基于网络药理学与分子对接技术探讨玉蝉卫肺丸防治变应性鼻炎的作用机制.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，药物研究 ：基金项目：中国中医科学院科技创新工程（）作者单位：中国中医科学院西苑医院，北京 通信作者：李蕾，：基于网络药理学与分子对接技术探讨玉蝉卫肺丸防治变应性鼻炎的作用机制王金丁然夏彤李蕾【摘要】目的运用网络药理学方法和分子对接技术分析玉蝉卫肺丸治疗变应性鼻炎（，）的潜在作用机制。方法使用 数据库筛选玉蝉卫肺丸的活性成分及作用靶点，从 、和 数据库中筛选 疾病的相关靶点，获取二者交集靶点，即玉蝉卫肺丸治疗 的主要靶点。使用 软件构建“药物 活性成分 靶点”网络，并分析网络中的关键活性成分；使用 数据库获得蛋白互作关系，用 软件分析核心靶点；采用 数据库对交集靶点进行 功能和 通路富集分析，通过 软件进行分子对接验证。动物实验验证，对大鼠鼻黏膜进行 染色，免疫组化验证核心靶点。结果筛选获得槲皮素、山奈酚、欧前胡素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷等关键活性化合物；、等核心靶点；关键靶点主要富集在 、信号通路、信号传导途径；分子对接结果验证大部分成分与靶点具有较好的结合活性。动物实验结果表明，与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜中 表达水平升高，表达水平降低，与模型组比较，玉蝉卫肺丸组 表达水平降低，表达水平升高。结论玉蝉卫肺丸具有多成分，多靶点的特点，可改善 大鼠的鼻部症状和鼻黏膜病理形态，可调控核心靶点 、，为 的治疗和药物开发提供了方向和依据。【关键词】玉蝉卫肺丸；变应性鼻炎；网络药理学；分子对接【中图分类号】【文献标识码】，（，）【】（），“”，（），【】；变应性鼻炎（，）是特应性个体暴露于变应原后产生的主要由 介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病 ，以反复发作的鼻塞、阵 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，发性喷嚏和清水样鼻涕为主要表现，是临床的常见病、多发病。的发病与遗传、环境和表观遗传学等多方面密切相关。近年来，尽管鼻变态反应的防治取得许多进展，但 仍难以得到有效控制，全球发病率为 ，且逐年增长。属于中医学“鼻鼽”范畴，病机多为肺、脾、肾三脏虚损，复感外邪，属于本虚标实证。玉蝉卫肺丸为我院院内制剂，临床应用 余年，用于治疗肺脾气虚证变应性鼻炎，具有补益肺脾、益气固表、祛风止痒、敛涕通窍之功效，临床疗效显著。该药组成为黄芪、防风、白蒺藜、薏苡仁、蝉衣、玉竹、白芷。方中黄芪为君药，可补益肺脾、固腠理；防风、白蒺藜、薏苡仁、蝉衣、玉竹共为臣药，白芷为佐使药。诸药同用，补中有泻、收散并举、健脾益肺、散邪通窍。研究表明玉蝉卫肺丸在既往发作时间提前 周服用，可有效降低肺脾气虚证常年性变应性鼻炎患者症状 。前期 例患者的临床研究显示，玉蝉卫肺丸治疗变应性鼻炎肺脾气虚证总有效率达到 。玉蝉卫肺丸可降低 大鼠血清 含量，改善 大鼠鼻黏膜病理形态从而达到治疗 的作用 ，但其化学成分和作用机制尚不清楚，故本研究采用网络药理学方法及分子对接技术探讨玉蝉卫肺丸治疗 的活性成分及作用机制。资料与方法 网络药理学分析玉蝉卫肺丸治疗 的机制 玉蝉卫肺丸药物成分及靶点的筛选通过中药系统药理学数据库和分析平台 数据库 检索玉蝉卫肺丸中黄芪、白芷、防风、玉竹、薏苡仁、蒺藜、蝉蜕七种药物的化学成分，并以口服生物利用度（）、类药性（）为筛选条件 并通过查阅药典补充成分 ，获得玉蝉卫肺丸的活性成分。疾病相关靶点预测以“”为关键词，从 、和 数据库 检索筛选 的疾病相关靶点，通过 数据库（：）的基因名称将相关靶点标准化，物种选择为“”。构建玉蝉卫肺丸治疗 “药物 活性成分 靶点”网络选择玉蝉卫肺丸活性成分作用靶点和 疾病相关靶点取交集，获得共同靶点，绘制交集靶点的 图。使用软件 来构建玉蝉卫肺丸“药物 活性成分 靶点”网络，使用 插件分析网络，研究药物活性成分与靶点之间的关系。根据 值选出排名前 的关键靶点并选取排名前 中 种药物的关键成分。蛋白质互作网络构建及关键靶点筛选将“”下的交集靶点上传至 平台 ，物种选择为“”、获取玉蝉卫肺丸治疗 的靶点网络关系，导入 软件进行可视化分析，使用 插件工具分析网络拓扑参数，在同时满足大于等于 、中位数的条件下，根据 值选出排名前 的关键靶点。功能及 通路富集分析将交集靶点上传至 数据库，对靶点进行 功能及 通路富集分析，以 为筛选条件，获得玉蝉卫肺丸治疗 的 与 通路富集结果。分子对接验证选取“”下排名前 的活性成分，从 中下载活性成分的 文件。从“”下选取排名靠前且根据文献报道具有研究意义的蛋白质 ，在 蛋白数据库获得的大分子的结构文件，用 进行对接前处理。再用 软件进行分子对接。以对接评分来筛选结合活性较好的活性成分与靶点，对接得分 表明结合活性较佳，对接得分 两者之间有强烈的对接活性 。实验验证 动物 只 雄性大鼠，体质量（），由北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：（京），适应性饲养周，按随机数字表法分为空白组、模型组、玉蝉卫肺丸组，每组各 只。本研究经中国中医科学院西苑医院动物实验伦理委员会审核批准（审批号：）。试剂卵清蛋白（，生产批号：），（）（生产批号：），玉蝉卫肺丸为院内制剂 京卫药制字（）第 号，药物组成为黄芪、白芷、防风、玉竹、薏苡仁、蒺藜、蝉蜕，每丸含生药量 。造模除空白对照组外，其余组大鼠均进行 模型制备。基础致敏：和 （）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，溶于 氯化钠溶液混合后制成混悬液腹腔注射，隔日 次，共 次。空白对照组大鼠隔日 次腹腔注射 生理盐水。激发致敏：基础致敏结束后，予 每侧鼻腔各 滴鼻，次 ，连续 次。空白组大鼠每侧鼻腔 生理盐水滴鼻，次 ，连续 次。维持致敏：每天激发致敏，连续 周。治疗措施造模成功后，治疗组予玉蝉卫肺丸灌胃给药，根据前期实验结果采取中等剂量的玉蝉卫肺丸给药 ，鼻腔维持致敏 后，给予玉蝉卫肺丸粉 （），次 ，连续 周；模型组以等量生理盐水灌胃，次 ，连续 周。检测指标 鼻部症状评分治疗结束后 ，观察记录每只大鼠 的打喷嚏次数并进行计算 。鼻黏膜 染色治疗结束后 进行取材。大鼠麻醉处死后剥除鼻部皮肤，沿鼻中线剪开双侧鼻腔，剥离鼻中隔黏膜，放入 多聚甲醛固定。常规脱蜡，采用苏木素染色，水洗，脱水及透明封片，染色观察鼻黏膜组织形态。鼻黏膜免疫组化分析石蜡切片脱蜡，抗原修复，双氧水阻断，封闭，加一抗 ，孵育过夜，加二抗室温孵育 ，显色，苏木素复染，脱水封片，在光学显微镜 倍下拍片，用 图像分析软件分析鼻黏膜组织中 、蛋白的表达情况，计算 值。统计学方法采用 统计学软件分析数据，实验数据以均数 标准差（）表示。各组多变量之间的比较使用单因素方差分析进行检验，以 为差异有统计学意义。结果 玉蝉卫肺丸的主要活性成分及靶点预测获得黄芪化学成分 个、白芷化学成分 个、防风化学成分 个、薏苡仁化学成分 个、玉竹化学成分 个、蒺藜化学成分 个、蝉蜕化学成分个，去重后共获得玉蝉卫肺丸化学成分 个，化学成分对应的作用靶点 个。疾病靶点的获取检索 ，数据库分别获得靶点数目为 （筛选后为 ），（筛选后 ），和 。将所有疾病靶点除重后合并，最终得到 个 相关靶点。玉蝉卫肺丸“药物 活性成分 靶点”网络构建和分析将药物靶点和疾病靶点取交集共获得 个共同基因。并通过微生信绘制 图（结果见图 ）。利用 对玉蝉卫肺丸活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，结果见图 。通过 插件对网络进行拓扑分析，根据 得 到 排 名 前 的 化 学 成 分，即 山 奈 酚（）、槲皮素（）、豆甾醇（）、谷甾醇（）、甲基异粘菌素醇（）并选出排名前 中药物的代表性药效成分（结果见表 ），即欧前胡素（）、黄芪甲苷（）。注：蓝色节点代表疾病与玉蝉卫肺丸交集靶点；绿色节点代表药物成分；橙色节点代表药物名称图 药物 疾病靶点 图 玉蝉卫肺丸治疗 的 网络构建将 个共同靶点上传至 数据库，获得 网络信息并利用 构建靶蛋白 网络。结果见图 。通过 插件对网络进行拓扑分析，根据 、得到排名前 的靶点，结果见表 。功能富集分析利用 对玉蝉卫肺丸治疗 的 个共同靶点进行 富集分析，对前 项进行可视化（见图 ）。根据校正后 值，以 为筛选条件获得生物过程（，）、细胞组分（，）、分子功能（，）分别为 、条，玉蝉卫肺丸治疗变应性鼻炎的主要生物学过程包括转录正调控（世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 “药物 活性成分 靶点”网络表 玉蝉卫肺丸部分活性成分序号 黄芪、蒺藜 黄芪 薏苡仁、白芷 防风、白芷 黄芪 黄芪、蒺藜 防风 黄芪 ，黄芪 防风、白芷 （，），黄芪 黄芪 （）（）（）玉竹、蒺藜 黄芪 防风 防风、白芷 防风、白芷 黄芪 蒺藜、防风、薏苡仁 防风、白芷、薏苡仁 ）、炎症反应（）；分子功能主要为蛋白结合（）、蛋白酶结合（）。通路富集分析通过 对玉蝉卫肺丸治疗 的 个共同靶点进行 富集分析，进行可视化分析。结果见图 。以 为筛选条件，得到 条信号通路，图中显示了玉蝉卫肺丸治疗变应性鼻炎排世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 玉蝉卫肺丸治疗 的 功能富集分析图 玉蝉卫肺丸治疗 的 通路富集分析表 关键靶点序号 名前 的信号通路，关键通路包括：信号传导途径（）、脂质与动脉硬化（）、细胞分化（）、信号传导途径（）、炎症性肠病（）、百日咳（）、样受体信号传导途径（）、细胞受体信号传导途径（）。分子对接结果从核心靶点前 中选取排名前 和 细胞因子中的特征因子 和 细胞因子中的特征因子 。共五个核心靶点，即 （：）、（：）、（：世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 分子对接结果图 玉蝉卫肺丸部分核心化合物分子对接模式 ）、（：）、（：）与核心成分中选取排名前 的槲皮素、山奈酚、豆甾醇、谷甾醇、甲基异粘菌素醇及药物的关键活性成分黄芪甲苷、欧前胡素进行分子对接。总共得到 个受体 配体对接结果，对接结果显示 的对接结果 ，表明所筛选的核心靶点和核心化合物成分之间有较好的结合活性（结果见图 ）。选取与关键靶点对接分数最高的对接组合进行展示（结果见图 ）。其中黄芪甲苷与 的对接得分最高，结合能为 ，且与关键靶点对接均显示较好的结合活性，从而佐证了君药选择的合理性。各组大鼠打喷嚏症状比较与空白组比较，模型组大鼠打喷嚏次数明显增加，差异有统计学意义（）；与模型组比较，玉蝉卫肺丸组打喷嚏次数明显减少，差异有统计学意义（）。结果见图 。各组大鼠鼻黏膜 染色结果空白组鼻黏膜上皮细胞排列紧密，完整有序，无血管扩张，无明显炎症细胞浸润；模型组大鼠鼻黏膜上皮脱落，大量炎症细胞聚集；玉蝉卫肺丸治疗组鼻黏膜可见轻微黏膜水肿，少量炎症细胞浸润。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：与空白组比较，；与模型组比较，图 各组大鼠打喷嚏次数比较结果见图 。各组大鼠鼻黏膜 、蛋白表达比较各组大鼠鼻黏膜 、阳性表达免疫组织化学图，阳性表达物呈棕黄色或棕褐色（结果见图 ），免疫组化染色结果分析显示，与空白组比较，模型组大鼠鼻黏膜 表达水平升高，表达水平降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，玉蝉卫肺丸组 表达水平降低，表达水平升高，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 各组大鼠鼻黏膜 、蛋白表达比较（）组别 平均光密度（）平均光密度（）空白组 模型组 玉蝉卫肺丸治疗组 注：与空白组比较，；与模型组比较，讨论 的发病机制主要为 细胞间免疫反应失衡，致敏阶段变应原进入鼻腔初始 细胞向 细胞分化，细胞分泌 使 细胞转化产生 ，结合于肥大细胞和嗜碱细胞表面受体。激发阶段速发相变应原与 结合引起炎性介质释放，迟发相细胞因子导致嗜酸性细胞的浸润、集聚加图 各组大鼠鼻黏膜 染色（染色，）图 各组大鼠鼻黏膜 、蛋白表达比较（免疫组化，）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，重炎性反应。与 联合激活 和 信号通路，放大嗜酸性粒细胞的炎症作用，样受体可激活固有免疫和适应性免疫，从而激活下游 信号通路，促进炎性细胞因子的表达，加重炎症反应。信号通路的关键靶点 可促进 分化，诱导 介导的型变态反应 ，。本研究共筛选出核心成分有槲皮素、山奈酚、谷甾醇、豆甾醇、甲基异粘菌素醇、欧前胡素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷。槲皮素是一种多酚类黄酮，可以抑制人体肥大细胞系 中促炎细胞因子表达 、显著增高鼻上皮细胞硫氧还蛋白，对于变应性鼻炎及过敏性哮喘都存在抑制变态反应的作用 。山奈酚目前已知可以缓解癌症、过敏和炎症等疾病，通过调节与 相关的 信号通道来缓解气道炎症 ，并抑制哮喘小鼠肺组织中 表达水平 。谷甾醇一种植物甾醇，有抗炎、抗氧化、调节免疫系统等作用 ，有研究表明 谷甾醇能够改善 诱导的过敏性哮喘大鼠气道炎症和氧化损伤，调节 免疫失衡及氧化应激反应 。甲基异粘菌素醇是黄芪的成分之一，目前相关研究仅限于网络药理学中提及，其相关作用机制有待进一步探索。欧前胡素又称白芷乙素，具有抗菌、平喘及抗过敏等作用。中华人民共和国药典（一部）已确立了白芷的质量标准，即利用高效液相色谱法测定白芷中欧前胡素的含量。研究表明，欧前胡素的可剂量依赖性降低大鼠的被动皮肤过敏反应，抑制 诱导的肥大细胞释放 、和组胺 。黄芪甲苷（又称黄芪皂苷）是黄芪的主要成分之一，研究表明黄芪甲苷可以抑制鼻上皮细胞中组胺诱导的细胞因子 、和 的分泌和表达，并且抑制相关炎症基因的上调 。张飞和田滢 发现经黄芪甲苷可有效缓解 小鼠症状，减轻鼻黏膜组织损伤，减少外周血中 细胞，显著降低血清中 、及 水平，其机制可能与调节 细胞平衡有关，与本研究 通路分析结果一致。毛蕊异黄酮是来源于黄芪根部的天然植物雌激素，可以抑制 表达，降低 水平而发挥抗炎作用 。本研究获得玉蝉卫肺丸治疗 的关键靶点有 、。其中，是由多种细胞产生，可促进 细胞分化产生 ，研究表明其水平增高与 严重程度呈正相关 。主要由活化的单核 巨噬细胞产生，作为能杀伤和抑制肿瘤细胞的细胞因子，是重要的炎症介质，并与 有明显正相关 。的发病机制主要为 和 细胞间免疫反应失衡，其中 是 特征因子，参与细胞免疫。是 特征因子，主要刺激 细胞产生抗体，参与体液免疫，引起型变态反应 。细胞是独立于 及 的 细胞亚群，它通过释放前炎症细胞因子来放大炎症反应，调节 细胞因子 、，进而调控 的发生发展。在过敏反应、自身免疫性疾病和其他炎症反应中起关键作用 ，与 联合激活 、和 信号通路，可以放大嗜酸性粒细胞的炎症作用 ，而 诱导的嗜酸性粒细胞浸润被认为是超敏反应的核心机制。此外，皮质类固醇是控制过敏反应的有效方法之一，但类固醇耐药是难治性过敏的主要原因 。最近的研究表明，可以通过介导糖皮质激素受体 失调来调节肥胖哮喘患者的类固醇低反应 。临床研究表明 患者 、水平高于健康对照组，低于健康对照组，三者之间存在相关性 。本研究通过动物实验验证，玉蝉卫肺丸可改善 大鼠的鼻部打喷嚏症状和鼻黏膜病理形态，调控核心靶点 、，调控 细胞间免疫反应。综上所述，本研究结果显示了玉蝉卫肺丸具有多成分、多靶点、多途径协同作用的分子机制，核心靶点为 、，、细胞分化可能是玉蝉卫肺丸治疗 ，调节炎症反应作用的关键途径，君药黄芪中的有效成分黄芪皂苷是玉蝉卫肺丸发挥作用的关键活性成分。本研究相关的药物靶点和作用机制可能是玉蝉卫肺丸治疗 机制的进一步探索方向。参考文献 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会鼻科组，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组 中国变应性鼻炎诊断和治疗指南（年，修订版）中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，（）：，（），（）：刘锦，戴璐璐，蔡婷婷，等 玉蝉卫肺丸预防季节性变应性鼻炎的临床研究 中国中西医结合杂志，（）：世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，李蕾，白桦 玉蝉卫肺丸治疗变应性鼻炎临床观察 中国中西医结合杂志，（）：李蕾，张路，杨斌，等 玉蝉卫肺丸对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜病理形态及 含量的影响 北京中医药，（）：，：，（）：，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典：年版一部 北京：中国医药科技出版社，：，：（），（）：，：（），（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：（），（）：潘刚强，袁岳沙，陈杰 细胞因子在变应性鼻炎患者中表达 中国耳鼻咽喉头颈外科，（）：，（）：张启迪，祝婉婷，邹知欣，等 小鼠局部变应性鼻炎耐受模型的研究 临 床 耳 鼻 咽 喉 头 颈 外 科 杂 志，（）：，（）：袁安蕾，明雨，张欣怡，等 基于网络药理学及分子对接技术探讨紫辛鼻鼽颗粒治疗变应性鼻炎的作用机制 中国中药杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）（），（）：陈元，曾奥，罗振辉，等 谷甾醇药理作用研究进展 广东药科大学学报，（）：贾菊芳，曾梦楠，张贝贝，等 谷甾醇对 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