基于细胞3D打印技术的肿瘤药物筛选细胞芯片研究.pdf

3 3卷 2 期 2 0 1 4年 4月 中 国 生物 医学工 程学报 C h i n e s e J o u r n a l o f B i o m e d i c a l E n g i n e e r i n g Vo 1 3 3 No 2 Ap r i l 2 01 4 基 于细胞 3 D打印技术的肿瘤药物筛选细胞芯片研究 赵占盈 徐铭恩 石 然 郭 淼 严 明 徐 莹 王 玲 ( 杭州电子科技大学生命 信息与仪器工程学 院，杭州 3 1 0 0 1 8 ) 摘要 ： 现 有的药物筛选评价技术 中， 动物筛选 模型存 在种属 差异 和周期长 等缺点 ， 高通 量筛选 和细胞 筛选模 型 则与体 内环境差异 大 ， 药物筛选准确率低 。细胞 3 D打印技术 为在 体外 构建 仿真的组织器官模型提供 了可 能 ， 当其 与细胞芯片技术结合则 为体外构建 高效准确的药物筛选 模型提供 了新 的技术 空间 。本研究 构建 了含有 多个 叉指 电极( I D E s ) 阵列 的细胞 芯 片 ， 用 细胞 3 D打印 技术 在 芯片 上组 装 了卵 巢癌 细 胞 H O 一 8 9 1 0和人 肝 间 充质 干 细胞 H MS C H组 织模型 ， 并通过 对组 织模 型 内细胞阻抗变化 的检测 ， 反映细胞生 长、 贴 附 、 增殖 、 凋 亡的过程及 药物对细 胞 活性的影响等 ， 最终基于该模型检测 了抗癌药物顺 铂和 环磷酰胺 对肿瘤 细胞 的杀 伤和肝 毒性 。结果 显示 ： 支架 微 丝直径和孔径约为 2 0 0 3 0 0 m， 肿瘤 细胞和肝细胞在三维结构 里生长 良好 ； D ME M 作为 电解液 ， 芯片在 1 O H z 可准确检测到三维结构 中细胞增殖 引起 的阻抗 变化 ， 2 0 h后阻抗升高 6 9 6 ； 基于该筛选模型 ， 能同步检测到药物 的抗肿瘤作用和肝毒性 ， 并筛选 出需要肝 的二次代谢产 物才 能产 生抗 肿瘤 性的药物环磷 酰胺。 关键词 ： 细胞 3 D打印 ； 细胞芯片 ； 药物筛选 ； 叉指 电极 ； 支架 中图分 类号 R 3 1 8 文献标志码A 文章编号 0 2 5 8 8 0 2 1 ( 2 0 1 4 ) 0 2 - 0 1 6 1 -09 Re s e a r c h o f An t i - Tu mo r Dr ug S c r e e n i n g Ce l l Ch i p Ba s e d o n 3 D Ce l l Pr i n t i n g Te c h n i q u e ZHAO Z h a n- Yi n g XU Mi n g En S HI Ra n GUO Mi a o YAN Mi n g XU Yi n g W ANG L i n g ( C o l l e g e o f L if e l i n f o r m a t io n S c ie n c eI n s t r u m e n t E n g i n e e r i n g ，H a n g Z h o u D i a n Z i U n i v e r s i t y ， H a n g z h o u 3 1 0 0 1 8 ，C h i n a ) Ab s t r a c t ：T h e r e a r e s o me c r u c i a l p r o b l e ms i n c o n v e n t i o n a l d r u g s c r e e n i n g s y s t e ms F o r e x a mp l e，a n i ma l mo d e l s h a v e s h o r t c o mi n g s o f s p e c i e s d i f f e r e n c e s a n d l o n g t e s t p e r i o d s ；i n a d d i t i o n，p o o r mi mi c s o f i n v i v o mi c r o e n v i r o n me n t r e s u l t s i n t h e l o w a c c u r a c y o f c e l l b a s e d h i g h t h r o u g h p u t d r u g s c r e e n i n g a s s a y s Th e 3 D c e l l p r i n t i n g t e c h n o l o g y ma y p r o v i d e s o l u t i o n s o f e s t a b l i s h i n g b i o mi me t i c t i s s u e mo de l s i n v i t r o Mo r e o v e r ，t h e c o mb i n a t i o n o f 3 D c e l l p r i n t i n g a n d c e l l c hi p p r o v i d e s a h i g h l y v a l u a b l e t o o l f o r t he e f f i c i e n t a n d a c c u r a t e d r u g s c r e e n i n g i n v i t r o I n t h i s s t u d y， a c e l l c h i p i n t e g r a t i n g s e v e r a l g r o u p s o f I DEs ， wa s d e s i g n e d a n d ma n u f a c t u r e dT h e n，t h e HMS C- H a n d HO 一8 91 0 c e l l l i n e s we r e a s s e mb l e d wi t h i n t h e g e l a t i n a l g i n a t e mi x t u r e o n t h e ma n u f a c t u r e d c h i p u s i n g 3 D c e l l p r i n t i n g Th e I DEs wa s u s e d t o d e t e c t c h a n g e s i n t h e c e l l i mp e d a n c e wh i c h r e f l e c t s t h e c e l l g r o wt h，a d h e s i o n，p r o l i f e r a t i o n，a p o p t o s i s a n d e f f e c t s o f d r u g s o n t h e v i a b i l i t y B a s e d o n t h i s c e l l s - l o a d e d c h i p，t h e a n t i t u mo r e f f e c t o r h e p a t o x i c i t y o f b o t h CT X a n d DDP we r e me a s u r e d r e s p e c t i v e l y Ou r r e s u l t s s h o we d t h a t t h e 3D s t r u c t u r e c o u l d s u p p o t t h e g r o wt h o f HMS C H o r HO 8 91 0 c e l l s T h e s c a f f o l d p o s s e s s e d p o r e s wi t h d i a me t e r o f 2 0 03 0 0 Ix mTh e c h a n g e o f i mp e d a n c e c a u s e d b y t h e c e l l p r o l i f e r a t i o n wa s p r e c i s e l y d e t e c t e d b y t h e c h i p a t 1 0 Hz u s i n g DMEM a s e l e c t r o l y t e s o l u t i o n，2 0 h l a t e r ，t h e c e l l i mp e d a n c e i n c r e a s e d b y 6 9 6 Us i n g t h i s c h i p- b a s e d i n v i t r o d r u g s c r e e n i n g mo d e 1 we s i mu ha n e o u s l y d e t e c t e d t he a n t i t u mo r e f f e c t a n d h e p a t o t o x i c i t y o f t h e d rug s Me a n wh i l e，t h e e ffic a c y o f t h e s e d r u g s ，wh i c h r e q u i r e h e p a t i c me t a b o l i s m f o r a c t i v a t i o n s u c h a s CT X。wa s a l s o e v a l u a t e d i n t h e s a me c h i p d o i ： l 0 3 9 6 9 j i s s n 0 2 5 8 8 0 2 1 2 0 1 4 0 2 0 0 5 收稿 日期 ： 2 0 1 3 1 1 3 0，录用 日期 ： 2 0 1 4 - 0 3 - 0 6 基金项 目：国家 自然科 学基金 ( 8 1 3 7 1 6 9 5 ，6 1 1 0 8 0 8 3 ) ； 浙江省科技计划( 2 0 1 1 C 2 3 0 3 1 ) 通信作者 。E - m a i l ：x u m i n g e n h d u e d u c n 1 6 2 中 国生物医学工程学报 3 3卷 Ke y wo r d s： 3 D c e l l p r i n t i n g；c e l l c h i p；dr u g s c r e e n i n g ；I DEs ；s c a f f o l d 引言 近 年来 ， 随着 3 D打 印技 术 的不 断 发展 ， 在 生 物 医学工程领域的应用也越来越广泛。 目前 ， 研究者 已经开发出多种可 以将细胞 材料打印成三维 结构 的技术。如： 细胞打 印技术 ( C e l l p r i n t i n g ) 、 生物 3 D打印技术( 3 D B i o p l o t t e r ) 以及本实验室开发出 的细胞 3 D打印技术( 3 D c e l l p r i n t i n g ) ， 可操控活 细胞 ， 打 印 出利于 细 胞 粘 附 、 生 长 、 迁 移 和 分 化 的 三 维结构。细胞 3 D打印技术 已可 以在体外构建复杂 的类组织和器官 ， 为生命科学 多个领域拓展了新的 理论和技术可能。在 药物筛选领域 ， 现有的动物筛 选模型存在种属差异 和周期长等缺陷 ， 而高通 量筛 选技术则与体 内环 境差异大 ， 导致筛选 准确率低 。 细胞 3 D打印为在体外用人体细胞构建复杂的多组 织系统药物筛 选模 型提供 了可能。本实 验室 的研 究也证 明， 可用细胞 3 D打 印技 术构建更准确 的药 物筛选模型 。但是如何实时 、 高通量和无损检测 这种类组织系统信号变化 ， 是其用于高通量药 物筛 选亟待解决的问题。 细胞 芯 片是通 过 将 芯 片 与 细 胞结 合 ， 在 芯 片上 完成对细胞控制和检测生理变化， 实现对活细胞实 时 、 高通量 、 原位信号检测 的技术 。近年来 ， 细 胞 芯 片 正 逐 步 从 “ c e l l o n c h i p ”向 “ T i s s u e mo d e l ， l i v i n g s y s t e m o n c h i p ” 发展， 即在芯片上构建复杂 的 组 织 、 器 官 模 型 。 如 H a r v a r d大 学 的 I n g b e r D E 和 C o r n e l l 大学的 S u n g J H 分别在芯片上构 建了微组织模型， 研究显示在药物领域有 巨大 的应 用价值 。然而 ， 如何将不 同细胞精确定位装配到芯 片上并形成功能组织结构 ， 是 目前在芯片表 面构建 组织模型尚待解决的问题。细胞 3 D打印技术是构 建组织模型芯片最具潜力 的技术 ， 其与细胞芯片技 术的结合， 为构建准确 、 高效 、 高通量 的多组织系统 药物筛 选模 型提 供 了可 能 。 本研究提 出用细胞 3 D打印和细胞芯 片技术， 构建一个包括肿瘤和肝组织 的体外肿瘤药 物筛选 模型芯片。药物在体 内的作用 过程涉及 多个组织 和器官 ， 其 中最关键 的是靶组织 和药物代谢 组织。 肝组织对 药物的代谢不但影响药物 的清除时间， 代 谢产生的二次代谢产物有时也是产生药效的关键， 而药物的肝毒性则构成了药物的主要副作用 。 本研究首先设计制造含多个 I D E s 阵列的细胞芯片； 然后选择不 影响细胞 电生理检测 的生物材 料 固定 细 胞 ； 通 过 对 比铁 氰 化 钾 溶 液 、 P B S溶 液 和 D ME M 三 种 电解液 对细胞 阻抗 变 化 的 检 测 ， 选择 合 适 的 电 解液及阻抗测试频段 ； 用 细胞 3 D打印技 术在芯片 表 面组 装卵 巢癌 细胞 H O一8 9 l 0 ， 检 测细 胞 贴 壁 、 迁 移 、 增 殖 等 引 起 的 阻 抗 变 化 ， 并 与 生 化 检 测 法 ( A l a m a r b l u e ) 的结 果 作 比照 ； 最 后 ， 在 由两 组 I D E s 构 建 的循 环 系统 中组 装人肝 间充 质 干细 胞 HM S C H 和 H O一 8 9 1 0 ， 并检 测顺 铂 D D P和环 磷 酰胺 C T X的 抗肿瘤作用及肝毒性。 1 材料和 方法 1 1 细胞 3 D 打 印平 台 细胞 3 D打印技术是基于离散 堆积原理 ， 在计 算机的控制下 ， 以活细胞 为操控对象 ， 按照 预先 构 建的 3 D模型准确定位与输送细胞材料复合物。本 研究使用的细胞 3 D打 印平台是一款本 团队自主研 发 的生物 3 D打 印 机 ( R e g e n o v o ， 杭州 捷 诺 飞 生物 科 技有 限公 司 ) 。 图 1 ( a ) 即 为 所 用 的 生 物 3 D 打 印 成 型 系 统 图 1 细胞 3 D打印技术。 ( a )生物 3 D打 印机 ； ( b) 生 物 3 D 打 印 机 系 统 图 F i g 1 3 D c e l l p r i n t i n g t e c h n i q u e ( a)3 D c e l l p r i n t i n g d e v i c e ： ( b)S y s t e m d i a g r a m o f 3 D c e l l pr i nt i n g de v i c e 竺一 一 一 LTj 一 软一一 软一 一 理一一 制一 一 一 处一一控一 一 一 一 据一一统一 一 一 统一 一 统 系一 一 系 件一 一 件 软一 一 硬 2期 赵 占盈 ， 等 ： 基 于细胞 3 D打印技 术的肿瘤药物筛选细胞芯片研究 机 ， 图 l ( b ) 是 生物 3 D打印机 系 统 图。 该 生 物 3 D打 印机 成 型 系统 包 括 软 件 系统 、 硬 件系统 2个部分。软件 系统包括数 据处理 软件和 系统控 制软 件 ， 能精确 控制 打 印过程 。硬 件 系统 分 为控 制 系 统 和 机 械 系 统 ， 控 制 系 统 包 括 运 动 控 制 卡 、 温 度 控 制 系 统 以及 材 料 运 输 控 制 电 路 等 硬 件 电路 ； 机 械 系 统 包 括 四 轴 运 动 系 统 、 制 冷 模 块 等。四轴 运 动系统 中， 3个 伺 服 电机控 制 喷头 在 X Y Z方 向 的 精 确 定 位 ， 一 个 步 进 电 机 控 制 材 料 挤 出 。 1 2细胞 芯片 的设 计和 制造 细 胞 电 阻 抗 传 感 器 ( e l e c t r i c c e l l s u b s t r a t e i mp e d a n c e s e n s o r ，E C I S ) 是一种能够 同时测量多组 不 同细胞 的 电 阻 变化 、 膜 电 容 变化 ， 以及 细 胞层 基 底膜空间变化 的细胞生理 与病理研 究的细胞传感 器 。通 过 微安级 的 电流 测量 ， 可 以实 时 连 续 地 量 化 研究细胞外基质与细胞增殖之 间的相互作用 ， 测量 贴 壁 细胞 迁 移过 程 中 的细 胞 形 态 变 化 。其 测量 原 理 如图 2所示 ， 细胞 的贴 附 、 伸展 、 黏连 、 增殖 和凋 亡等都会影响阻抗值 。 金电极 细胞接种 细胞贴附 细胞伸展 细胞增殖 细胞凋亡 图 2 阻抗 随细胞数 目和形态改变而变化 Fi g 2 I mpe da nc e v ar i e s wi t h t he c e l l numbe r a nd mor p hol og y 本 研 究 选 取 了 E C I S中研 究 较 多 的 叉 指 电 极 ( i n t e r d i g i t a t e d e l e c t r o d e s ， I D E s ) 作 为 芯片表 面传 感 器。I D E s 具有高通量 、 微型化 、 灵敏度高 和信 噪 比 好等优点 。本实验室和细胞芯片公司合作 ， 采 用了集成八组 I D E s 阵列的细胞芯片 ， 每四组为一个 单元 ， 两个单元相互独立 ， 每组 I D E s 都能打印不同 的细胞 ， 能够 实时监测细 胞的生长、 繁殖 、 毒性 、 粘 附及形 态 变化 等 生 物 学 反 应 过 程 。 图 3 ( a ) 为单 组 叉指电极设计图， 图 3 ( b ) 为叉指电极区放大 图。 在该设计中， 每组叉指 阵列有 6 2对叉指 电极 ， 分为两部分， 间距 1 m m， 便 于在显 微镜下观察 细胞 生 长状 况 。 电极 间距 约 为 3 0 m， 矩 形 区 电极 长度 为 6 mm， 单个叉指采用“ 圆在线上” 的串珠状结构 ， 圆的 直 径 约 为 9 5 m， 增 大 了 电极 面积 和 细 胞 贴 附 到电极上的概率 ， 能够更灵敏地监测活细胞的生长 状 况 。 本研究还采用 了一款之 前设计 的传 统梳状叉 指电极作为对照实验。每组叉指阵列有 3 0对叉指 电极， 单个叉指宽度及电极间距均为 3 0 m， 长度为 0 9 mm， 如 图 4 。 1 3 基质 材料 的制 备及 支架 的打 印 基于 对细 胞外 基 质 的 仿 生 、 材 料 成 型 特性 和 细 胞 电生理检测技术需求 ， 本研究选取明胶和海 藻酸钠 ( S i g m a ，U S A) 为 基 质 材料 。取 2 mg明胶 和 2 m g海藻酸钠 ， 各溶于 1 0 mL超纯水。将两种材料 按 1 ： 1 混合均匀 ， 4 C保存。 人 肝 间 充 质 干 细 胞 ( h u m a n m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s h e p a t i c ，HMS C H)用 D ME M L G( d u l b e c c o S ( b ) 图3细胞 芯片图。 ( a )单组叉指 电极示 意图 ； ( b )叉指 电极局 部放大 图 F i g 3 Th e c e l l c h i p ( a )Th e s c h e ma t i c i l l u s t r a t i o n o f a g r o u p o f I D E s ；l b)A l o c a l e n l a r g e d p h o t o o f( a ) m o d i f i e d e a g l e S m e d i u m l o w g l u c o s e ， S i g m a ，U S A) 培养 于 3 7 o C、 5 C O 培养 箱 中。培养 基 中含 有 1 0 胎牛血清 、 1 0 0 U mL青霉 素、 1 0 0 g mL链霉 素及 2 mM谷 氨酰胺 ， 3 4 d换 液一 次， 细胞 汇合 后 ， 进行常规传代培养心 。卵巢癌细胞系 H O 8 9 1 0 中 国 生物 医学工程学报 叠圊 图 4传统梳状 叉指 电极 Fi g 4 Tr a di t i o na l c omb- l i ke e l e c t r od e s 细胞 用 D MEM( d u l b e c c o S mo d i f i e d e a g l e S me d i u m， S i g m a ，U S A)+1 0 胎 牛 血 清培 养 于 3 7 C、 5 C O 2 培养箱 ， 2 3 d细胞达到单层汇合 ， 细胞汇合后 ， 进 行 常规传 代 培 养 。实 验 前将 培养 的细 胞 和 基 质 材料混合， 得到浓度约为 11 0 。 mL的细胞 一基质 材料 。 将 喷头 及成 型 平 台温 度 降 至 4 C， 将 细 胞 一材 料共 混物 吸入 喷 射腔 ， 选 用 1 2 0 IL m 的喷 头。用 S o l i d Wo r k s 设 计 三维模 型 ， 在 生物 3 D打 印机 控制 软 件 3 D 。 B i o p r i n t 内加 载 三 维 模 型 ， 设 置 合 适 的 高 度 、 速度 、 层厚 、 轮廓等相关参数 ， 对 3 D模型进行分层 处理 生成 G c o d e文 件 。3 D B i o p r i n t 读 取 G c o d e文 件 ， 按照设定的成型参数直接驱动喷头在芯片表面 组装 出三维结构。成型后使用 5 的 C a C I 溶液交 联 ； 加 含 有 1 0 F B S的 D ME M 培 养 液 ， 3 7 c I = 、 5 C O ， 环境 下培 养 2 4 h 。 1 4芯片 测试 研究使用电化学站( 上海辰华 C HI 6 6 0 c ) 和实时 无标记细胞功能分析仪( 艾森生物 i C E L L i g e n c e ) 对芯 片进 行 电化学 交流阻抗 测试 。以 p H为 7 2的铁 氰化 钾溶液 ( 含 1 0 m L浓 度 为 0 1 M 的铁 氰化钾 F e ( c N) 溶液 、 1 0 mL浓度为 0 1 M的 亚铁氰化钾 F e ( C N) 一 溶液和 8 m L P B S溶液) 为 标准 电解 液体 系。分别 在 以下 4种情 况下 测试 I D E s电极 的阻抗 ： ( 1 ) p H为 7 2的铁氰 化钾 溶液作 为 电解 液 。 ( 2 ) 纯 P B S溶液作为电解液。 ( 3 ) 不 含 胎 牛 血 清 的 D ME M 培 养 液 作 为 电 解 液 。 ( 4 ) 不 含胎牛血清 的 D ME M 培养液作 为电解 液 ， 并在芯片表面打印基质材料。 多细 胞 阻抗 测试 系统 原 理 图如 5 ( a ) 。 图中 A、 B两个连通的培养腔底部均有一组 I D E s ， 腔 内液体 的循 环 流通 由微蠕 动泵 实现 ， 两组 I D E s 表 面可 以分 别 组装肝 细胞 和 肿瘤 细 胞 。图 5 ( b ) 显 示 为单 个 培 养腔内的细胞 材料支架放置 图， 支架沿液体流动 方 向存在通道 ， 保证细胞摄取营养和排泄废物。图 5 ( e ) 为改装后 的芯片实物图。支架底部与芯片表 f el 图 5细胞 阻抗测试 系统。( a 】多细胞 阻抗测试 ； ( b ) 芯片改装实物 图； ( C )单个腔 内支 架放置 图 ； ( d)支 架 内细胞在芯片表面生长 图； ( e ) 细胞生长局部 图 F i g 5 Ce l l i mp e d a n c e me a s u r i n g s y s t e m ( a) Mu l t i c e l l u l a r i mp e d a n c e me a s u r e me n t ； b )R e t r o fi t o f c e l l c h i p；( C )A s c a ff o l d p l a c e d i n a c h a mb e r ； ( d)Ce l l s i n t h e s c a ffo l d g r e w o n t h e s u r f a c e o f c e l l c h i p ；( e )A l o c a l e n l a r g e d p h o t o o f( d ) 2期 赵 ， 等 ： 基于细胞 3 D打 印技术 的肿瘤 药物 筛选 细胞 芯片研究 l 6 5 面部分 接触 ， 细 胞在 初 期 只能 粘 附 在 芯 片 与支 架 接 触 的 区域 ， 细 胞 向非 接 触 区 电极 的增 殖 、 迁 移 形 成 阻抗 的变化， 如 图 5巾( d ) 和 ( e ) 所示 。I D E s用作 阻抗 测试 时 主要 采 用 两 电极 电路 ， 即工 作 电极 和 对 电极 ， 由于 二 者 的 尺 寸 相 同 ， 细 胞 对 总 阻 抗 测 量 的 贡献在任何位置 上都等同， 从而减 少了大量溶液阻 抗 的影 响 。电化 学站 的工 作 电极连 接 I D E s的一端 ， 参 比电 极和对 电极与 I D E s 另一 端相 连 ， 电化 学站 既 可 以在 l H z l O 0 k H z 频 率范 围 内测 量 交 流 阻抗 变 化 ， 也能 在 固定频 率 下 进 行 阻 抗 一时 间测 试 。细 胞 芯 片放入 3 7 、 5 C O ： 培 养箱 内 ， 以避免 测试 过 程 中受到外部环境变化 的影响。开路 电位下测 量电 化学阻抗谱 ， 金电极的开路 电位 E w e= 0 2 0 V 。测 量数 据 密度 为 1 2 p o i n t s d e c a d e ( 1 0倍 频 率范 围 内取 l 2个频率点 ) ， 每个频率点测量次数为 2 ， 交流电压 幅值为 5 m V， 频率范围为 l Hz 1 0 0 k H z 。 2 结果 为了给细胞提供一个更接近体 内的生长环境 ， 本研究模 仿人体组 织器官 的结构 和功能设计 出三 维模 型 ， 并 将 细 胞 一基 质 材 料 在 芯 片 表 面组 装 成 型。通过构建三维模 型、 设 置分层参数和修改扫描 路径 ， 能够打印出外形轮廓和内部微通道形状各异 的 支架结 构 ， 如 图 6所 示 。图 6中 ( a ) 和 ( b ) 分 别 是 微通 道 为 四边 形 和三 角形 的支 架 ， 图 6 ( C ) 为 四边 形 微通道显微镜 图片， 图 6 ( d ) 为细胞 免疫荧光 染色 图。 由图可 以看 出 ， 打 印 的 支 架 微 通 道 结 构 清 晰 ， 四边 形 微通 道结 构 的微 丝 直 径 在 2 0 03 0 0 Ix m， 小 孑 L 尺寸约 2 0 0 I x m， 孔 隙率可 以达 到 6 0 。荧 光显 微 镜显 示细 胞能 在三 维结 构 内生长 、 铺 展 。 以上实验结 果证明， 借助细胞 3 D打印， 可以将 细胞 基质材 料组装形成 三维模型 ， 且细胞在 三维 结构 内生长 良好。为了选取合适 的电解液及 测试 频段 ， 以及验证基质材料 对芯片测试 的影响 ， 分别 选取 p H 为 7 2的铁 氰 化 钾 溶 液 、 纯 P B S溶 液 和 不 含胎 牛 血清 的 D ME M 作 为测试 电解 液 ， 实验 结 果 如 图7 。结果显示 I D E s 在 p H为 7 2的铁氰化钾溶液 中的测 试 结 果 最 为 理 想 ， 在 低 频 区 ( 11 0 0 H z ) D ME M 和 P B S溶 液 的 交 流 阻抗 特 性 呈 容 性 。 这 是 由于铁氰化钾溶液 中有 导电离子 F e ( C N) 和 F e ( C N) ， 而 D ME M 和 P B S中 缺 乏 强 导 电 离 子。所以在细胞测试 条件允许 的情况下， 应优先采 用铁氰化钾溶液进行测试。 然而为了长 时间 维持 细胞 活性 ， 就 需要 采 用 ( d ) 图 6细 胞 基 质 材 料 支 架 结 构 。 ( a) 四 边 形 通 道 的支架 ； ( b )三 角形 通道 的支 架 ； ( e )四边 形微 通 道支架显微照 ； ( d )免疫荧光染色 F i g 6 S t r u c t u r e s o f c e l I ma t e r i a l s s e a fro l d s ( a) S c a fro I d wi t h s q u a r e mi c r o c h a n n e i s ；( b)S c a ffo l d wi t h t r i a n g u l a r mi c r o c h a n n e l s ；( e )Mi c r o g r a p h o f s q u a r e mi c r o c h a n n e l s ； ( d)l mmu n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i ng 中 国 生物 医学工程学报 5 5 5 O 4 5 4 0 3 5 3 O 2 5 2 0 l 5 0 0 5 l 0 l 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 I g z ( a ) 9 0 0 8 0 0 7 0 0 6 O 0 吾5 0 0 4 0 0 3 O O 2 0 0 l 0 0 O 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 O 4 5 5 0 l g 【， 7 Hz 】 图 7叉 指 电 极 在 3种 溶 液 中 测 试 数 据 的 叠 加 图。 实 验 重 复 3次。 ( a )幅 频特 性 ； ( b)相 频 特性 Fi g 7 M e a s u r e me nt o f I DEs i n t hr e e ki nds of s o l u t i o n ( n=3) ( a)I mp e d a n c e mo d u l u s o f f r e q u e n c y；( b)P h a s e o f f r e q u e n c y P B S和 D ME M等非 电解液溶液作为测试液。由图 7 结果显示 ， 在 中高频 区( 1 k1 0 0 k H z ) D ME M 与铁 氰化钾溶 液 的电阻抗特性 相似 ， 其原 始阻抗 低 于 P B S 溶液的原始阻抗 ， 且 D ME M更适合细胞长时间 生 长 ， 将 D ME M作 为 电解液 研究 其 特性 。结 果 如 图 8所示 ， 在适合细胞电生理阻抗测试 的中高频 区( 1 k1 0 0 k H z ) ， 加入 基 质材 料 前 后 ， 幅频 特 性 曲线 和 相频 特性 曲线 变 化 均 不 明显 ， 且 相 频 特 性 与 p H 为 7 2的铁 氰化 钾溶 液基 本 一致 。实 验证 明 ： 明胶 海 藻酸钠混合 材料对 阻抗 测试影 响甚 小； 在 中高 频 区， D ME M能替代铁氰化钾溶液作为长时间测试电 解液 ； 细胞阻抗测试时 ， 中高频 区能检测 出细胞膜 等有机物引起的电极表面容性阻抗的变化 ， 且具有 较好 的灵 敏度 。 本研究 比较 了串珠 型叉指 电极 和传统梳状叉 指电极的检测效果。以 1 0 Hz 作为测试频率 ， 结果 显示( 如图 9所示) ， 串珠型叉指 电极比梳状叉指电 极 的原 始 阻抗 更 低 、 灵 敏 度更 好 。 由于 用 于 固定 细 胞 的基 质材 料会 影 响细 胞 阻抗 变化 检 测 的灵 敏 性 ， 9 0 0 8 0 0 7 0 0 6 0O 5 0 0 靛4 0 0 霹3 0 l o 2 0 0 l 0 0 0 0 0 5 l 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 I g l H z 】 ( b ) 图 8叉指电极在 D ME M 中测得数 据的叠 加图 。 实验重复 3次。 ( a )幅频特性 ； ( b ) 相频特性 Fi g 8 M e a s ur e me nt o f I DEs i n DM EM s o l u t i o n ( n=3) ( a)I mp e d a n c e mo d u l u s o f f r e q u e n c y； ( b)P h a s e o f f r e q u e n c y P B s + 材料 铁氰化钾+ 材料D ME M+ 材料 1 0 4 Hz 阻抗测 试 图 9 串 珠 型 电 极 与梳 状 电极 对 比 Fi g9 A c ompa r i s o n o f c i r c l e - on- l i n e e l e c - t r o de s wi t h c o m b 1 i k e e l e ct r od e s 因此 选用 原始 阻抗 更低 、 灵 敏度 更 好 的 串珠 型叉 指 电极 更 利于打 印细 胞的 阻抗检测 。 为验 证 I D E s 能否 检测 出细胞 材料 组装 结构 中 细 胞 的 阻 抗 变 化 ， 本 研 究 在 芯 片 表 面 组 装 了 H O 一 8 9 1 0细胞 ， 并研 究 I D E s 检 测 到 的细 胞 增 殖 。组 装 完成后 ， 置于培养箱培养 1 2 h ， 然后将 I D E s与电化 如 0 6 4 2 0 8 6 2 2 2 2 1 l G 一 2期 赵 占盈 ， 等 ： 基 于细胞 3 D打 印技术 的肿瘤药 物筛选细胞芯片研 究 l 6 7 学 站 相连 ， 在 l 0 Hz 进 行 阻 抗 一 时 问测 试 ， 连 续 监 测 2 0 h ， 分别 在 0 、 5 、 l 0 、 1 5 、 2 0 h时 间点 采 样 ， 实 验结 果 以各时问点 的检测值和 时间点检测值的 比值 来 表示 ( f o l d i n c r e a s e ) ， 同时 用 生 化 检 测 法 ( A l a m a r b l u e ) 做 平行 对 照 实 验 。 由图 1 0可 见 ， 随着 培 养 时 间 的延 长 ， HO一 8 9 1 0细 胞在 芯 片 上 贴 壁 、 伸 展 和增 殖 ， 芯片 监 测 到 的 阻 抗 值 持 续 增 加 ， 但 增 加 幅 度 减 慢 ， 这 和 细 胞 在 材 料 内 接 触 抑 制 达 到 生 长 极 限有 关 ， 这一 检测 结果 和 标 准 的生 化 检 测 方 法 测 得 数 据 一致 。结 果证 明 ， 在芯 片表 面组 装 了细胞 三 维结 构后 ， 芯 片可 以准确 检