高效液相色谱法快速测定白酒中纽甜的含量_许文雅.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 2 期 300 分析检测高效液相色谱法快速测定白酒中纽甜的含量许文雅，张宏宏，林洋，刘瀛，郁蕉竹，鞠晓莹沈阳市食品药品检验所（沈阳 110122）摘要研究建立了高效液相色谱法快速测定白酒中纽甜的含量,简化了国标中对样品的前处理过程,优化了色谱条件。白酒除乙醇后用水定容上机,采用Thermo C18色谱柱,以乙腈-辛烷磺酸钠溶液=4060(V/V)为流动相,采用二极管阵列检测器,检测波长210 nm,柱温30,流速1 mL/min。结果表明,在该色谱条件下,纽甜在0.210 mg/L的质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系,相关系数R值为0.999 978,方法检出限为0.06 mg/kg,定量限为0.2 mg/kg,3个不同添加量0.2,0.5和1.0 mg/kg水平下纽甜加标平均回收率为97.1%99.0%,相对标准偏差(n=6)为0.39%1.3%。该方法前处理简单、快速,在该色谱条件下分离效果好,整个检验过程分析成本低,为检测白酒中的纽甜含量提供了更快捷的方法。关键词纽甜;白酒;高效液相色谱法;快速测定Rapid Determination of Neotame in Liquor by High Performance Liquid ChromatographyXU Wenya,ZHANG Honghong,LIN Yang,LIU Ying,YU Jiaozhu,JU XiaoyingShenyang Institute for Food and Drug Control(Shenyang 110122)Abstract A high performance liquid chromatography method was established for the rapid determination of neotame in liquor,which simplified the pretreatment process of the samples in the national standard and optimized the chromatographic conditions.After removing the ethanol,the liquor was directly connected to the machine,neotame was qualitatively analyzed on a Thermo C18 column with a diode array detector at 210 nm using acetonitrile-sodium octane sulfonate solution of 4060(V/V)as the mobile phase,the column temperature was 30,and the flow rate was 1 mL/min.The results showed that under the chromatographic conditions,neotame had a good linear relationship with peak area in the mass concentration range of 0.2-10 mg/L,the correlation coefficient was 0.999 978,the limit of detection was 0.06 mg/kg,and the limit of quantification was 0.2 mg/kg.The average recoveries of neotame spiked at the levels of 0.2,0.5 and 1.0 mg/kg were 97.1%-99.0%,and the relative standard deviation(n=6)was 0.39%-1.3%.The method was simple and rapid in pretreatment,which had good separation effect and low analysis cost in the whole inspection process,and provided a method for the rapid determination of neotame in liquor.Keywords neotame;liquor;high performance liquid chromatography;rapid determination纽甜是一种合成甜味剂，其甜味纯正，口味较接近蔗糖，但其甜度高，甜度是蔗糖的8 00013 000倍，且无能量1-3，纽甜在体内代谢后的产物能较快排出体外。纽甜稳定性好、安全性高，因此被广泛应用在食品行业中4-5。白酒是通过粮食发酵等一系列工艺酿造的蒸馏酒，经过时间的发酵和精良的工艺，使酒中含有丰富的多元醇或酮等甜味物质，这些物质使白酒的口感更香醇。但有些酒类生产企业为了降低生产成本、改善白酒的口感，在生产过程中添加甜味剂，这种违规添加行为影响了酒类行业发展的食品安全问题6-7。依据GB 276020148食品安全国家标准 食品添加剂使用标准中规定，发酵酒中不得添加甜味剂，白酒中不允许添加纽甜。关于白酒中纽甜的检测方法国内外已有大量报道，主要检测方法有高效液相色谱法9-14、液相质谱法15-18等，但液相质谱法运营成本相对较高。目前，高效液相色谱法应用较多，其中GB 5009.247201619食品安全国家标准 食品中纽甜的测定应用较多，该方法是样品经过混合提取液提取、C18固相气相色谱-串联质谱法测定土壤中常见的7种农药残留量J.理化检验(化学分册),2021,57(8):688-692.20 丽春,刘书贵,尹怡,等.QuEChERS结合UPLC-MS/MS测定水产品中9种除草剂残留及基质效应J.食品科学,2020,41(18):258-266.食品工业 2023 年第44卷第 2 期 301 分析检测萃取柱净化、氮吹浓缩等前处理步骤，处理过程较为复杂，影响因素多，导致回收率低。因此试验在国标法基础上，优化白酒中纽甜的前处理过程和高效液相色谱条件，为测定白酒中纽甜的含量提供一种简单快速、精密度高、回收率好、成本低的检测方法。1材料与方法1.1材料与试剂纽甜标准品（1 000 mg/L，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；乙酸铵（色谱纯，fisher chemical）；辛烷磺酸钠（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（电导率：18.2 M.cm，25，自制）；水系滤膜（0.45 m，上海安谱实验科技股份有限公司）。30个不同厂家白酒样品：市场购买。1.2仪器与设备Waters e2695高效液相色谱仪（配2998PDA检测器，美国Waters公司）；BSA224S-CW分析天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Quintix213-1CN电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-250DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H1750R高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Milli-Q reference超纯水机（Millipore SAS公司）；705878（20-200 L）/705880（100-1 000 L）移液器（普兰德公司）；NZ44739（5-50 L）移液器（赛默飞世尔科技公司）。1.3试验条件1.3.1色谱条件色谱柱：Thermo C18柱，4.6 mm150 mm，5 m；流动相：乙腈-辛烷磺酸钠溶液4060（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30；进样量：50 L；波长：210 nm。1.3.2样品的前处理条件精确称取5 mL白酒于10 mL玻璃刻度管中，于氮吹仪中除去乙醇，取出后用水定容至刻度，充分混匀，滤液经0.45 m滤膜过滤，供高效液相色谱检测。1.3.3溶液的配制辛烷磺酸钠溶液：称取2.00 g辛烷磺酸钠用水溶解，加1 mL磷酸，加水定容至1 000 mL。100 mg/L纽甜储备液：准确量取1.0 mL纽甜标准物质，于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。标准曲线溶液：分别准确移取100 mg/L的纽甜储备液0.02，0.05，0.1，0.5和1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容到刻度，轻摇混匀，标准系列工作溶液中纽甜的质量浓度分别为0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L。2结果与分析2.1前处理条件的选择与比较国标方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超声，通过固相萃取柱净化，氮吹后再用甲醇洗脱，处理过程繁琐，易导致样品中的纽甜损失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。白酒基质较为纯净，有研究表明纽甜在水溶液中稳定性好20，但白酒样品中含有乙醇，在低波长下直接进样容易出现干扰峰，因此试验中先挥发掉乙醇，再用水定容至原体积。在相同的色谱条件下进样分析，图1是纽甜标准溶液色谱图，图2是白酒样品直接进样溶液色谱图，图3是白酒除去乙醇后溶液色谱图，图2和图3对比可以看出，直接进样后得到的色谱图杂质峰多，特别是在纽甜出峰位置附近有干扰峰，若保留时间稍有偏移，就会造成目标峰识别错误，造成纽甜含量变化，导致定量结果不准确。相对于直接进样来说，除去乙醇后色谱图中纽甜出峰位置附近的干扰峰较少，从而提高了目标峰识别的正确率，保证了定量的准确性。通过直接进样和除去乙醇两种方式比较，首先确定了除去乙醇后再进样的前处理方式。图1纽甜标准溶液色谱图图2白酒样品直接进样溶液色谱图图3白酒样品除乙醇后溶液色谱图国标方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超食品工业 2023 年第44卷第 2 期 302 分析检测声，通过固相萃取柱净化，氮吹后再用甲醇洗脱，处理过程繁琐，易导致样品中的纽甜损失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。此方法通过取白酒试样先氮吹除去乙醇，再用水定容后直接上机检测，尽可能做到无损失。对国标方法和本方法分别进行加标试验，平行测定3次，测得纽甜的回收率，得到的试验结果如表1所示。结果表明，白酒除去乙醇后，用水定容后上机得到的纽甜回收率高。图4是白酒除乙醇后加标溶液色谱图。表1两种前处理方法回收率比较 单位：%C18固相萃取柱回收率平均回收率除乙醇后水定容回收率平均回收率84.585.399.899.185.298.586.399.1图4白酒除乙醇后加标溶液色谱图2.2色谱条件的优化2.2.1流动相及洗脱条件的选择试验选取了甲醇-辛烷磺酸钠溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液作为流动相进行分析。通过试验结果发现，使用甲醇-辛烷磺酸钠溶液为流动相，纽甜的峰形不好，乙腈-辛烷磺酸钠溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液为流动相时，纽甜峰形对称性较好，均能有效地分离杂质，但乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液作为流动相时，样品中的杂质峰较大，基线不如乙腈-辛烷磺酸钠体系平稳，因此选择乙腈-辛烷磺酸钠溶液为流动相。国标中流动相的洗脱方式是梯度洗脱，在梯度洗脱过程中可能会出现基线漂移的情况，且耗时较长，由于白酒的成分比较简单，等度洗脱也能够较好地分离纽甜，对梯度洗脱方式和等度洗脱方式分别进行了考察，试验结果表明，两种洗脱方式无明显差异，所以试验采用乙腈-辛烷磺酸钠溶液等度洗脱的方式。乙腈-辛烷磺酸钠溶液比例为（4060）洗脱时，纽甜与样品中的杂质分离良好，出峰时间快。色谱柱选用了Thermo C18色谱柱（150 mm4.6 mm，5.0 m）进行色谱分离，国标中使用C18（250 mm4.6 mm，5.0 m），两种色谱柱所分离出的目标化合物的峰形，分离度都满足要求，考虑250 mm色谱柱的出峰时间更长，成本更高，所以采用150 mm色谱柱，纽甜标准溶液色谱图见图1。2.2.2检测波长的选择利用二极管阵列检测器（PDA）对纽甜标准品溶液在波长190400 nm范围内扫描，光谱图显示，纽甜在200218 nm范围内都有吸收，随着波长增加，吸收值逐渐下降，但考虑到乙腈在210 nm以下有紫外末端吸收，因此选择检测波长为210 nm。2.3在优化条件下进行方法验证及白酒中纽甜的检测2.3.1线性范围分别取0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L的纽甜标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=38 814X-825，相关系数为0.999 978，标准曲线如图5。结果表明纽甜在0.210 mg/L线性关系良好。图5纽甜标准曲线图2.3.2检出限和定量限以3倍信噪比（rSN）测得纽甜检出限为0.06 mg/kg，以10倍信噪比（rSN）测得纽甜定量限为0.2 mg/kg，表明该色谱条件具有较高的检测灵敏度，能准确进行定量，满足GB 5009.247201619的要求。2.3.3加标回收率和精密度选取白酒空白基质样品，分别加入一定量的纽甜标准溶液，使样品中纽甜的添加量分别为0.2，0.5和1.0 mg/kg，每个质量分数水平分别做6组平行试样，按上述前处理条件和色谱条件测定样品中的纽甜含量，并计算其加标回收率和精密度，结果见表2。由表2可知，纽甜加标平均回收率为97.1%99.0%，三个不同水平下的精密度分别为1.3%，1.1%和0.39%，满足GB/T 27404200821实验室质量控制规范 食品理化检测要求，说明方法的准确度和精密度良好。表2回收率试验结果添加质量分数/(mgkg-1)回收率/%SRSD/%123456平均0.298.195.698.397.595.297.897.11.300.596.896.197.698.596.799.097.51.101.098.698.999.598.898.799.699.00.392.4实际样品的检测从市场上抽取30个不同厂家的白酒样品，按上述优化后的处理方法进行纽甜的快速检测，结果表明，29份样品中未检出纽甜，1份样品中有纽甜检出，含食品工业 2023 年第44卷第 2 期 303 分析检测量为0.810 mg/kg，纽甜的出峰时间稳定，分离度良好。表明白酒市场存在非法添加甜味剂的现象，相关部门应对此现象进行关注。阳性样品色谱图见图6。图6阳性样品色谱图3结论建立了快速测定白酒中纽甜含量的高效液相色谱法，在GB 5009.247201619食品安全国家标准食品中纽甜的测定的基础上，简化了纽甜检测的前处理方法，优化了液相条件，将其用于对白酒中纽甜含量的检测。以乙腈-辛烷磺酸钠溶液（4060，V/V）为流动相，检测波长210 nm，能够获得良好的响应和分离度。在白酒的前处理过程中，样品利用氮吹仪除乙醇后用水定容，操作简单。试验结果表明：纽甜在0.210 mg/L质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系，灵敏度高，方法检出限为0.06 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg；准确度高，3个不同添加量水平下纽甜平均加标回收率为97.1%99.0%；重复性好，相对标准偏差（n=6）为0.39%1.3%。相较于国标方法复杂的前处理过程以及回收率不稳定的情况，该方法前处理简单快速，检测时间短，方法准确度高，精密度好，检测成本低，可快速有效地测定白酒中的纽甜，满足日常检测的要求，为检测白酒中的纽甜提供了一种经济快速的方法。参考文献：1 余海星.二肽甜味剂-纽甜J.中国食品添加剂,2008,19(1):54-57.2 张金峰,沈寒晰,张存社.新型甜味剂纽甜研究进展J.应用化工,2010,39(10):1574-1577.3 周家华,崔英德,曾颢.食品添加剂M.北京:化学工业出版社,2008:221.4 王齐,朱伟伟,杨俊.高效液相色谱法快速筛查与测定葡萄酒中纽甜J.食品科学,2013,34(4):154-156.5 LIU B,HA M,MENG X Y,et al.Molecular mechanism of species-dependent sweet taste toward artificial sweetenersJ.The Journal of Neuroscience,2011,31(30):11070-11076.6 范文来,王栋.近10年我国传统饮料酒白酒和黄酒品质安全研究现状与展望J.食品安全质量检测学报,2019,10(15):4811-4829.7 张秋,范光森,李秀婷.我国白酒质量安全现状浅析J.中国酿造,2016,35(11):15-20.8 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂使用标准:GB 27602014S.北京:中国标准出版社,2015.9 刘石雪,唐丽云.高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量影响因素的探究J.酿酒科技,2017,38(10):84-87.10 王颖,代仕梅,韦靖婧,等.HPLC法测定白酒甜味剂纽甜含量J.酿酒科技,2022,37(1):114-117.11 ZHAO Y G,CAI M Q,CHEN X H,et al.Analysis of nine food additives in wine by dispersive solid-phase extraction and reversed-phase high performance liquid 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