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舒建龙等 基于重建分析的ceRNA网络在痛风中的调节机制 第 8 期基于重建分析的ceRNA网络在痛风中的调节机制舒建龙 卢丽颖 李凤珍（广西国际壮医医院，南宁530201）中图分类号 R392.9 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1573-07摘要 目的：探索有关痛风发病的ceRNA网络调控机制，寻找治疗痛风的潜在靶点。方法：计算机检索GEO数据库，下载lncRNA微阵列芯片GSE160170，分析系列矩阵文件得到差异lncRNA与mRNA。比对高度保守的miRNA家族文件后 得出lncRNA-miRNA关联，预测miRNA调控的mRNA，与芯片数据差异分析得到的差异mRNA取交集，得出miRNA-mRNA关联。构建ceRNA网络，运用String数据库分析蛋白互作关系，筛选关键蛋白互作模块。R软件分析关键蛋白模块的功能与相关通路，挖掘关键模块ceRNA网络。结果：痛风疾病组与正常组比较共获得差异表达的354个lncRNAs（140个下调，214个上调）、693个mRNAs（399个下调，294个上调）。在差异表达lncRNA的ceRNA网络中，有86个lncRNAs（35个下调，51个上调）、29个miRNAs、57个mRNAs。GO富集分析涉及的生物过程DNA编码转录、调控细胞增殖凋亡、调控RNA聚合酶启动子转录等。KEGG涉及的信号通路有IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等。挖掘关键模块获得9种lncRNAs、11种mi-RNAs、9种mRNAs。结论：ceRNA网络可能在痛风的发病过程中发挥关键作用，其中TTTY10/hsa-miR-139-5p/AP-1轴可能具有一定研究意义。关键词 痛风；ceRNA；lncRNA；miRNA；mRNA；生物信息学Reconstruction and analysis of competitive endogenous RNA network reveals regulatory role of goutSHU Jianlong，LU Liying，LI Fengzhen.Guangxi International Zhuang Medical Hospital，Nanning 530201，ChinaAbstract Object：ceRNA regulatory network-based analysis to study the roles to finding a potential therapeutic target of gout.Methods：Discovery of search the GEO database and download the lncRNA microarray chip GSE160170 to comprehensive analysis of matrix series file reveals the differentially lncRNA and mRNA.After aligning the a deeply conserved miRNA family obtained the associating lncRNA-miRNA，we can prediction the intersection between mRNA of miRNA regulation and mRNA from the analysis of microarray data associations.The ceRNA interaction relationships were predicted using Interacting Genes（String）database，then constructed the ceRNA network to screen for key proteins.The data mining ceRNA key modules by analyzed the function of key protein modules and related pathway with R software.Results：Compared with the differential expression between Gout group and normal group，354 lncRNAs（140 down-regulated and 214 up-regulated）and 693 mRNAs（399 down-regulated and 294 up-regulated）were obtained.In the ceRNA network that differentially expresses lncRNAs，there are 86 lncRNAs（35 down-regulated and 51 up-regulated），29 miRNAs，and 57 mRNAs.GO enrichment analyses involve DNA coding transcription，regulation of cell proliferation and apoptosis，regulation of RNA polymerase promoter transcription and so on.The signal pathways involved in KEGG include IL-17 signal pathway，TNF signal pathway，MAPK signal pathway and so on.Mining key modules to obtain 9 lncRNAs，11 miRNAs，9 kinds of mRNAs.Conclusion：ceRNA network may play a key role in the gout process and the TTTY10/hsa-miR-139-5p/AP-1 axis have certain research significance.Key words Gout；ceRNA；lncRNA；miRNA；mRNA；Bioinformatics痛 风 是 一 种 由 尿 酸 单 钠 晶 体（Monosodium Urate Grystals，MSU）在关节中沉积引起的关节炎症性疾病，全世界的发病率不尽相同，近年发现在许多国家正在逐年增加，且表现出发病年龄逐渐降低的趋势1。我国患病率为1%3%，由于不系统规范治疗，痛风甚至可导致关节破坏、多脏器病变2。在过去的几年里，虽然对痛风进行了深入研究，但确切的分子机制仍有待确定3。因此，阐明痛风的发doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.002本文受广西创新驱动发展专项（桂科AA17202034）；广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2020KY07021）；广西壮族自治区中医药管理局青年基金项目（GXZYZ20210173）；广西中医药大学一流学科建设青年基金项目（2019XK046）；广西国际壮医医院创新项目（2019011）资助。广西中医药大学，南宁530200。通信作者，E-mail：。作者简介：舒建龙，男，硕士，主治医师，主要从事中西医结合风湿病防治研究。1573中国免疫学杂志2023 年第 39 卷病机制并确定新的治疗策略，包括治疗痛风的潜在生物标志物和治疗靶点，具有重要意义。只有2%基因可以在转录后翻译为蛋白质发挥调控作用，其余98%不编码蛋白质的基因组被称为非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）4。但证据表明各种ncRNA作为主要调节因子，影响数十个甚至数百个靶基因的表达水平5。微小 RNA（micro RNA，miRNA）和长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）都是 ncRNA 的类型，为更好地了解ncRNA如何参与疾病的发生机制，提出了竞争性内源RNA（ceRNA）网络假说6。其中一个关键假设是miRNA 通过结合并抑制 mRNA 表达，lncRNA 携带miRNA反应元件可以被miRNA调节，从而通过竞争miRNA影响转录，与mRNA进行通信，从而影响目标mRNA表达7-8。lncRNA是一个长度大于200个核苷酸、由RNA聚合酶转录且缺乏开放读码框的RNA分子9。作为重要的调节剂，lncRNA可通过调节软骨细胞细胞外基质降解、炎症信号传导、迁移和成纤维细胞样滑膜细胞的侵袭来介导关节炎10-11。miRNAs是一种非编码小RNA，可以巧妙且复杂地调节基因表达12。作为MSU诱导炎症和痛风性关节炎相关通路的核心参与者，目前已发现不同的miRNA在急性痛风炎症中发挥激活作用12-13。同样，lncRNAs 在介导痛风进展也发挥着重要作用3。虽然ceRNA关联已在多种疾病中得到证实，但尚未见在gout中研究报道。本研究基于重建分析3种类型的RNA转录物（lncRNA、miRNA和mRNA）如何在痛风发病中相互作用以调节转录。1 资料与方法 1.1检索方法在NCBI GEO数据库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载人lncRNA 微阵列、表达数据，检索词为“gout”“lncRNA”“human”；检索时间范围为2010年1月至2021年3月。1.2数据下载根据检索结果从GEO Datasets下载芯片GSE160170（平台GPL21827，Agilent_079487 探针，Arraystar人lncRNA微阵列V4）。lncRNA微阵列数据集中纳入了12份样本，其中6份为人正常外周血，6份为人痛风外周血样本。下载芯片中的系列矩阵文件和平台文件。1.3重注释比对运用Perl软件（版本5.30.0）将GEO平台文件中的探针核酸序列整理为fasta格式。在 Gencode 平台（https：/www.gencodegenes.org/）下载人类染色体上所有转录物的核苷酸序列文件，将探针核酸序列与人类染色体上所有转录物的核苷酸序列文件进行比对，得到含有基因名的探针文件。1.4系列矩阵注释运用Perl软件将系列矩阵文件与探针文件比对，将系列矩阵文件中的探针ID转化为基因名。在Gencode平台下载人类基因组注释gtf文件，通过Perl软件在系列矩阵文件中添加基因属性，以此区分mRNA和lncRNA。1.5差异分析运用 R软件（版本 4.0.4）的“limma”包分析系列矩阵文件中的差异基因，以 logFC（log2 fold change）1或1，并且校正后 P1代表此差异lncRNA在痛风组中上调，反之则为下调。1.6预测lncRNA结合的miRNA在miRcode平台（http：/www.mircode.org/）下载高度保守的 miRNA家族文件。运用 Perl 软件比对差异 lncRNA 与 mi-RNA相互作用关系，预测得到lncRNA-miRNA关联。1.7预测miRNA调控的mRNA根据miRDB数据库（http：/mirdb.org/）、miRTarBase 数据库（http：/mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）和 TargetScan 数据库（http：/www.targetscan.org/vert_72/）预测miRNA调控的mRNA，只有上述3个数据库均预测得到的mRNA才被纳入研究。运用Perl软件将miRNA 预测的 mRNA 与芯片数据中的差异 mRNA取交集，最后得出miRNA-mRNA关联。1.8ceRNA网络构建基于ceRNA理论构建lnc-RNA-miRNA-mRNA 共表达竞争三联体，并运用 Cytoscape软件（版本3.8.2）分别构建上调和下调差异表达 lncRNA的 ceRNA网络，连线代表节点之间存在调控关系。1.9蛋白互作网络构建与模块分析运用 String数据库（版本11.0，https：/string-db.org/）分析ceRNA网络中mRNA编码的蛋白质，设定置信度得分0.4为筛选参数，分析蛋白互作关系。将String数据库数据导入至Cytoscape软件，绘制蛋白互作网络，同时运用MCODE插件筛选蛋白互作网络中的模块，以 degree cut off=2、score cut off=0.2、k-core=2、max.depth=100 作为筛选参数，可视化关键的 lncRNA-miRNA-mRNA子网络。为了进一步分析，分别分析ceRNA 网络的原始 mRNA 及子网络 mRNA 分析每个关键lncRNA的GO和KEGG通路注释。1574舒建龙等 基于重建分析的ceRNA网络在痛风中的调节机制 第 8 期1.10 GO 富 集 分 析 与 KEGG 富 集 分 析 运 用 DAVID数据库（https：/david.ncifcrf.gov/，版本6.8）进行GO富集分析关键蛋白互作模块的功能，导出基因富集数据至 Excel 表格，运用 Graphpad prism 9.0.2 版本绘制 GO 富集分析图，运用 R 软件做KEGG 富集分析相关通路，P1，校正后P值（adj.P.Val）0.4为筛选参数，共得到33对蛋白互作关系，57个蛋白。运用MCODE插件筛选得到2个关键蛋白互作模块，模块1中有JUN、CASP2、PMAIP1共3个蛋白，模 块 2 中 有 FOS、TNFAIP3、MAP3K8、BTG2、NR4A2、DUSP2共6个蛋白，见图3。Note：Red.Up-regulated lncRNAs；Green.Down-regulated lncRNAs.图1差异表达的lncRNAs火山图Fig.1Volcano plot of hierarchical clustering of differentially expressed lncRNAsNote：A.lncRNA；B.mRNA.X-axis shows sample names of chipsets.Y-axis is labeled with names of lncRNAs.Red represents a high level of relative expression；green represents a low level of relative expression；black indicates nonsignificant differences in relative expression；blue represents peripheral blood samples from healthy subjects；pink represents peripheral blood samples from gout subjects；branches on Y-axis represent clustering of various lncRNAs；twelve lncRNA samples were clustered into three categories sharing similar patterns of differential expression.图2差异表达的lncRNA和mRNA分层聚类树形图和热图Fig.2Dendrogram and heatmap of hierarchical clustering of differentially expressed lncRNA and mRNA1575中国免疫学杂志2023 年第 39 卷2.4GO 富集分析以 P0.05 为筛选指标，57 个mRNAs GO富集分析结果中，生物过程为DNA编码转录、调控细胞增殖、调控RNA聚合酶启动子转录、调控细胞凋亡、对脂多糖的反应、成熟过程、有丝核分裂、骨盐沉积、调控神经元凋亡、机械刺激反应等。细胞成分为细胞核、细胞质、脂质颗粒。分子功能为蛋白质结合、转录因子活性、序列特异性DNA结合、RNA聚合酶核心启动子近端区域以及远端增强子序列特异性 DNA 结合等。核心模块 9个mRNAs GO富集分析结果中，生物过程为调控神经元凋亡、成熟过程、细胞对细胞外刺激的反应、RNA聚合酶启动子pri-miRNA转录、序列特异性DNA结合转录因子活性的调控、细胞对激素刺激的反应、对细胞因子的反应、机械刺激反应、SMAD蛋白信号转导、DNA损伤反应、转化生长因子受体信号通路等。细胞成分为细胞核、细胞质。分子功能为蛋白质结合、DNA结合、蛋白质异质二聚体的活性、序列特异性DNA结合、R-SMAD结合、转录因子活性，RNA聚合酶核心启动子近端区序列特异性DNA结合等。见图4。2.5KEGG 富集分析以 P1 indicates upregulation，logFC1 indicates downregulation.图6痛风ceRNAs网络的关键机制Fig.6Representative signaling pathways of ceRNAs in gout1577中国免疫学杂志2023 年第 39 卷本研究发现痛风差异表达基因主要富集在 IL-17及TNF信号通路，在通路图中可以发现，涉及的 基 因 有 Act1、TRAF6、NF-B、AP-1、FOS、JUN、IL-1、COX2 等，对比关键 ceRNA 网络中 mRNA 发现FOS、JUN为差异表达基因，查找潜在竞争性结合的miRNA为hsa-miR-139-5p，竞争的lncRNA有9种，其中AC104024、AC084082、AC083843、FAM182A为下调表达差异，AC022819、FAM215B、AP000525、TTTY10、ZNF346-IT1为上调表达差异lncRNAs。有趣的是，AC083843、FAM182A同时出现上调及下调的差异表达现象。从研究 IL-17 信号通路可以看到，其下游为Act1和 TRAF6，其中 Act1作为 IL-17受体相关的适配器可以直接使mRNAs稳定表达，以介导IL-17的炎症信号传导，TRAF6是IL-17一个重要受体激酶，当IL-17通路活化后，这个激酶通过诱导NF-B通路（NF-B与AP-1相互依赖）活化分泌炎症因子和化学因子促进炎症信号下调29。AP-1作为一种转录因子，其功能十分复杂。AP-1 包括 c-Fos、c-Jun、JunB和JunD，这些亚单位中c-fos，c-Jun转录激活能力最强，在很多炎症细胞因子（IL-1，TNF-）、生长因子、基质金属蛋白酶（MMP2，MMP9）等的启动子区都有AP-1的结合位点，与促炎和促破坏过程密切相关。但是AP-1的下游靶基因也可抑制炎症反应，如典型的Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在其启动子区具有AP-1结合位点，其表达受AP-1活性的影响33。正如在 IL-17 信号通路图中所见，IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17F 轴为促炎通路，IL-17E 轴为抑炎通路。可以看出，COX-2也是作为一个AP-1调节的基因，定位在核膜，所以产物可以直接入核，影响基因表达。它的启动子区有很多重要转录因子结合位点，包括AP-1、NF-B等34。PGE2是COX-2的重要产物之一，在炎症反应局部产生增强，主要发挥促炎的功能，还能促进内皮细胞舒张从而促进发热、局部红肿、循环系统淋巴细胞在炎症区域的募集及炎症因子的产生35。关于 JUN、FOS结合的 miR-139-5p相关研究不多，使用生物信息学软件 DIANA TOOLS（http：/diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php）分析显示miR-139-5P和JUN、TRAF6之间存在确定的结合位点。从目前文献来看，miR-139-5p能调节TRAF6抑制巨噬细胞的炎症和氧化应激反应，降低 IL-1和TNF-水平36。最新研究发现，miR-139-5p可以靶向 c-Jun、c-Fos，促进 T 细胞活化37。miR-139-5p在痛风发病机制中可能发挥关键作用。与 miR-139-5P 竞争的 lncRNA 中 FAM182A 为下调倍数最高，TTTY10为上调倍数最高。虽然目前只有TTTY10相关文献报道，而未见其余lncRNA有关功能和作用的解释，但从TTTY10的研究猜测，这 9个 lncRNAs可能呈现着类似的功能特点。TTTY10被确定通过调节FOXO1参与调节细胞黏附、转录、信号转导、发育和细胞分化38。FoxO1 是与NF-B、AP-1作用相同的一种转录因子，在调节促炎靶基因方面具有核心作用，抑制 NF-B、FoxO1 和AP-1依赖性通路炎症反应下降39-40。所以TTTY10可能在免疫细胞炎症反应方面具有一定调节作用。虽然lncRNA已被证明通过与miRNA的竞争性结合来调节关节炎的进展，但是没有其他研究报道上述 lncRNA 与 miR-139-5p 存在相关结合位点，无法证明通过调节 miR-139-5p驱动炎症细胞因子分泌的作用。因此，本研究有望丰富现有文献，为痛风性关节炎的治疗提供指导。但是本研究停留在生物信息学预测及部分文献实验支撑下，未完全证明文中提及 lncRNA-miRNA-mRNA 网络的全面验证，具有一定局限性。下一步拟在临床验证lncRNA在疾病患者与健康人群中表达差异，研究与 JUN、FOS竞争性结合miR-139-5p的调控机制。明确lnc-RNA与AP-1的两个常见亚单位c-Fos、c-Jun的相互作用及 lncRNA 通过影响 miR-139-5p 调节 c-Fos、c-Jun转录表达。总之，关于痛风治疗的miRNAs和lncRNAs有待于更深入地探索和开发。参考文献：1 DAY R，NGUYEN A，GRAHAM G，et al.Better outcomes for patients with 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