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天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1964-1976基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制刘醒然13,牛梦竹,高高原，寇现娟12*1武汉体育学院运动医学院；武汉体育学院运动训练监控湖北省重点实验室，武汉430 0 7 9；3广西医科大学体育与健康学院，南宁530 0 2 1摘要：本研究利用网络药理学、分子对接技术以及动物实验研究探讨二氢杨梅素（dihydromyricetin,DHM）改善2 型糖尿病db/db小鼠肾纤维化的作用机制。首先观察10 周的DHM干预对db/db小鼠肾纤维化的改善作用。进一步通过TCMSP、Ph a r m M a p p e r 获取DHM化学结构以及靶点,通过 DisGeNET数据库检索疾病靶点;将DHM靶点与疾病靶点进行Venn分析，获得交集靶点后上传至String数据库构建PPI网络，采用Cytoscape软件构建“药物一靶点一疾病”网络；David数据库对交集靶点基因进行CO富集分析和KEGG富集分析。同时取PPI网络排名前1O的交集靶点进行可视化处理，采用PDB数据库、Pymol软件以及AutoDockTools软件将排名前5的交集靶点分别与DHM进行分子对接；对排名第一的核心靶点AKT及相关通路进行Westernblot验证。动物实验观察可见DHM干预可以降低db/db小鼠体重,改善db/db小鼠血糖、肌酐、尿素氮、尿蛋白水平，HE、M a s s o n 和PAS染色结果显示db/db小鼠肾脏纤维化得到缓解。此外,网络药理学筛选共获得药物与疾病靶点交集37 个，富集分析得到30 0 个GO相关条目,10 8条相关通路；分子对接结果表明DHM与关键靶点均能自发结合。Westernblot结果显示DHM干预可以降低db/db小鼠肾脏中的Notchl、NICD、H e s l、H e y l 的蛋白表达,上调 PTEN蛋白表达,抑制AKT的磷酸化,进而改善 db/db 小鼠肾纤维化。因此,DHM可能通过调控Notch/PTEN/AKT通路改善db/db小鼠肾纤维化。关键词：糖尿病肾病；肾纤维化；二氢杨梅素;网络药理学；分子对接中图分类号：R96D01:10.16333/j.1001-6880.2023.11.015Mechanism of dihydromyricetin in improving renal fibrosis in db/dbmice based on network pharmacology and experimental validationLIU Xing-ran-3,NIU Meng-zhu,GAO Yuan,KOU Xian-juan School of Sports Medicine,Wuhan Sports University;2 Hubei Exercise Training and Monitoring Key Laboratory,Wuhan Sports University,Wuhan 430079,China;3 School of Physical Education and Health,Guangxi Medical University,Nanning 530021,ChinaAbstract:Network pharmacology,molecular docking and animal experimental studies were used to investigate the mechanismof dihydromyricetin(DHM)in improving renal fibrosis in type 2 diabetic db/db mice.Initially,a 10-week DHM interventionwas observed to ameliorate renal fibrosis in db/db mice.The chemical structure and targets of DHM were further obtained byTCMSP and PharmMapper,and the disease targets were retrieved by DisGeNET database.Venn analysis was performed onDHM targets and disease targets,and the intersection targets were uploaded to the String database to construct the PPI net-work.The drug-target-disease network was constructed by Cytoscape software.The GO enrichment analysis and KEGG en-richment analysis of the intersection target genes were performed by the David database.At the same time,the top 10 intersec-tion targets of PPI network were visualized,and the top 5 intersection targets were subjected to molecular docking with DHMusing PDB database,Pymol software and AutoDock Tools software.The first core target AKT and related signaling pathways文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-19 6 4-13n1,2*收稿日期:2 0 2 3-0 6-19基金项目：国家自然科学基金（8 16 0 12 2 8）；教育部人文社会科学基金（2 1YJA890014）*通信作者Tel:86-013627292193;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 9-0 1Vol.35were verified by Western blot.Animal experiments showed that DHM intervention could reduce the body weight of db/db miceand improve the levels of blood glucose,creatinine,urea nitrogen and urine protein in db/db mice.HE,Masson and PAS stai-ning showed that renal fibrosis of db/db mice was alleviated.In addition,a total of 37 intersections of drugs and disease tar-gets were obtained by network pharmacology,300 GO-related items and 108 related pathways were obtained by enrichment a-nalysis.Molecular docking results showed that DHM could spontaneously bind to key targets.Western blot analysis resultsshowed that DHM intervention could reduce the protein expression of Notch1,NICD,Hesl and Heyl in the kidney of db/dbmice,up-regulate the level of PTEN protein,inhibit the phosphorylation of AKT,thus improve renal fibrosis.Taken together,DHM may alleviate renal fibrosis in db/db mice by regulating Notch/PTEN/AKT pathway.Key words:diabetic kidney disease,DKD;renal fibrosis;dihydromyricetin;network pharmacology;molecular docking糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是 2型糖尿病（diabetes mellitus type 2,T2DM）主要的微血管并发症之一,也是终末期肾病的主要病因。其主要特征是肾小球基底膜的增厚、系膜和肾小管间质的基质扩张以及足细胞丢失，导致微量白蛋白尿的发展和肾功能下降 。随着DKD 的持续发展,肾脏组织的显微结构出现持续炎症及损伤,导致弥漫性间质纤维化破坏正常肾脏显微结构,最终发展成肾纤维化（renal fibrosis,RF）。而目前缓解 DKD 发展成RF的手段多集中于通过改善DKD来实现。但对于包括 DKD 在内的多数糖尿病并发症的发生机制仍未阐明,以至于DKD演变为 RF过程中的复杂机制也未清晰,导致 DKD及 RF的治疗效果不尽人意 2 。因此探明DKD的发病机制以及发现新的治疗靶点来抑制DKD的发展迫在眉睫。二氢杨梅素（dihydromyricetin,DHM）是一种天然黄酮类化合物,具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、清除自由基、改善线粒体功能障碍、调节自噬等 3.41。目前多项研究表明DHM 在治疗代谢性疾病方面具有巨大潜力,其不仅可以通过诱导自噬、改善氧化应激、抑制炎症、提高线粒体活性等途径改善胰岛素抵抗,降低血糖水平 5;同时对多种糖尿病并发症具有良好的改善作用,如:糖尿病脑病 6 、糖尿病心肌病 7 等。但 DHM 改善糖尿病并发症相关研究并不充分,相关药理机制仍需进一步探究。此外,DHM 是否能够进一步改善DKD 所导致的 RF研究较少，治疗作用尚不明确。网络药理学可以在庞大的生物发生过程网络背景下,基于中药成分的结构,结合其生物效应,联合疾病相关靶点进而构建“药物一成分一靶点一疾病”互作网络,是探索中药有效成分、分子机制以及潜在靶点的有效手段。分子对接可以模拟分子和蛋白质之间的相互作用,预测配体和受体的构象，对亲和力和结合模式进行计算和预测以验证药物成分对刘醒然等：基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制1965主要靶点的具体作用方式。因此，本研究采用网络药理学方式,筛选并预测 DHM 作用于DKD 以及 RF的潜在靶点,构建“成分一靶点一疾病”互作网络，结合分子对接以及体内实验对预测的主要靶点进行验证,探讨二氢杨梅素改善 db/db 小鼠肾纤维化的分子机制,为 DHM 的临床应用提供一定的理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物6周龄SPF级雄性m/m小鼠10 只,体重2 32g,6周龄db/db小鼠2 0 只，体重39 2 g,购买自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(苏）（2 0 16-0 0 10）。饲养于湿度40%55%、温度2 2 2 6，自由饮食饮水，保持良好的通风环境。实验期间均以普通饲料喂养。普通饲料均由武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供。本实验经武汉体育学院动物实验伦理委员会批准（伦理审查批准号:0 0 8 7-2 0 2 0 10-130 1）。1.1.2药物与试剂二氢杨梅素（纯度9 8%，批号ALB-202106，美国ALBTechnologyLimited公司）；小鼠尿微量白蛋白ELISA试剂盒（批号2 M-KMLJM219762m，南京卡米洛生物工程有限公司）;血尿素氮（blood urea ni-trogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)试剂盒（批号分别为C013-2-1、C0 11-2-1,南京建成生物工程研究所）；Notchl、No t c h 胞内结构域（Notch in-tracellular domain,NICD)抗体（批号分别为2 0 6 8 7-1-AP、2 0 6 8 7-1-A P,Pr o t e i n t e c h 公司）;split多毛增强子1（h a i r y a n d e n h a n c e r o f s p l i t l,H e s 1）和发状分裂增强子 1（hairy/enhancer-of-split related with YRPWmotif1，H e y l）抗体（批号分别为ab71559、ab154077,Abcam公司）；第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homo-1966logue deleted on chromosome ten,PTEN）、蛋白激酶 B（p r o t e i n k i n a s e B,A K T）、p-A K T 抗体（批号分别为9188T,4691T,13038T,Cell Signaling Technology)。1.1.3仪器DYY-6C型垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）；EPS-300型转膜仪器（海天能科技有限公司）；低温高速离心机（5415R,Eppendorf）;K 3型酶标仪（赛默飞）;超声波细胞粉碎机（JY99-IDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；荧光及化学放光仪（ChemiS-cope 6300,上海勤翔）；显微镜（IXplore SpinSR,0-lympus corporation）;数显恒温水浴锅（HH-4，金坛市友连仪器研究所）。1.2方法1.2.1网络药理学研究1.2.1.1DHM作用靶点预测与疾病靶点获取通过 TCMSP(https:/tcmsp- DHM 化学结构的 mol 文件,并通过 Pubchem(ht-tps:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和 Drugbank(ht-tps:/ 文件上传至PharmMapper(http:/www.lilab- uniprot（h t t p s:/w w w.u n i-prot.org/)数据库对所预测靶点名称进行规范化处理。以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney dis-ease“renal fibrosis”为关键词,采用DisGeNET(ht-tps:/www.disgenet.org/）数据库进行检索，分别获取“DKD”“RF的靶点。1.2.1.2“药物一靶点一疾病”网络的构建将获取的DHM、D K D 以及RF的靶点上传至微生信（https:/ 3.9.1软件构建“药物一靶点一疾病”可视化互作网络。1.2.1.3PPI网络的构建将交集基因导人 String（h t t p s:/s t r i n g-d b.o r g/)数据库进行蛋白质相互作用分析,并将分析结果导人Cytoscape3.9.1软件，采用插件cytoHubba对分析结果进行网络拓扑参数进行分析,并以度值（de-gree)为参考依据选取前10 位基因进行可视化处理，同时作为后期实验验证的靶基因选取依据。1.2.1.4GO功能富集分析和KEGG通路富集分析采用David(https:/david.ncifcrf.gov/）数据库天然产物研究与开发对交集基因进行基因本体论（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes，K EG G）富集分析，分别筛选KEGG富集分析和GO分析中的生物过程（biologicalprocess,BP）、分子功能（molecular function,MF）、细胞成分（cellular component,CC)的前10 条结果上传至微生信平台进行可视化处理。1.2.1.5分子对接选取PPI网络中degree值前5位的靶基因并结合我们前期研究基础选取靶基因与DHM进行分子对接验证。通过查阅文献报道和 PDB（h t t p s:/www.rcsb.org/）数据库获取靶基因蛋白结构的pdb文件。采用Pymol2.5.5软件对TCMSP数据库获取的DHM分子结构去除水分子和小分子配体,采用AutoDockTools1.5.6对DHM结构文件和靶基因蛋白结构文件进行加氢、定义受体和配体、分配扭转键等构象处理；采用autogrid4设置对接盒子，AutoDock4进行分子对接并获取最低结合能组合。最后使用Pymol进行结果可视化处理。1.2.2动物实验验证1.2.2.1动物分组与模型建立实验小鼠适应性喂养1周后,将6 周龄的m/m小鼠和db/db小鼠随机分为对照组（NC组）、2 型糖尿病肾病组（DKD 组）、DHM 药物干预组（DHM组）,每组各10 只。NC组正常喂养不做干预,DHM药物干预组灌胃DHM（基于前期研究结果选择DHM终剂量为10 0 mg/（k g d)）8,9 ,D K D 组灌胃等体积的生理盐水,每周干预5d,连续干预10 周。1.2.2.2样品制备与动物处理10周干预结束后,禁食测血糖,次日取材,摘眼球取血,分离血清用于生化指标检测,摘取双侧肾脏后,称重,取一侧肾脏于多聚甲醛固定,其余液氮冻存后转-8 0 冰箱保存。1.2.2.3小鼠体重、空腹血糖和肾功能指标检测实验期间,小鼠禁食过夜,12 h后每周固定时间测小鼠体重和空腹血糖。10 周干预结束后,眼球取血,静置2 h后离心取适量血清备用。按照试剂盒提供的方法测定小鼠血清中尿素氮、肌酐、尿蛋白(urine protein,UP)表达水平。1.2.2.4肾脏组织病理学观察肾脏组织于4%的多聚甲醛固定后,石蜡切片厚度约5m,按照乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片进行HE、M a s s o n 与PAS染色,观察各组小Vol.35Vol.35鼠肾组织病理学改变1.2.2.55蛋白免疫印迹法（Western blot）提取小鼠肾脏组织及细胞样品的总蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度后加热变性后制备蛋白样品。经制胶、上样、电泳、PVDF转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h,TBST洗膜后,加人对应的一抗,4孵育过夜,TBST洗膜,二抗室温孵育1h,ECL发光液显影,凝胶成像分析仪摄取图像,计算目标蛋白的灰度值。1.2.2.6统计学方法采用GraphPad Prism9.0软件进行统计分析，数据采用均数标准差（xs)表示，符合正态分布方差齐性,组间比较采用单因素方差分析;若不符合正态分布，则用非参数检验，以P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1DHM改善db/db小鼠病理表现2.1.1DHM降低db/db小鼠体重和空腹血糖每周定时测定各组小鼠体重和空腹血糖,结果显示与 NC 组相比,DKD组小鼠体重、血糖均明显升高(P0.001、P 0.0 0 1)。与 DKD组小鼠相比,DHM组小鼠的体重和血糖值下降（P0.01、P0.01)（见表1、表2)。2.1.2DHM改善db/db小鼠的肾功能损伤与 NC 组相比,DKD 组小鼠血清中肌酐、尿素氮刘醒然等：基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制干预前GroupBefore intervention(g)NC20.50 0.43DKD39.34 1.22DHM39.71 0.77注：与NC组相比，#P0.001;与DKD组相比，*P0.01。Note:Compared with NC,p0.001;Compared with DKD,*P0.01.表2DHM 对 db/db 小鼠空腹血糖的影响(x s,n=8)Table 2 Effect of dihydromyricetin on bloodglucose inmice(x s,n=8)组别Before interventionGroup(mmol/L)NC6.45 1.33DKD29.14 3.62DHM30.47 2.90注：与NC 组相比,#P0.001;与DKD组相比；*P0.01。Note:Compared with NC,#p 0.001;Compared with DKD,*P 0.01.和尿蛋白均明显升高（P0.001、P 0.0 0 1、P0.05）。与DKD组相比,DHM组小鼠的肌酐、尿素氮和尿蛋白均有不同程度的下降(P0.01、P0.001、P 0.0 1）（见图1）。表明DHM可以稳定db/db 小鼠肾功能状态,缓解肾功能损伤。1967表1DHM对db/db小鼠体重的影响(x s,n=8)Table 1 Effect of dihydromyricetin on bodyweight of mice(x s,n=8)组别干预后After intervention(g)23.03 0.8939.05 4.28#31.39 5.77*干预前干预后After intervention(mmol/L)9.69 0.6832.81 1.22#30.06 2.12*A250(/on)0s200150100500B#15*1050DKDDHMC4-#(3u)dn 且3210DKDDHM*DKD图1DHM对 db/db小鼠血清中肌酐、尿素氮和尿蛋白的影响（xs,n=4)Fig.1 The expression levels ofScr,BUN and UP in serum of mice in each group(x s,n=4).注与NC 组相比,P0.05,p0.001;与 DKD组相比,*P0.01,*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h NC,P0.0 5,P0.0 0 1;Compared with DKD,*P0.01,*P0.001.2.1.31DHM 减轻db/db 小鼠肾病理损伤为了探究 DHM干预对 db/db 小鼠肾脏病理损伤的影响,各组小鼠病理切片行HE染色、PAS染色。结果如图2 所示，NC组小鼠肾小球结构规则，肾小管结构清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,且基底膜完整;DKD组小鼠肾小球体积增大,肾小球系膜细胞增生,肾间质可见肾小管肿胀且呈空泡样变性；而DHM组小鼠肾小球体积减小,肾小球系膜细胞1968轻度增生且基底膜增厚改善,肾间质肾小管肿胀减轻且呈空泡样变性改善,肾病理损伤程度得到改善NCDKD天然产物研究与开发（见图2）。Vol.35DHMSVdX400图2 DHM对db/db小鼠肾脏组织病理学的影响(40 0)Fig.2 Effects of DHM on histopathology of mouse kidney(400)2.1.4DHM改善db/db小鼠肾纤维化为了观察 DHM 对 db/db 小鼠肾纤维化的影响,我们对肾脏组织切片行Masson 和免疫荧光染色,可见与 NC 组相比,DKD 组小鼠肾脏间质细胞外基质和肾小管胶原纤维蛋白明显增多,并且小鼠肾皮质和肾髓质中-SMA、Fi b r o n e c t i n、Co l l a g e n l 细胞NC荧光染色阳性信号显著增强、亮度较强；与DKD组比较,DHM组小鼠肾脏胶原蛋白沉积减少,并且肾脏中-SMA、Fi b r o n e c t i n、Co l l a g e n I细胞荧光染色阳性信号减弱，提示DHM改善db/db小鼠肾纤维化(见图3）。DKDDHM图3DHM 对 db/db 小鼠肾脏组织病理学的影响(40 0)Fig.3 Effects of DHM on renal pathology in db/db mice(400)2.2DHM改善db/db小鼠肾纤维化的网络药理学研究2.2.1DHM、D K D 与 RF的靶点获取与“药物一靶点一疾病”网络的构建通过PharmMapper数据库共获取DHM相关靶点37 9 个，分别从DisGeNET数据库获取DKD、R F相关靶点118 9、57 0 个。将DHM、D K D 和RF靶点取交集后得到37 个交集靶点（见图4），并进一步导人Cytoscape软件构建“药物一靶点一疾病”网络图(见图5)。2.2.2DHM、D K D 与RF交集靶点相互作用的蛋白-蛋白互作PPI网络构建将37 个交集基因导人String数据库构建PPI互作网络。结果显示该网络共包含37 个节点数，边数为2 41,平均节点度为13,聚类系数为0.7 6 8（见图6）。在Cytoscape软件中使用cytoHubba插件分析并根据度值（degree)获取前10 的靶点,分别为蛋白激酶 B1（p r o t e i n k i n a s e B1,A K T 1）、血清中白蛋白（a l b u mi n,A LB）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cys-tein-asparate protease-3,CASP3）、表皮生长因子受体Vol.35刘醒然等：基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制1969DHMDKD259638033717286230RF图4DHM、D K D 与RF靶点Venn图Fig.4Venn diagram of intersection targets of DHM,DKD and RFDHMPARPSOD2MLAPKDEDTGFBKDRNR3CSETDAKT4GF1ACEREVDPAROPIK3CG图5药物一靶点一疾病网络Fig.5Drug-target-disease networkNR3C2RACEGALSSGFBR1VTRMAMPGALS3MMPRACIMMPLN2PPARARIHALBSTATTALDHEEGFRCASPAPK100AMIMPAPRTMAPR14ERBBBMP2DPP4NQOINRHEPRBMPTVRTOFOJGF82PAHPPIK3CGAPT图6DHM、D K D 与RF靶点PPI网络图Fig.6PPI network diagram of targets of DHM,DKD,and RF1970（e p i d e r ma l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r,EG FR）、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9,MMP9）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome prolifera-天然产物研究与开发tor-activated receptor gamma,PPARG）、激酶插人区受体(kinase insert domain receptor,KDR)、M M P2、血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme,ACE）。随后将前10 位基因进一步可视化(见图7)。AKTIALBVol.35ACECASP3MMP2EGFRKDRIGF1图7 核心靶点PPI网络图Fig.7 PPI network diagram of core target protein2.2.3DHM、D K D 与RF交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析将37 个交集基因上传至David数据库进行GO功能分析和KEGG富集分析,结果显示DHM与DKD、R F的联系涉及GO功能分析中BP223项、CC25项以及MF52项。BP主要涉及凋亡的负调控与正调控、细胞对活性氧的反应以及对缺氧反应等过程（见图8）;CC主要涉及胞外区、受体复合物以及细胞外空间等细胞成分（见图9）;MF则主要集中在锌离子结合、酶结合和RNA聚合酶II的调节等功能（见图10）。KEGG通路富集结果显示DHM对negativeregulation ofapoptoticprocesscellularresponsetoreactive oxygen speciesheartdevelopmentresponsetohypoxiaPPARGMMP9DKD、R F 的作用通路可能涉及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGE）及其糖基化终末产物受体（receptorforad-vanced glycation end products,RAGE）信号通路、糖尿病心肌病以及叉头转录因子O亚族（forkheadtranscription factor of the O class,FoxO）信号通路等(见图11)。2.2.4DHM 与靶基因蛋白分子对接结果将DHM与PPI网络中degree值前5位的核心靶点（AKT1、A LB、CA SP3、EG FR、M M P9）以及结合我们前期研究基础所选AKT1上游靶点Notch1和-log1o(pvalue)98positiveregulation ofcellmigration6cellularresponsetocadmiumionpositiveregulation ofapoptoticprocesscount6positiveregulationofgene expressionskeletal systemdevelopmentpositive regulation of SMAD protein import intonucleus图8 交集靶点CO功能分析(BP)Fig.8Intersection target GO function analysis(BP)10122550Fold Enrichment75100Vol.35刘醒然等：基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制1971extracellularregionreceptorcomplex-log1o(pvalue)extracellularspace8extracellularexosome6membraneraftmitochondrionnucleoplasmnucleusbasal plasmamembraneplateletalpha granulelumenFig.9Intersection target GO function analysis(CC)count5101520510Fold Enrichment图9 交集靶点GO功能分析(CC)152025zinc ion bindingenzymebindingRNApolymeraseIItranscription factoractivity,ligand-activated sequence-specificDNAbindingidenticalproteinbindingendopeptidaseactivityproteinserine/threonine/tyrosinekinaseactivityprotein phosphatasebindingsuperoxidedismutaseactivitypeptidaseactivitymetalloendopeptidaseactivity图10交集靶点GO功能分析（MF)Fig.10 Intersection target GO function analysis(MF)PTEN进行分子对接（见图12）。结果显示DHM与各靶点蛋白的结合能均小于0 kcal/mol（表3），表示DHM与所选取靶点蛋白均能良好结合，意味着DHM可以通过所对接靶点蛋白进行调控进而改善db/db 小鼠 DKD。2.3DHM改善db/db小鼠肾纤维化分子机制的实验验证为进一步探讨DHM改善db/db小鼠肾纤维化-log1o(pvalue)7654count36912100200Fold Enrichment的分子机制,基于网络药理学和分子对接结果,结合前期研究基础，我们对 DHM 干预的db/db 小鼠肾脏中Notch/PTEN/AKT通路相关蛋白的变化进行研究。Western Blot 结果显示,与 NC 组相比,DKD组小鼠肾组织中的Notch 通路出现过度激活,表现为Notchl、NICD、H e s l、H e y l 蛋白明显上调(P0.05、P0.01、P 0.0 0 1、P 0.0 1)并抑制PTEN的表达（P 0.0 1），同时促进AKT的磷酸化，即p-AKT上3001972天然产物研究与开发Vol.35AGE-RAGE signaling pathway in diabeticcomplicationsDiabeticcardiomyopathy-log1o(pvalue)Proteoglycans incancer9.59.0FoxOsignaling pathway8.58.0Pathways incancer7.5MAPKsignalingpathwaycount8Pancreaticcancer1012Osteoclastdifferentiation14Relaxin signalingpathwayColorectal cancer图11KEGG通路富集分析Fig.11Intersection target KEGG pathway enrichment analysis10Fold Enrichment1520表3DHM与核心靶点蛋白分子对接结果Table 3Molecular docking results of DHM and core target protein药物靶点DrugTargetDHMAKT1DHMALBDHMCASP3DHMEGFRDHMMMPDHMNotchlDHMPTEN结合能PDB IDBinding energy(kcal/mol)4GV14.446YG9-5.015IBP-3.978A2D-5.066ESM-8.415LOR-5.7401V4.2ARG-2436LU341ARG-346ARG-24319ARG-34LEU347DHM-AKT1DHM-ALBSER-36MET-79DHM-CASP3续图 12(Continued Fig.12)DHM-EGFRVol.35刘醒然等：基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制1973DHM-MMP9DHM-NotchlDHM-PTEN图12 DHM与核心靶点蛋白分子对接结果模式图Fig.12Molecular docking result pattern of DHM and core target protein调(P0.01）。而DHM干预则可逆转上述变化，DHM 组 Notch 通路受到抑制,相关蛋白 NICD、H e s l、Heyl 以及 p-AKT 的表达均出现下降(P0.05、PADHMNotchNICDHeslHeylPTENP-AKTAKTB-ActinFig.13 Effect of DHM on the Notch/PTEN/AKT pathway in the kidneys of db/db mice(x s,n=4)注：与NC 组相比,P0.05,P0.01,#P0.001;与DKD组相比,*P0.05,*P0.01,*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h NC,#P0.05,p0.01,p 0.001;Compared with DKD,*P0.05,*P0.01,*P0.001.3讨论与结论目前糖尿病普遍的治疗手段主要依靠血糖的控制,而作为糖尿病最严重并发症之一的 DKD并无有效治疗策略110.1。因此深人