧光探针具有操作简单、选择性好、灵敏度高、检测范围广、响应速度快以及对样品损伤小等优点6-7,已经被成功应用于生物医学、生命科学及环境科学等领 域8-9.荧光探针不仅可以检测阳离子和阴离子10-12,还可以检测活性氧13-15及硫化氢等小分子化合物16-18,近年来检测生物酶19和细菌20-21等生物活性物质的荧光探针也越来越多.最值得一提的是,由于部分荧光探针具有良好的生物相容性、高灵敏度、无创性、稳定的发射特性和实时成像等优点,使得基于荧光探针的生物成像技术发展迅速,现在已成为可视化多种生理和病理过程的有力工具22-24.但令人遗憾的是,发射波长小于600 nm 的荧光探针在进行活体荧光成像时组织穿透性差,会产生组织损伤,同时受到机体自发荧光的干扰,Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 限制了它们在活体成像方面的应用25-27.近红外(NIR)荧光探针的发射波长位于 650900 nm 之间,这些较长波长的光子在生物体内可以减少环境引起的光散射,具有更强的组织穿透能力,受到内源性色素团的干扰更少,通常在细胞成像过程中造成较少的光损伤.因此,近红外荧光成像方法被广泛应用于复杂的生物系统,成为荧光探针领域的研究热点.目前,常用的近红外荧光团有二氰基异佛尔酮类28-30、苯并吡喃腈31-33、菁染料34-36、半菁染料37-39、氧杂蒽衍生物40-42、氟硼吡咯43-45及 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)46-47等.其中,DDAO 荧光团拥有很多优良的特性48-51.首先,受自身结构中分子内电荷转移(ICT)效应的影响,DDAO 分子的激发和发射波长(分别为 600 和 660 nm)均处于相对近红外区域,使其可以免受生物背景信号的干扰;其次,它的 pKa值相对较低(5.0),具有一定的水溶性,在磷酸缓冲溶液(PBS)中具有高量子产率(0.39);更重要的是 DDAO 荧光团带有暴露的可修饰羟基,可作为设计和开发荧光探针的理想荧光支架52.此外,通过对 DDAO 荧光团进行改造,例如将羟基改造为给电子能力更强的氨基53-54或者使 DDAO 进一步反应消去与苯环相连的氯原子55,又可以得到其他不同荧光性能的新型吖啶酮类荧光团.研究证明,基于 DDAO及其衍生物的荧光探针可以在温和的水溶液中工作,显示出优异的传感性能,包括反应迅速、高选择性和灵敏度、低检测限、近红外区显著的红移发射以及明显的比色信号变化.同时,这些荧光探针细胞毒性低,可方便地用于活细胞和生物体的检测56-57.因此,近年 DDAO类反应型荧光探针越来越受到人们的关注和研究,其应用于生物体荧光成像的文献报道也越来越多.然而,就我们目前能够查阅到的文献来看,并没有关于 DDAO 荧光探针的总结报道.因此,本文将对已报道的 DDAO 类荧光探针进行综述,主要介绍各种探针的合成及其在识别生物酶、活性氧、活性氮、白蛋白及Pd0时,探针本身结构与物化性能间的变化关系,期望对 DDAO 类功能分子设计合成方面的研究工作提供一些有用的参考信息.1 反应型生物酶荧光探针反应型生物酶荧光探针 1.1 酯酶及脂肪酶荧光探针 结核分枝杆菌(Mtb)作为结核病的病原体,是全球人类健康的重大威胁58,世界卫生组织(WHO)2019 年公布的全球死因数据表明,结核病是单一传染源的头号死亡原因,也是全球第 13 大死因.据 2021 年全球结核病报告,2020 年全球新发结核病患者 987 万,发病率为 127/10 万,病死率为 15%.脂质代谢酶类(酯酶/脂肪酶)在 Mtb 生命周期或其致病过程中发挥着重要作用,Mtb 以代谢宿主的脂质作为休眠和复燃期间的能量来源,这也是其能寄生于巨噬细胞内的关键因素59.因此,脂质代谢酶可以作为 Mtb 的诊断性生物标志物.活化的Mtb酯酶和脂肪酶体外表达和分离困难,因此用电化学法、放射化学法和高效液相色谱法等常规方法难以对其进行表征.生物荧光成像技术可以解决这个难题,它不需要分离酶就能直接检测完整生物体中的酶活性.因此,开发检测脂质代谢酶的近红外荧光探针对于 Mtb的监测具有十分重要的意义.不同谱系的分枝杆菌裂解液中脂质代谢酶的种类和活性不同,将荧光探针加入含分枝杆菌裂解物的凝胶内进行分析检测时,探针与来自不同谱系的分枝杆菌的脂质代谢酶作用,产生荧光带的强度和位置存在显著差异.根据这些不同的荧光条带,可以快速鉴别分枝杆菌的种类与菌株.2013 年 Beatty 等60将 DDAO 用三氧化硫三甲胺硫酸化,合成了响应硫酸酯酶的近红外荧光探针 Probe 1(Scheme 1).在 PBS 中硫酸酯酶将探针水解为 DDAO,同时探针的吸收光谱由 450 nm 红移至 600 nm,发射光谱由 598 nm 红移至 660 nm 处,溶液颜色由黄色变为蓝色并产生强红色荧光,探针溶液的荧光量子产率由0.028 增加至 0.40.该探针的最低检测限为 244 nmol/L,当探针溶液浓度为 mol/L 级别时,便可以在 515 min内快速检测硫酸酯酶.实验检测了 H37Rv、Erdman 和CDC1551 三种 Mtb、牛分枝杆菌(BCG)和堪萨斯分枝杆菌的裂解液,发现所有裂解液都能在 10 min 内水解Probe 1 并产生强度和位置明显不同的荧光带.图式图式 1 Probe 1 响应示意图 Scheme 1 Probe 1 response diagram 2015 年该课题组61又以 DDAO 和溴甲基乙酸酯为原料合成了 Probe 2 和 Probe 3 两种互为区域异构体的近红外荧光探针(Scheme 2),用以检测脂质代谢酶.在 pH7.4 的 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液中,探针 Probe 2(abs/em465/625 nm,0.07)和Probe 3(abs395 nm,没有荧光产生)表现出不同的光 有机化学 综述与进展 96 http:/sioc- Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 谱特性.当在探针溶液中加入脂质代谢酶时,乙酰氧基甲基醚掩蔽部分被水解成羟基,在 646 nm 处的吸光度和在 660 nm 处的荧光强度显著增强.当将其用于检测来自猪肝、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的三种酯酶以及来自曲霉属的 9 种脂肪酶时,发现所有酶都能够在10 min内快速水解探针,并产生显著的荧光信号.随后作者对 Erdman、H37Rv 和 CDC1551 三种Mtb、非洲分枝杆菌和 BCG 等能够诱发结核病的菌株裂解液进行检测,发现所有裂解液都能够在10 min内快速水解探针,产生的荧光带中,荧光强度和位置有明显不同.但遗憾的是,由于Probe 2和Probe 3识别基团的碳链较短,在识别 Mtb 和 BCG 这两个关系密切的物种时,凝胶内不能产生完整的荧光带,因而不能够很好地区分Mtb 和 BCG.2016 年 Beatty 课题组62对 Probe 2 和 Probe 3 进行了进一步研究,用丁酰氧基甲基醚和辛酰氧基甲基醚代替原来探针分子中的乙酰氧基甲基醚,将碳链长度由原来的二碳分别增加至四碳和八碳,设计合成了稳定性更好、对脂肪酶灵敏度更高近红外荧光探针 Probe 4、Probe 5、Probe 6 和 Probe 7(Scheme 3).其中 Probe 4 和 Probe 5 是非荧光的,Probe 6 和Probe 7 的发射波长分别为 613 和 614 nm.这些探针与来自Mtb的酯酶和脂肪酶反应后,能够水解生成DDAO荧光团,在 646 nm 处的吸光度和 659 nm 处的荧光强度明显增强.Probe 5、Probe 7 可以检测出 Probe 2 和Probe 3 未显示的荧光带,能够更好地区分 Mtb 和 BCG的酯酶.由于探针对于分枝杆菌酯酶具有特异性识别,而对宿主细胞酯酶没有响应,因此在Mtb感染的巨噬细胞裂解液中,能够较好地区分分支杆菌酯酶和宿主细胞酯酶.为了获得发射波长更长的荧光团,该课题组63于2016 年利用卡巴嗪取代 DDAO 中心碳原子上的二甲 基,得到了吸收波长为 618 nm、发射波长为 687 nm 的新型荧光团 1,3-二氯-7-羟基-2H-螺吖啶-9,1-环己烷-2,5-二烯-2,4-二酮(DSACO),并以 DSACO 和溴甲基乙酸酯为原料,合成了探针分子 Probe 8 和 Probe 9(Scheme 4).当向探针溶液中添加酯酶或者脂肪酶后,伴随着红色荧光信号的产生,探针分子逐渐水解生成 NClOClHODDAOBrOONClOClOProbe 2OOClClOOProbe 3OON酯酶+Ag2O 图式图式 2 Probe 2 和 Probe 3 的合成及响应示意图 Scheme 2 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 2 and Probe 3 NHOOClClDDAOOIOnNOOClClOONOOOOClCln=2 Probe 4n=6 Probe 5n=2 Probe 6n=6 Probe 7酯酶脂肪酶+K2CO3nn 图式图式 3 Probe 4、Probe 5、Probe 6 和 Probe 7 的合成及响应示意图 Scheme 3 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 4,Probe 5,Probe 6 and Probe 7 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 了 DSACO 荧光团.Probe 8 和 Probe 9 对猪肝酯酶和枯草芽孢杆菌酯酶均有良好的响应,并且对大鼠成纤维细胞中的酯酶有良好的生物成像.1.2 乙酰胆碱酯酶荧光探针 有机磷神经毒剂会抑制人体乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性,破坏乙酰胆碱对神经冲动的传导,从而对人体神经系统产生不可逆的损伤64.人体中的重组哺乳动物对氧磷酶(PON1)能够水解有机磷神经毒剂的 PO键,可作为有机磷中毒的酶解毒剂65.然而,研究发现,野生型 PON1 及其变体 V346A 对毒性较小的有机磷P()光学异构体有很好的活性,而对毒性强的有机磷P()异构体没有效果,据此也可以确定有机磷神经毒剂主要是通过其 P()异构体发挥毒害作用.Amitai 课题组66设想,如果以光学纯的 P()异构体来反向筛选野生型 PON1,一旦得到能够立体选择性水解 P()异构体的 PON1 突变体,将会是酶解有机磷中毒的重大突破.但是,用常规方法进行筛选操作复杂,工作量大.他们通过巧妙的设计,以 DDAO 为荧光团,甲基膦酰氯环己酯、甲基膦酰氯乙酯及 1,2,2-三甲基丙基甲基膦酰氯为识别基团,分别合成了荧光探针 Probe 10、Probe 11 和 Probe 12(Scheme 5),这些探针含有 PO 键,可以作为有机磷神经毒剂的类似物.这样,通过观察有机磷探针的光谱性能变化,就可以方便、快速地观察到有机磷神经毒素与AchE和PON1的作用效果,同时还可以获得光学纯的 P()异构体荧光探针.光谱测定实验表明,三种探针分子均在 436 nm 处有紫外吸收,在 580 nm 处有微弱的荧光发射,但是,由于膦酰基上的烷基取代基不同,这些探针的荧光强度有所差别.当三种探针分子作为有机磷神经毒剂类似物分别与AchE 作用时,发现 Probe 10 对 AchE 的抑制效果最明 图式图式 4 Probe 8 和 Probe 9 的合成及响应示意图 Scheme 4 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 8 and Probe 9 图式图式 5 Probe 10Probe 12 的合成及响应示意图 Scheme 5 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 10Probe 12 有机化学 综述与进展 98 http:/sioc- Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 显;分别与野生型PON1作用时,探针分子的PO键均可被水解得到 DDAO 荧光团,发射强红色荧光.幸运的是,通过分析探针的降解速率和酶解毒时间,发现只有Probe 10 能够快速水解 P()异构体后得到光学纯的P()异构体.因此,他们选用 Probe 10 的 P()异构体用作进一步的实验研究,以反向立体筛选PON1突变体.1.3 胞质磷脂酶 A2 荧光探针 在肿瘤发展过程中,肿瘤细胞利用脂质代谢来维持其快速增殖、存活、迁移、侵袭和转移的需求,肿瘤中脂质代谢的增加促进了前列腺素 E2(PGE2)的产生,从而促进了肿瘤细胞的增殖、逃避凋亡、血管生成和转 移67.胞质磷脂酶 A2(cPLA2)对于PGE2 的合成有非常重要的作用,所以与正常细胞相比,肿瘤细胞中 cPLA2的活性较高,可作为生物标志物68.因此,设计用于选择性检测 cPLA2 的荧光探针对于肿瘤细胞的检测、发现及治疗具有重要的意义.2015 年 Delikatny 课题组46以花生四烯酸偶联不同类荧光团,开发了一系列 cPLA2 荧光探针,通过检测cPLA2对探针的响应,发现以DDAO 为荧光团的Probe 13(Scheme 6)在体外实验中的发光情况最好.核磁共振图谱证实 Probe 13 与 cPLA2 响应后,生成了 DDAO 荧光团,在 625 nm 处的吸光度和 660 nm 处的荧光强度显著增强.对 Probe 13 进行生物成像实验,结果表明Probe 13 可以成功应用于 MDA-MB-231 细胞的肺转移衍生物 4175-Luc细胞以及细胞外肿瘤中的 cPLA2 荧光成像.研究结果表明该探针可能为其他 cPLA2 过表达而诱发的疾病模型成像,例如炎症和动脉粥样硬化.2019 年该课题组69对 Probe 13 进行了进一步的生物荧光成像研究.用代表三阴性乳腺癌的 MDA-MB-231 细胞、代表 HER2 过表达乳腺癌的 SKBR3 细胞、代表雌激素受体阳性乳腺癌的 MCF-7 细胞以及4175-Luc细胞进行癌症细胞成像,将Probe 13分别添加到这些细胞中,观察细胞的荧光变化.结果显示,与Probe 13 响应后,这四种细胞均产生荧光,4175-Luc细胞的荧光强度最高,MDA-MB-231 细胞次之,MCF-7细胞的荧光强度最低.由于荧光强度与 cPLA2 的表达水平高度相关,这表明 4175-Luc细胞中 cPLA2 含量最高.随后将 4175-Luc细胞移植到小鼠体内,设计小鼠肿瘤模型,然后对小鼠静脉注射 Probe 13,体外器官分析显示,随着时间的推移,小鼠的胃、小肠和大肠等参与脂质代谢的器官中都出现荧光且强度不断增加.最后,该课题组还利用Probe 13对活体小鼠乳腺癌细胞中过表达的 cPLA2 成像,并成功进行了乳腺癌组织切除手术.1.4 羧酸酯酶荧光探针 羧酸酯酶 2(CE2)主要分布在哺乳动物的肠和肝中,在各种酯类药物、环境毒物和致癌物的代谢中起关键作用70.CE2 对于抗癌药物的代谢激活有重要影响,因此,近年来 CE2 在癌症治疗方面受到重视.2016 年杨凌等56以 DDAO 和苯甲酰氯为原料合成了探针分子Probe 14(Scheme 7).由于DDAO的羟基被苯甲酰基酯化,阻断了其分子内电荷转移的进程,导致DDAO的荧光完全被猝灭.在37 的PBS中,Probe 14与 CE2 相互作用后,酯键被水解重新得到 DDAO,在662 nm 处有强的红色荧光发射.因此,Probe 14 可以高灵敏度、高选择性地识别 CE2,最低检测限为 0.07 g/mL.通过研究 pH 值对 Probe 14 的影响,发现 Probe 14 在 pH 为 7.09.0 范围内十分稳定,因此对于人卵巢腺癌细胞(SKOV-3,图 1)、正常人肝细胞(HL-7702)和人肝癌细胞(HepG2)、活体小鼠以及小鼠小肠和肝脏等组织的内源性 CE2 成像有很好的应用潜力.图式图式 6 Probe 13 的合成及响应示意图 Scheme 6 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 13 图式图式 7 Probe 14 的合成及响应示意图 Scheme 7 Schematic diagram of the synthesis and response of Probe 14 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 图图 1 SKOV-3 细胞共聚焦荧光图像56 Figure 1 Confocal fluorescence images of SKOV-3 cells56(ad)Cells treated with Probe 14(20 mol/L)and Hoechst 33342(nuclear stain,2 mol/L)at 37 for 20 min;(eg)Cells pretreated with BNPP(CE2 inhibitors,100 mol/L)and further stained with Probe 14(20 mol/L)and Hoechst 33342(2 mol/L).为了进一步了解不同物种的 CE2 对 Probe 14 水解的差异性和相似性,2017 年郝大程课题组71利用人和实验动物(包括小鼠、大鼠、狗、小型猪和食蟹猴)的肝微粒体,对 Probe 14 水解 CE2 的种间差异进行了系统研究.结果发现,所有被测肝微粒体均能将 Probe 14 水解为 DDAO,并产生强红色荧光.动力学分析表明,DDAO的生成速度取决于作用时间和肝微粒体种类,动物肝微粒体中 DDAO 的生成速度均快于人肝微粒体,其中雄性食蟹猴最快.为了确认不同动物肝微粒体中是否确实是通过 CE2 介导 Probe 14 水解,进行了酯酶抑制剂研究.结果显示,在不同肝微粒体中,双(对硝基苯)磷酸酯(BNPP)和洛哌丁胺(LPA)两种 CE2 抑制剂均抑制了 DDAO 的形成,但对氧磷酶抑制剂乙二胺四乙酸(EDTA)和 AchE 抑制剂石杉碱甲(HA)对 DDAO 的形成影响较小,这表明哺乳动物 CE2 在 Probe 14 水解中发挥了重要作用.此外,研究还发现LPA对人CE2介导的 Probe 14 水解抑制效果更加明显.这些结果对 Probe 14 在动物实验中的进一步研究具有重要的指导意义.1.5 -半乳糖苷酶荧光探针-半乳糖苷酶基因(LacZ 基因)是动物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一种报告基因,该基因编码产生的-半乳糖苷酶(-gal)易于检测,且易于与背景蛋白相区别,因此-gal 被用作检测 LacZ 基因表达调控的指标印记72.常用的-gal 检测方法有蓝白斑筛选法、表面增强拉曼光谱法以及电化学法等,这些方法只适用于体外检测-gal,而利用荧光探针进行生物成像,对于实时检测生物体内的分子非常有前途.因此,设计用于体内检测-gal 表达和调控能力的荧光探针具有现实意义.1989 年 Corey 课题组73基于 DDAO 荧光团合成了一系列用于检测-gal的荧光探针.研究发现,这些探针分子具有水溶性良好、响应-gal 灵敏度高、检测限低及产率高等优点.随着荧光检测技术的发展,2004 年Tung 等74对 Corey 课题组设计的探针分子子 Probe 15(Scheme 8)进行了进一步研究.在 PBS 中,Probe 15 在465 nm有紫外吸收,在608 nm处有荧光发射.当Probe 15 与-gal 响应后,糖苷键断裂生成 DDAO 荧光团,吸收波长红移至 646 nm 处,发射波长红移至 659 nm 处,产生强红色荧光.重要的是,与 Probe 15 相比,生成的DDAO 发射波长显示出 50 nm 的红移,使其能够在完整探针的背景下进行特异性检测,这是实现体内成像的理想条件.通过肿瘤细胞成像研究以及活体动物成像研究发现,与天然9L神经胶质瘤相比,表达-gal的9L神经胶质瘤可以通过红色荧光成像检测到,这充分表明了利用荧光成像技术在体内实时检测-gal 活性是可行的.图式图式 8 Probe 15 响应示意图 Scheme 8 Probe 15 response diagram 2009 年 Zhang 等75利用基因敲除技术,将 LacZ 基因引入小鼠的G蛋白偶联受体基因座,得到转基因小鼠模型.在野生型小鼠和转基因小鼠的尾静脉分别注射Probe 15,5 min 后转基因小鼠的头部和肾脏区域显示出显著的荧光强度.对小鼠全脑切片和离体肾脏进行荧光成像研究,发现转基因小鼠全脑切片和离体肾脏的荧光亮度明显增强.对转基因小鼠的-gal 荧光成像表明Probe 15 可用于活体动物体内实时检测 LacZ 基因的活性.在这些研究的基础上,相信 Probe 15 具有用于转基因动物中某些内源性分子和分子途径变化的进行无创成像的潜力.1.6 -葡萄糖苷酶荧光探针 糖尿病是现在社会最严重的慢性疾病之一76.国际糖尿病联合会公布的数据显示,2021 年全球成年糖尿病患者人数达到 5.37 亿,约占全球成年人数的 10.5%,此外,估计有 44.7%的成人糖尿病患者未被确诊,对糖尿病的预防和诊断仍是我们面临的重大挑战.-葡萄糖苷酶在碳水化合物的消化中发挥重要作用77,它可以特异性水解-吡喃葡萄糖苷键,释放葡萄糖分子,造成餐后血糖升高.生物体内的-葡萄糖苷酶活性过高,会导致血糖持续升高,从而诱发糖尿病.因此,检测机体-葡萄糖苷酶的活性对该病的发现和诊断具有重要意义.2018 年钱盟等78利用 DDAO 和-葡萄糖合成了一 有机化学 综述与进展 100 http:/sioc- Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 种新型荧光探针 Probe 16(Scheme 9).在 PBS 中,探针分子在 480 nm 处有吸收,在 620 nm 处有微弱的荧光发射,并且在 pH 6.08.0 范围内,荧光强度几乎没有变化.当 Probe 16 与-葡萄糖苷酶响应后,吸收波长红移至 600 nm 处,发射波长红移至 660 nm 处,并有强红色荧光产生.Probe 16 能够高选择性、高灵敏度识别-葡萄糖苷酶,最低检测限为 3.16 U/L.对 Probe 16 进行生物成像研究,成功检测到了宫颈癌(HeLa)细胞、活体小鼠及小鼠离体肠和胃器官中的-葡萄糖苷酶.将小肠和胃清洗后分别研磨成匀浆,在小肠匀浆或胃匀浆中加入探针溶液,发现随着时间的延长,溶液中荧光强度逐渐增加,进一步证明Probe 16可以检测到小肠和胃中的-葡萄糖苷酶.Probe 16 可以实现在细胞水平和活体水平检测-葡萄糖苷酶,是该酶检测领域的较大突破.图式图式 9 Probe 16 响应示意图 Scheme 9 Probe 16 response diagram 1.7 -葡萄糖醛酸酶荧光探针 非甾体抗炎药(NSAIDs)具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等功能,是全球使用最多的药物种类之 一79.该类药物经肝细胞排泄分泌到胆汁中与葡萄糖醛酸结合,随后在肠道中被-葡萄糖醛酸酶(GLU)水解为原型药物,导致肠肝循环80,使肠细胞反复暴露于药物及其代谢物,长此以往,机体会产生出血、溃疡以及肠道穿孔等胃肠疾病,严重时甚至致命.肠道细菌是肠道中 GLU 的主要来源,开发能够快速、高选择性、高灵敏度检测肠道中GLU的方法,对于NSAIDs诱发的肠病诊断和治疗具有重要意义.2018年马骁驰等81将-葡萄糖醛酸与DDAO结合,设计合成了探针分子 Probe 17(Scheme 10).当 Probe 17 与 GLU 响应时,水解生成 DDAO 荧光团,溶液由淡蓝色变为黄色,最大吸收峰红移 185 nm,在 660 nm 处可以观察到强的荧光发射.研究 pH 值对 Probe 17 荧光强度的影响,发现在 pH 6.012.0 的范围内,Probe 17对 GLU 均具有优异的红色荧光响应.实验表明,Probe 17 能够在生理条件下快速、选择性地检测细菌的 GLU,在临床实验中可以实时检测人及其他复杂生物系统肠道细菌中的 GLU.同时,Probe 17 已被成功应用于细菌生物膜、细菌菌体以及活体细菌内 GLU 的可视化,清楚地观察到了肠道 GLU 在肠肝循环中的真实分布(图 2).通过高通量筛选,利用Probe 17成功地找到了一种有效的天然 GLU 抑制剂表儿茶素没食子酸酯,可以有效地预防NSAIDs诱导的肠病的发生.在生理和病理过程中,Probe 17 可作为一种强有力的工具用于探索肠肝循环中肠道 GLU 的实际生理功能,并用来在临床上开发新型 GLU 抑制剂,以治疗急性药物性肠病.图式图式 10 Probe 17 响应示意图 Scheme 10 Probe 17 response diagram 图图 2 (A)平板培养基中肠道细菌的荧光图像和(B)肠道细菌的共聚焦荧光图像81 Figure 2 (A)Fluorescence images of intestinal bacteria in platemedium and(B)confocal fluorescence images of intetinal bacteria81 Staining with Probe 17(DDAO-GLU,20 mol/L)for 1 h at 37 to determine intracellular GLU activity.Baicalin as the inhibitor of GLU was pretreated for bacteria before Probe 17 incubation 1.8 漆酶荧光探针 漆酶作为多酚氧化酶,可以催化氧化二酚、多酚、芳香胺和苯硫醇衍生物等多种有机化合物,是一种环境友好型的生物催化剂82.漆酶广泛存在于细菌、真菌及植物中,其中,真菌漆酶的热稳定性及催化氧化性最好,更符合现代社会对于环保的要求,因此,成为众多学者的研究对象83.目前,通常使用比色法测定漆酶活性,Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin.J.Org.Chem.2023,43,94111 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 但是该方法存在底物吸收干扰以及酶失活等缺点,在测定漆酶活性时准确性和灵敏度降低,而荧光检测技术可以解决这些不足.因此,开发用于检测漆酶的荧光探针非常必要.2019 年马骁驰课题组84以 DDAO 为荧光团,乙酰基为特异性识别基团,设计合成了反应型漆酶荧光探针Probe 18(Scheme 11).当 Probe 18 被漆酶氧化时,随着乙酰基离去,DDAO 形成,随之 658 nm 处产生强红色荧光发射,溶液由无色变为蓝紫色(图 3).利用 Probe 18对外源性以及真菌内源性漆酶进行荧光成像,结果表明,Probe 18 不仅可以高选择性、高灵敏度地检测外源性漆酶,而且能够对真菌菌丝和菌落的内源性漆酶实时成像.利用Probe 18检测了24种真菌的漆酶活性,发现米根霉 As 3.2028 的漆酶高表达.因此,Probe 18 的开发促进了对内源性真菌漆酶的研究,有助于开发基于生物转化的新型候选药物.1.9 人胰脂肪酶荧光探针 人胰脂肪酶(hPL)是一种重要的消化酶,由胰腺外分泌细胞合成47后通过胰管分泌到胃肠道系统,该酶催化约 70%的膳食脂质水解,从而调节人体对脂质的消化和吸收.目前,hPL 抑制剂疗法已被证实是预防和治疗肥胖以及与肥胖相关疾病的有效方法.除此之外,hPL 也是一些胰腺疾病的生物标志物,如慢性胰腺炎、胰腺出血和胰腺癌85.小分子荧光成像有成本低、灵敏度超高、易于操作、设计灵活以及实时响应等优点,适合用于实时、原位监测目标酶活性.因此,设计合成用于 hPL 检测和成像的荧光探针具有十分重要的意义.考虑到 hPL 更偏向于水解油酸等具有长脂肪酸链的酯类,2021 年葛广波等57以 DDAO 和油酰氯为原料,合成了高特异性荧光探针 Probe 19(Scheme 12).Probe 19与hPL响应后,酯键被快速水解,