黑臭水体有机物降解菌的分离鉴定及降解特性_马兴冠.pdf

文章编号:1009-6094(2023)02-0567-09黑臭水体有机物降解菌的分离鉴定及降解特性*马兴冠，董畅，唐玉兰，何亚婷，王晓华(沈阳建筑大学市政与环境工程学院，沈阳 110168)摘要:为了从黑臭水体中发掘高效有机物降解菌株资源，用于低浓度有机污染黑臭水体中，采用富集、分离、纯化的方法，从沈阳市仁镜河黑臭段底泥中分离获得 1 株具有较高有机物降解率的 a 菌株。结合形态观察及 16S rDNA 基因测序分析，鉴定其为东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)。由单因素试验可知，菌株 a 的最佳生长条件为:pH=7.0、装液量25%、温度 32。在最佳生长条件下测定生长曲线确定最佳接种点为培养 12 h。有机物降解特性研究表明，在 30、120 r/min 摇床中，反应进行 4 d 时 a 菌株对黑臭水有机物去除率达到 64.75%。相同试验条件下，初始菌量增加，CODCr去除率先升高后降低，初始菌量为 1%(体积分数)时 CODCr去除率较高;a 菌株对不同碳源利用情况不同，对小相对分子质量碳源利用率较高。关键词:环境工程学;黑臭水体;东洋芽孢杆菌;分离鉴定;CODCr去除率中图分类号:X522文献标志码:ADOI:10.13637/j issn 1009-6094.2021.2160*收稿日期:20211129作者简介:马兴冠，教授，博士，从事水污染控制理论及技术研究;唐玉兰(通信作者)，教授，博士，从事流 域 环 境 治 理 和 修 复 研 究，。基金项目:沈阳市科计划项目(20206407)0引言随着社会经济发展和生活水平提高，生活污水的产生量大幅度提高，监管不严或设施不完善导致大量污水直接排放到河流中，造成河流污染。1979年，Lazaro1 提出了黑臭水体的概念，即是一种极端的水体污染。1986 年，骆梦文2 在分析了黄浦江水体黑臭由来时指出主要原因是日益加重的有机污染。水体中有机物含量过高时，好氧微生物降解有机物消耗大量氧气，导致水体缺氧。厌氧微生物在缺氧环境下成为优势菌群，其分解有机物时产生硫醚、硫化氢、氨等致臭物，同时形成 FeS、MnS 等致黑物质，使水体发黑发臭。物理法、化学法和生物法是治理黑臭水体的常用方法。由于物理法不能彻底改善水质，化学法又可能危及水生生物，生物法作为一种成本低、效益高、环境友好的修复方法得到发展并逐渐应用到河道治理中。微生物修复法属于生物法，主要通过投加微生物菌剂修复黑臭水体3。冯忠等4 初探生物工程菌对黑臭水体的治理效果，结果表明投加工程菌有效提高了有机物的降解效率，为微生物法修复黑臭水体奠定基础。刘志刚等5 利用复合微生物菌剂净化了河道，48 d 后河道黑臭现象基本消失。可见微生物法治理黑臭水体有成效，但治理中使用的菌剂多为外来功能性菌种，许多学者对外来菌种的安全性存疑。王海珊等6 研究发现工程菌剂对黑臭水体的适应性差削弱了其净化作用，对黑臭水体的修复效果不如土著菌剂。高新新7 和张君胜8 等分别从活性污泥和养殖污水中筛选出了有机物降解菌株，并且具有较好的降解效能。但菌株主要应用于生活污水、养殖废水等有机物浓度高的污染水中，而对于有机物浓度较低的黑臭水体中的应用较少。本文从沈阳市仁镜河黑臭底泥中分离出对有机物具有良好降解效果的土著菌，将菌株分类鉴定，并确定最佳生长条件及最佳接种点。试验中以 CODCr表征有机物含量，研究土著菌对黑臭水体中有机物的降解特性，以期为黑臭水体有机污染物的去除提供菌种资源。1材料与方法1.1微生物样品采集菌株取自沈阳市仁镜河黑臭段，分别采集底泥和水样。样品在采集后低温密封储存，将其立即带回实验室开展菌株的富集与分离工作。采用底泥与水样均匀混合的方式获得微生物富集分离样本。1.2黑臭水的配制为确保重复试验所用黑臭水样水质相同，本文黑臭水样为人工配制，配方根据文献 9 少量修改:淀粉0.402 g，尿素 0.107 g，KH2PO40.01 g，MgSO47H2O0.0 5g，FeSO47H2O 0.0 1g，NaCl 0.05 g，黑臭底泥10 g，加水稀释至 1 L，密封置于 30 恒温箱(TS100C，上海天呈实验仪器制造有限公司生产)5 d 后水样浑浊，底泥变黑，气味刺鼻。室温下放置 5 d，待水质稳定后将水样经中速滤纸过滤后测定背景值如下:pH=7.25、CODCr质量浓度 86.2 mg/L、NH+4N质量浓度 25.144 mg/L、ORP(氧 化 还 原 电 位)333.2 mV、DO 质量浓度 1.43 mg/L，属于重度黑臭。1.3培养基基富集培养基:牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠765第 23 卷第 2 期2023 年 2 月安全 与 环 境 学 报Journal of Safety and EnvironmentVol 23No 2Feb，20235 g，1 000 mL 蒸馏水，pH 值调至 7.2 7.4 后灭菌20 min。分离培养:牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂 20 g，淀粉 0.4 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值调至7.2 7.4 后灭菌 20 min。活化培养基(LB 培养基):胰蛋白胨 10 g，氯化钠 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值调至7.2 7.4 后灭菌 30 min。文中所用化学试剂纯度均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产;生化试剂均为北京奥博星生物技术有限责任公司生产。1.4有机物降解菌的分离、筛选取 1 g 泥水混合样于装有 100 mL 无菌水锥形瓶中，瓶中放入适量玻璃珠，充分振荡后得到底泥悬浮液。将底泥悬浮液依次稀释为 1 10、1 102、1103、1 104、1 105稀释液，分别吸取 1 103、1 104、1105稀释液 0.2 mL 涂布于分离平板，30 恒温培养1 2 d，在菌落生长分散的平板中滴加碘液，使碘液刚好覆盖平板，挑取周围出现透明圈的单菌落进行重复划线纯化，直至显微镜观察到菌体形态一致时纯化结束。将分离纯化的菌株活化 24 h 得到活化培养液。取10 mL 菌液接入100 mL 黑臭水样中(菌液由活化培养液经5 000 r/min 离心10 min 弃去上清液，加入10 mL 灭菌质量分数0.86%NaCl 重悬制成，下同)，在 30 恒温、120 r/min 振荡箱中培养 2 d 后，测定上清液中 CODCr、NH+4N 的含量并计算去除率。1.5有机物降解菌的鉴定形态学鉴定 将纯化获得的菌株平板划线，30 恒温培养 24 h，肉眼观察菌落形态，取样革兰氏染色，显微镜观察染色结果。16S rDNA 鉴定 采用细菌 DNA 提取试剂盒提取细菌基因组 DNA，利用 27F/1492R 引物对筛选获得的 a 菌株 DNA 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系(50L):灭菌水 20 L，KOD OneTM PCR Master Mix 25L，模板 2 L，1 引物(10 M each)1.5 L。PCR循环条件:变性，98 10 s，退火 55 8 s，延伸 68 2 s，35 次循环。1%琼脂糖凝胶电泳验证 PCR 产物，Sanger 法测序 PCR 产物。在 NCBI 数据中的 Blast 比对系统中输入测序得到的序列信息，查找数据库中相似性较高的序列，应用 MEGA 7.0 软件进行聚类分析并构建系统发育树。1.6菌株培养条件的优化将活化12 h 的种子液按1%(体积分数)接入总体积为 200 mL，LB 培养基装液量为 25%、50%、90%(体积分数)的锥形瓶中(即 50 mL、100 mL、180mL)，在30，120 r/min 摇床中培养24 h，取样测定OD600(600 nm 处吸光度)及 DO(溶解氧含量)。将活化12 h 的种子液按1%(体积分数)接入装有 3mL，pH 值分别为 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5、10.0 的 LB 培养基的小试管中，在 30，120r/min 摇床中培养 24 h，取样测定 OD600。将活化12 h 的种子液按1%(体积分数)接入装有 3 mL，pH 值为 7.0 的 LB 培养基的小试管中，分别在 5、15、20、25、32、37、42、45、50 条件下，120 r/min 摇床中培养24 h，取样测定 OD600。1.7菌株生长曲线的测定取 3 5 mL 活化 18 24 h 的菌液于 14 支灭菌小试管中，在最佳培养条件下培养，每隔 2 3 h 取出 1 支试管，并立即 4 贮存，最后一同测定OD600，绘制菌株生长曲线，确定最佳接种点。1.8菌株对有机物的降解特性研究1.8.1菌株对 CODCr的去除效果装液量为 400 mL 黑臭水/500 mL 锥形瓶，按照5%(体积分数)的接种量投加菌液，在 30、120r/min 摇床中培养，每天定时取上清液，测定一个试验周期内 CODCr的变化(CODCr去除率稳定时为一个试验周期)，计算 CODCr的去除率。1.8.2初始菌量对 CODCr去除率的影响装液量为 100 mL 黑臭水/250 mL 锥形瓶，分别以 0、0.1%、0.5%、1%、3%、5%(体积分数)的接种量投加菌液，在 30、120 r/min 摇床中培养一个试验周期，计算 CODCr的去除率。1.8.3碳源种类对 CODCr去除率的影响装液量为 100 mL 黑臭水/250 mL 锥形瓶，以1%(体积分数)的接种量将菌液投加到碳源分别为淀粉、葡萄糖、乙酸钠、甲醇、蔗糖的水样中，在 30、120 r/min 摇床中培养一个试验周期，计算 CODCr的去除率。1.9水质指标测定方法菌液在 600 nm 处的吸光度可估计菌液的浓度和微生物量，从而判断细菌生长情况，OD600采用紫外分光光度法测定;CODCr、NH+4N、细菌总数分别采用重铬酸钾氧化法、纳氏试剂分光光度法、平皿计数法测定;DO 采用哈希溶氧仪测定。1.10数据统计分析考虑由于投加菌液后会使水质指标发生变化，865Vol 23No 2安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 2 期所有初始数据以加入菌液后的数值作为起始值。在进行菌株降解特性试验时，每个处理设 3 个重复，分别使用 Excel 和 Origin 2018 计算标准偏差和绘图。采用 SPSS 22.0 软件，在 0.05 显著性水平下进行单因素方差分析。2结果与讨论2.1有机物降解菌的分离、筛选初筛结果如图 1 所示，单菌落周围出现透明圈说明其对有机物具有降解能力，挑取其中 5 株透明圈较大的单菌平板划线(命名为 a、b、d、e、f)。将 5 株菌分别接种模拟黑臭水中进行复筛，复筛结果如表 1 所示。5 株菌对黑臭水中 CODCr的去除率可达 45%以上，其中 a 菌株对 CODCr的去除率最高达到 66.95%，同时对 NH+4N 也有一定的去除能力，因此对 a 菌株作进一步的研究。叶姜瑜等10筛选菌株时同样出现 NH+4N 去除率负值情况，这是因为含氮大分子有机物被分解产生的 NH+4N 量大于被去除的 NH+4N 量，去除率出值。图 1初筛菌株 a、b、d、e、fFig 1Primary screening strains a，b，d，e，f表 1初筛菌株对黑臭水 CODCr及 NH+4N 降解率Table 1Removal rate of CODCrand NH+4N in black andodorous water by strains initially screened菌株名称CODCr去除率/%NH+4N 去除率/%a66.9515.83b50.7123.32d46.7430.30e63.9724.56f54.588.732.2a 菌株的鉴定现负2.2.1形态特征观察由图 2 观察到 a 菌株菌落近圆形，呈现无光泽白色，且表面褶皱、边缘不整齐，随时间延长菌落变大，表现出泳动和自聚能力;染色结果表明 a 菌为革兰氏阳性短杆状菌(见图 3)。革兰氏阳性菌能够减少颗粒物和溶解有机碳的积累11，进一步说明 a 菌具有分解有机物能力。2.2.216S rDNA 基因鉴定将筛选获得的 a 菌株进行 16S rDNA 测序鉴定，测序结果通过 NCBI 数据中的 Blast 比对系统搜索相似序列并构建系统发育树。由图 4 系统进化树可知，菌株 a 属于芽孢杆菌属，同时 其 与 Bacillustoyonensis strain BCT7112(NR 121761.1)聚于同一分支上，去除首尾多余序列后同源性达 99%以上。所以，鉴 定 a 菌 株 为 东 洋 芽 孢 杆 菌(Bacillustoyonensis)。目前，国内外对于东洋芽孢杆菌的研究主要集中在预防作物病虫害和作为动物饲料改善动物的免图 2a 菌株菌落特征Fig 2Colony characteristics of strain a图 3a 菌株染色特征Fig 3Staining characteristics of strain a9652023 年2 月马兴冠，等:黑臭水体有机物降解菌的分离鉴定及降解特性Feb，2023图 4基于 16S rDNA 序列 a 菌株的系统进化树Fig 4Phylogenetic tree of a strain based on 16S rDNA sequence疫反应两方面12 14，在有机物去除方面的研究很少见，但芽孢杆菌属的其他菌种已被发现能有效地将有机物转化为 CO215。本试验筛选获得的 a 菌株对有机物的去除率达到 60%以上，这表明 a 菌株与芽孢杆菌属的其他菌种一样能够降解有机物。2.3a 菌株培养条件的优化2.3.1装液量对菌株生长的影响装液量是体现氧气含量的重要指标，而氧气在微生物生长过程中起着重要的作用，装液量为25%、50%、90%(体积分数)时溶解氧质量浓度分别为 7.97 mg/L、6.45 mg/L、2.66 mg/L。由图5(a)可知，不同装液量下 a 菌达到最大生长量所需时间相同，但最大生长量随装液量的增加而下降，最佳生长装液量为 25%。这说明 a 菌生长受氧气影响较大，当氧气含量低时生长受到抑制，所以在菌株培养或实际应用中应保持足够的溶解氧量。2.3.2pH 值对菌株生长的影响培养基初始 pH 值会造成细胞膜氧化还原电位变化，从而影响微生物对营养物质的同化和酶促反应的速度，影响微生物的生长。由图5(b)可知，a 菌株生长的最佳 pH 值为 7.0，其生长状态在中性或略碱性条件为好。酸性条件下(pH 值在 5.0 7.0)菌株生长量随 pH 值的升高逐渐增大;碱性条件下(pH值在 7.0 10.0)菌株生长量随 pH 值的升高逐渐减小，在强碱性条件下菌株生长受抑制较强。2.3.3温度对菌株生长的影响温度是微生物的重要生存因子，由图 5(c)可知，a 菌株能在 15 45 温度上生长，属于嗜中温型微生物，最佳生长温度为 32。在低于 15 或高于 45 时，吸光度在 0.025 0.052，菌株生长量极小，说明低温或高温环境不利于 a 菌生长。温度在 15 32，菌株生长量随温度升高而增加;当超过 32 时，菌株生长量随温度升高而下降。这是因为细胞膜在低温条件下发生凝胶，营养物质运输过程受到阻碍，微生物生长受到限制;而高温会使微生物体内的酶变性失活，微生物生长速率降低。2.4a 菌株的生长曲线和接种点的确定由生长曲线(见图 6)可知，a 菌具有较强的环境适应力，1 h 内就有一定的生长量，培养液呈现微浊;1 16 h 内吸光度值呈几何倍数增长，此时 a 菌繁殖速度迅速，属于对数生长期;16 h 后进入稳定期;22h 后培养液中有少量白色结块出现，菌株生长进入衰亡期。根据菌株的生长曲线，选择对数增长期增长到 80%左右的时间点作为最佳接种点，即培养 12h 的菌液作为种子液，此时微生物繁殖速度快，代谢能力强。2.5a 菌株对有机物的降解特性2.5.1a 菌株对有机物的降解效果在以往研究中发现菌株对污染物的降解率与菌株的生长一致，并在对数增长期及稳定期早期达到075Vol 23No 2安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 2 期图 5装液量、pH 值、温度对 a 菌株生长的影响Fig 5Effect of liquid volume，pH value，temperature ongrowth of strain a最大值16 18。试验中接种处于对数增长期的 a 菌株，由图 7 可知，CODCr去除率两天内迅速升高，且去除率随着微生物生长量的增加而逐渐增加，第 4 d去除率达到最大值 64.75%。微生物生长量在 3 4d 达到稳定，随后微生物生长量下降，CODCr去除率相应降低，这表明微生物对有机质的降解与微生物的生长有关，而与细胞自溶无关。许多研究学者发现芽孢杆菌属能够降低污染水体中的 CODCr。伍乾辉等19 从对虾养殖水体中筛选出 1 株芽孢杆菌，在游离菌状态下 48 h 的 CODCr去图 6a 菌株的生长曲线Fig 6Growth cure of strain a图 7a 菌株生长趋势与有机物降解曲线Fig 7Growth trend and organic matter degradationcurve of strain a除率为 42.34%。周国庆等20 从刺参养殖池底泥中筛选出 3 株高效降解有机物的菌株:白翎芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，5 d 内对 CODCr的最大去除率分别是 45.71%、23.98%、24.97%。巩彧玄等21 从秸秆、树叶等腐烂周边的土壤中筛选出一株苏云金芽孢杆菌用于处理养猪污水，结合曝气处理 21d 后，CODCr的去除率为 52.9%。本试验筛选出的 a 菌株对 CODCr为 86.2 mg/L 的模拟黑臭水样有机物降解率达到 64.75%，去除效果好于国内报道的芽孢杆菌属下的有机物降解菌种。试验中发现，处理几天后水样澄清，底部出现白色絮状物，如图 8 所示，说明 a 菌株能在水中絮凝成胶团。李力等22、胡咏梅等23 在研究枯草芽孢杆菌时同样出现类似现象，经过镜检发现这些胶团由有机碎屑和菌体组成。Kunle 等24 从海湾沉积物中筛选出的东洋芽孢杆菌能够产生生物絮凝剂。这种特性可使不易降解的固体污染物凝聚，成为其他水生动物的食物，达到水体自净。降解后期活菌数减1752023 年2 月马兴冠，等:黑臭水体有机物降解菌的分离鉴定及降解特性Feb，2023图 8白色絮状物Fig 8White floc少，吸附到菌体上的物质脱吸，也可能导致 CODCr去除率降低。2.5.2初始菌量对 a 菌株降解有机物的影响初始菌量对有机物的降解有着重要影响，试验结果如图 9 所示。试验进行 2 d 后，CODCr去除率随着初始菌量的增加先升高后显著降低。在初始菌量较低时，a 菌株对有机物的降解率达到 50%以上，在初始菌量为 0.1%和 0.5%时的去除效果相近，在1%时达到最高值;随着初始菌量的继续升高，a 菌对有机物的降解率逐渐降低，且去除效果显著不同。张君胜等8、张秀霞等25 有类似的试验结果，CODCr去除率随初始菌量的增加先升高后降低。这主要是因为投加菌会增加水样的 CODCr，投加量较小时影响较小，但当投加量加大时，其自身携带的有机质将大幅度增加水样的 CODCr，进而影响其对污染物的降解率26。未投加微生物组对有机物有一定的降解效果主要是因为培养环境发生变化。模拟黑臭水样在厌氧条件下制备而成，试验在 120 r/min 摇床中进行，试验结束时各组别溶解氧质量浓度在 6 7 mg/L，水样中原有的微生物进行好氧呼吸降解一定量有机物。投菌组中 CODCr的去除率显著高于未投菌组，说明黑臭水中有机物的降解绝大部分是 a 菌株利用消耗的结果。2.5.3碳源对 a 菌株降解有机物的影响黑臭水中有机污染成分主要有有机质及其被微生物水解、转化的产物，不同微生物对各种有机质的利用效率不同27。由图 10 可知，a 菌株对葡萄糖和甲醇的利用率最高，CODCr去除率分别达到 68.22%和 67.54%。再次为乙酸钠和蔗糖，CODCr去除率为15%30%。以淀粉为碳源时，细菌生长量较小，CODCr去除率仅为 9.88%。菌株对碳源的利用情况图中小写字母不同表示组间差异性显著(p 0.05)图 9初始菌量对 a 菌株降解有机物的影响Fig 9Influence of initial amount of strain a on thedegradation of organic matter图 10碳源对 a 菌株降解有机物的影响Fig 10Influence of carbon source of strain a on thedegradation of organic matter和菌株的生长量极为相似，说明碳源是通过影响细菌的生长从而影响其降解能力。细菌对化学结构简单、相对分子质量小的碳源利用率较高，文献中大多数细菌在葡萄糖、甲醇等小分子碳源条件下生长情况良好27 28。淀粉为高分子碳水化合物，降解过程复杂，需要在胞外酶的作用下水解为单糖和双糖后才能被进一步降解，所以细菌对淀粉的利用率低。但伍乾辉19 等从对虾养殖水体中筛选出一株芽孢杆菌，研究发现淀粉为碳源时该菌株的生长量显著高于葡萄糖为碳源时，说明不同类细菌对碳源的利用特性存在差异。3结论1)从沈阳市仁镜河黑臭段底泥及水样中筛选分离得到一株能够降解黑臭水体有机物的菌株，经形态学及 16S rDNA 鉴定该菌株为东洋芽孢杆菌275Vol 23No 2安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 2 期(Bacillus toyonensis)。2)优化培养条件试验结果表明，a 菌株在 pH=7.0、装液量 25%(体积分数)、温度 32 条件下生长良好，并在此条件下测定其生长曲线，确定菌株的最佳接种点为培养 12 h 的菌液。3)在初始 CODCr86.2 mg/L 模拟黑臭水体中，30、120 r/min 摇床中反应进行4 d 后，a 菌株对有机物的降解率为 64.75%，并且微生物的降解性能与其生长量有关。在相同试验条件下，a 菌株对有机物的降解率随初始菌量的增加先升高后显著降低，初始菌量 1%时去除率达到最高值;a 菌株对不同碳源的利用情况不同，对葡萄糖、甲醇等小相对分子质量碳源利用率最高，可达到 65%以上。综上说明 a 菌能够有效降解黑臭水体中的有机物，可为微生物法修复黑臭水体提供菌种资源。参考文献(References):1 LAZARO T RUrban hydrology:a multidisciplinaryperspective M Michigan:AnnArborSciencePublishers，1979.2 骆梦文 黄浦江黑臭水体的由来 J 上海环境科学，1986，5(5):3738.LUO M W The origin of the black-odor water in HuangpuRiverJ Shanghai Environmental Sciences，1986，5(5):3738.3 冯强，易境，刘书敏，等 城市黑臭水体污染现状、治理技术与对策 J 环境工程，2020，38(8):8288.FENG Q，YI J，LIU S M，et al The pollution situation，treatment techniques and 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