高糖诱导肥胖模型中线粒体发生研究_张传梅.pdf

南 开 大 学 学 报（自然科学版）Acta Scientiarum Naturalium Universitatis NankaiensisVol.561Feb.2023第56卷第1期2023年2月文章编号：0465-7942(2023)01-0035-03高糖诱导肥胖模型中线粒体发生研究张传梅,穆成龙,赵田,朱玉山(南开大学 生命科学学院,天津 300071)摘要：线粒体不仅是细胞内的能量代谢中心,而且不断进行着生物发生、融合、分裂等以适应细胞内环境的变化.NRF1是核内重要的转录因子,对线粒体的生物发生过程有重要的调控作用.线粒体的功能变化与多种代谢性疾病密切相关,如肥胖、糖尿病等.高碳水化合物饮食能够引起过度肥胖及高血糖、糖尿病等症状,持续的高血糖对线粒体的状态也会有影响.在高糖诱导的小鼠肥胖模型中,持续的高血糖对棕色脂肪线粒体的影响尚不清楚.通过高糖饮食构建了肥胖小鼠模型,结果发现高糖饲喂小鼠能够显著引起脂肪的堆积,并且发现对棕色脂肪的影响最为显著.通过对线粒体关键蛋白的检测,发现持续的高血糖能够引起NRF1蛋白的表达下调,同时引起线粒体蛋白水平的显著下降.在体外培养的HeLa细胞中,也得到了相同的结果.实验表明高糖处理能够通过抑制NRF1抑制线粒体的生物发生,调控棕色脂肪对脂肪酸的代谢功能.关键词：肥胖;线粒体生物发生;NRF1中图分类号:Q26文献标识码:A0引言肥胖是一种代谢性疾病,由许多诱因产生,其中高糖饮食在肥胖发生中有重要的作用.而肥胖的发生与机体能量代谢密切相关.线粒体是细胞内能量代谢和物质循环的中间枢纽,线粒体不断进行着生物发生、融合、分裂及清除等动态变化1.线粒体的动态变化与机体的能量状态,特别是能量底物如葡萄糖等密切相关,二者存在相互影响.棕色脂肪是富含线粒体的脂肪组织,也是动物体内非颤栗性产热的主要场所,对于调控机体体温有至关重要的作用.核呼吸因子NRF1(nuclear respiratory factor 1)对调控线粒体有重要作用,它首先是作为一个促进细胞色素C表达的转录因子被发现的2,3.同时也发现作为调节线粒体生物合成的关键转录因子,NRF1能够与转录共激活因子PGC1-结合,增强自身的转录活性,诱导下游靶基因如TFAM,COXs等转录表达,促进线粒体的生物合成以及功能,为细胞的生长提供了必要的能量基础4.研究发现运动会促进肌肉细胞中NRF1以及其共转录因子PGC1-的表达,NRF1活性的上调会增强肌肉细胞中的线粒体氧化呼吸5.在体内NRF1主要以同源二聚体的形式结合到DNA上发挥转录功能,其活性受到ATM、CDK2等激酶调控6,7.本实验通过对高糖诱导的肥胖模型研究,发现持续高糖能够通过降解NRF1抑制线粒体的反生从而抑制棕色脂肪对脂肪酸的降解,从而加重肥胖表型.1材料与方法1.1 材料HeLa细胞;C57B6/L野生型雄性小鼠;罗氏血糖仪及血糖试纸,Anti-COX IV,anti-PDHB,ATP5B,SDHB,TIM23,NRF1,Actin,PPARa,PPARr,SCD1,HADHB抗体,蔗糖.1.2 细胞培养HeLa细胞在含5%CO2的37 恒温培养箱中培养.细胞培养的完全培养基为添加10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素的DMEM.细胞长满时,EDTA-胰酶消化,按1 4的比例传代.收稿日期：2022-06-14基金项目：国家自然科学基金重点项目（32030026）作者简介：张传梅(1995-),女,山东日照人,硕士.通讯作者：朱玉山(1971-),男,内蒙古赤峰人,教授,研究方向:细胞凋亡与信号转导.E-mail:张传梅等：高糖诱导肥胖模型中线粒体发生研究 36 南 开 大 学 学 报（自然科学版）第56卷1.3 蛋白质免疫印迹将细胞以合适的密度接种于6孔板中,待细胞密度长至70%-80%后加药处理不同时间,收集细胞裂解,蛋白样经SDS-PAGE后,转印至醋酸纤维素膜上,封闭2 h.一抗4 孵育过夜,PBST洗3次,每次10 min.二抗常温孵育2 h,PBST洗3次,每次10 min,ECL显色后曝光.2结果与讨论2.1 高糖处理诱导肥胖模型构建为研究高糖饮食中高糖在机体肥胖发生中的作用,在小鼠饮用水中添加20%的蔗糖.而经过1年时间的高糖处理,成功构建了肥胖小鼠模型.从图1A可以产出小鼠明显出现肥胖症状,体重是对照组的两倍(图1B).长时间高塘处理能够显著引起小鼠血糖升高(图1C),增加小鼠体脂率(图1D),小鼠脂肪组织明显积累(图1E),脂肪细胞明显增大(图1F).以上结果表明,长时间高糖诱导能够成功引起小鼠肥胖,尤其发现其对棕色脂肪的影响最大,为研究高糖在肥胖发生中的作用提供了条件.2.2 高糖处理通过抑制NRF1抑制线粒体发生线粒体是细胞内代谢的主要场所,且脂肪酸氧化就发生在线粒体中,肥胖是机体内脂肪酸的过度积累所诱发的.为研究高糖处理是否能通过影响线粒体而影响脂肪的积累,对高糖处理的棕色脂肪线粒体进行了研究.结果表明,高糖处理能够显著引起棕色脂肪组织的线粒体减少,如线粒体蛋白,PDHB,ATPB5B,COXIV,SDHB,TIM23等表达水平显著下降,而与线粒体发生相关的核呼吸因子NRF1蛋白水平也明显下降(图2A),表明长时间持续的高血糖能够通过抑制NRF1蛋白水平影响棕色脂肪的线粒体的数量.而通过对棕色脂肪组织内的线粒体DNA水平检测发现棕色脂肪组织内的线粒体DNA也明显减少(图2B).而线粒体内脂肪酸氧化的关键酶HADHB水平也显著随着线粒体蛋白降低而下降.同时还发现与脂肪酸代谢相关的转录因子PPARa,PPARr蛋白水平也明显下降(图2C),表明除降低线粒体外还存在其他途径影响脂肪酸的降解代谢.2.3 持续高糖处理体外培养细胞抑制线粒体的发生为验证棕色脂肪内线粒体减少是通过高糖诱导的,用含有高水平葡萄糖培养基处理细胞,结果发现,经过高糖处理后,HeLa细胞内线粒体蛋白TIM23,PDHB,TOMM20等表达水平随葡萄糖浓度上升而显著下降,而NRF1也表现出相同的下降趋势(图3A).而当用含有正常糖水平的培养基恢复高葡萄糖水平的细胞一定时间后,发现Hela细胞内的线粒体蛋白TIMM23,PDHB,COXIV都恢复到了对照组的水平(图3B).图1 高糖诱导小鼠肥胖模型构建Fig.1 High sucrose induced obesity mouse model020406080WCWSWCWSWSWC096312*07142128Body weight/gSerum glucose/(mmol L-1)Body fatration/%A06001 200BCDERelative levels1 8002 4003 000*FBAT iWAT gWAT sWAT图2 高糖诱导肥胖模型棕色脂肪中线粒体含量研究Fig.2 Mitochondria in the brown adipose tissue high sucroseinduced mouse modelWCWS00.30.60.91.21.5Relative mtDNA levelsWCWS*APDHBATP5BCox IVSDHBTIMM23NRF1Actin40551535257040WC00.30.60.91.2*Relative levelsPDHBATP5B Cox IVSDHB TIMM23 NRF1WSWCWS*PPARaPPARrHADHBActinWCWSBC00.30.60.91.2Relative levels55555540PPARa PPARr SCD1HADHB204080mmolL-12525407255AB20408025407255GlucoseTOMM20TIMM23PDHBNRF1TubulinRelative levels1.51.20.90.60.30204080mmolL-1*TOMM20TIMM23PDHBNRF1*204080mmolL-1N.S.N.S.N.S.N.S.N.S.N.S.TIMM23PDHBCOXIV1.51.20.90.60.30GlucoseTIMM23PDHBCOXIVTubulinRelative levels图3 高糖抑制HeLa细胞中线粒体的发生Fig.3 High sucrose inhibits mitochondrial biogenesis in HeLa cell第1期张传梅等：高糖诱导肥胖模型中线粒体发生研究 37 以上结果证明高糖处理能够通过抑制NRF1抑制细胞内线粒体的生物发生过程,从而导致细胞内线粒体数量的减少,引起细胞代谢水平的变化.3结论高糖饮食是西方饮食的重要形式,而高糖饮食能够诱导肥胖等多种代谢疾病的发生.而本实验通过高糖诱导肥胖小鼠模型的研究,发现高糖能够通过抑制线粒体生物发生的调控因子NRF1的活性而抑制体内线粒体生物发生过程,从而降低棕色脂肪组织对脂肪酸的消耗,使细胞乃至机体内脂肪出现积累,为研究高糖与肥胖的关系提供了新的思路.参考文献1Buck M D,O Sullivan D,Geltink R I K,et al.Mitochondrial dynamics controls T cell fate through metabolicprogrammingJ.Cell,2016,166(1):63-76.2Gugneja S,Scarpulla R C.Serine Phosphorylation within a concise amino-terminal domain in nuclear respiratoryfactor 1 enhances DNA bindingJ.Journal of Biological Chemistry,1997,272(30):18 732-18 739.3Scarpulla R C.Nuclear activators and coactivators in mammalian mitochondrial biogenesisJ.Biochimica et Bio-physica Acta(BBA)-Gene Structure and Expression,2002,1 576(1):1-14.4BaaR K,Wende A R,Jones T E,et al,Adaptations of skeletal muscle to exercise:rapid increase in the tran-scriptional coactivator PGC-1J.The FASEB Journal,2002,16(14):1 879-1 886.5Baar K,Wenden A R,Jones T E,et al.Skeletal muscle overexpression of nuclear respiratory factor 1 increas-es glucose transport capacityJ.FASEB J,2003,17(12):1 666-1 673.6Chow H M,Cheng A,Song X,et al.ATM is activated by ATP depletion and modulates mitochondrial func-tion through NRF1J.J Cell Biol,2019,218(3):909-928.7Palmer N,Talib S Z A,Ratnacaram C K,et al.CDK2 regulates the NRF1/Ehmt1 axis during meiotic pro-phase IJ.J Cell Biol,2019,218(9):2 896-2 918.The Research of Mitochondrial Biogenesis in aHigh-glucose Induced Obesity ModelZhang Chuanmei,Mu Chenglong,Zhao Tian,Zhu Yushan(College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin 300071,China)Abstract:Mitochondria are not only the center of energy metabolism in the cell,but also undergo bio-genesis,fusion and fission to adapt to the changes in the cellular environment.NRF1 is an important tran-scription factor in the nucleus and plays an important role in the regulation of mitochondrial biogenesis.Thechanges of mitochondrial function are closely related to a variety of metabolic diseases,such as obesity anddiabetes.High-sucrose diet can lead to obesity,high blood sugar,diabetes and other symptoms,and sus-tained high blood sugar also has an impact on mitochondrial status.The effect of high-sucrose diet on themitochondrial quality in brown fat is also largely unknown.In this study,a high-sucrose diet was used toconstruct an obese mouse model.The results showed that high-sucrose feeding could significantly inducefat accumulation in mice,especially in the brown fat.Through the detection of mitochondrial key proteins,we found that the sustained hyperglycemia could cause the decrease in the levels of NRF1 protein and mi-tochondrial proteins.The same results were obtained in HeLa cells cultured in vitro.Experiments showedthat high-glucose treatment could inhibit mitochondrial biogenesis by inhibiting NRF1,and regulate themetabolic function of brown fat.Keywords:obesity;mitochondrial biogenesis;NRF1