基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟抗动脉粥样硬化的作用机制.pdf

天然产物研究与开发NatProd Res Dev 2023,35:1977-1990基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟抗动脉粥样硬化的作用机制张哲,王蓓,唐根云,饶利兵,林广州医科大学研究生院，广州510 0 0 0；2三亚中心医院（海南省第三人民医院），三亚57 2 0 0 0；3湖南医药学院，怀化418 0 0 0摘要：运用网络药理学探究海巴戟治疗动脉粥样硬化（atherosclerosis，A S）的机制及实验验证研究。利用CMAUP、TCMSP、Sw i s s A D M E数据库检索并筛选海巴戟的活性成分，分别在GeneCards、O M IM、T T D、Ph a r m G K B及Drugbank数据库中设置筛选条件检索去重后得到AS靶点。通过STRING数据库构建蛋白互作网络（PPI），采用R语言对交集靶点进行GO和KECG富集分析。构建THP-1源性巨噬细胞模型进行体外实验验证，通过CCK-8实验筛选海巴戟给药浓度,采用油红O染色和2 2-NBD-Cholesterol 细胞荧光方法检测海巴戟干预后模型细胞内胆固醇含量的变化,再使用RT-PCR、W B实验检测和验证所预测的信号通路。结果显示从海巴戟中共筛选出活性成分59 个，靶点332 个,参与治疗AS的交集靶点154个，包括PPARG、M M P9、IL-6、CCL2 等；GO富集分析得到2 8 44个条目，前10 个条目主要包括调节细胞膜受体与核受体等生物学功能,KEGG富集分析得到18 2 个条目，前2 0 个条目主要包括脂质代谢与动脉粥样硬化、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路等。在验证实验中,首先利用CCK-8实验筛选出了合适的海巴戟浓度（10、2 0、40 g/mL），油红0 染色和2 2-NBD-Cholesterol细胞荧光结果显示海巴戟可促进THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出，且呈剂量依赖性;RT-PCR、W B结果显示海巴戟可激活PPAR信号通路，增加PPAR和ATP结合盒转运蛋白A1（A BCA 1）的表达。GW9662阻断PPAR信号通路后海巴戟促进THP-1源性巨噬细胞内胆固醇的流出能力下降,且PPAR和ABCA1表达随之下调。因此，运用网络药理学结合实验验证揭示海巴戟可能通过激活PPAR信号通路促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇的流出而改善AS。关键词：海巴戟；网络药理学;过氧化物酶体增殖物激活受体;胆固醇逆转运；动脉粥样硬化中图分类号：2 8 5.5D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.11.016Mechanism of Morinda citrifolia against atherosclerosis based onnetwork pharmacology and experiment verificationZHANG Zhe,WANG Bei?,TANG Gen-yun,RAO Li-bing,LIN Ling2*木玲2*文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-19 7 7-14Graduate School of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510000,China;2 Sanya Central Hospital(Hainan Third Peoples Hospital),Sanya 572000,China;3 Hunan University of Medicine,Huaihua 418000,ChinaAbstract:To investigate the mechanism and experimental verification of Morinda citrifolia in the treatment of atherosclerosis(AS)via network pharmacology.CMAUP,TCMSP and SwissADME databases were used to search and screen the active in-gredients of M.citrifolia.The AS targets were obtained after setting screening conditions in GeneCards,OMIM,TTD,PharmGKB and Drugbank databases.The protein interaction network(PPI)was constructed using STRING database,and theGO function enrichment analysis and KEGG pathway analysis for intersection targets were performed using R language.TheTHP-1-derived macrophage model was constructed for in vitro experiment verification.The concentration of M.citrifolia wasscreened by CCK-8 assay.Oil red O staining and 22-NBD-Cholesterol fluorescence assay were used to detect the intracellular收稿日期：2 0 2 3-0 2-0 9基金项目：海南省自然科学基金（8 2 1QN432）*通信作者Tel:86-898-38281818;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 5-2 91978cholesterol in the model cells following the treatment of M.citrifolia.A total of 59 active ingredients,332 targets and 154 tar-gets associated with AS,such as PPARG,MMP9,IL-6 and CCL2,were screened from M.citrifolia.GO function enrichment a-nalysis obtained 2 844 items,and the top 10 items mainly included biological functions such as regulating cell membrane re-ceptors and nuclear receptors.KEGG pathway analysis obtained 182 items,which of the top 20 items primarily contained lipidmetabolism and atherosclerosis,peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)signaling pathway,etc.In vitro experi-ments were performed to validate the appropriate concentration of M.citrifolia(10,20,40 g/mL)screened by CCK-8 assayfirstly.Oil red O staining and 22-NBD-Cholesterol cell fluorescence found that M.citrifolia promoted cholesterol eflux ofTHP-1-derived macrophages in a dose-dependent manner.Subsequently,RT-PCR and WB assays showed that M.citrifolia ac-tivated PPAR signaling pathway and increased the expression of PPARy and ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1)significantly.The capability of M.citrifolia to promote cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages was decreased dramat-ically,and the levels of PPAR and ABCA1 were down-regulated after blunting PPARy signaling pathway by GW9662,PPAR inhibitor.Therefore,network pharmacoloty combined with experimental validation in vitro indicated that M.citrifoliacould ameliorate atherosclerosis by promoting cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages via PPAR signaling path-way.Key words:Morinda citrifolia;network pharmacology;PPARy;reverse cholesterol transport;atherosclerosis动脉粥样硬化（atherosclerosis，A S）是一种以大、中动脉血管内膜形成粥样斑块或纤维斑块为特征的常见慢性心血管疾病 1。动脉内膜中的脂质渗人现已成为AS的主要发病机制 2 。聚集在内膜与中膜的巨噬细胞通过细胞膜上的清道夫受体吞噬大量的低密度脂蛋白（oxidized lowdensitylipopro-tein,ox-LDL)后形成泡沫细胞,驱动细胞释放大量的促炎因子、基质金属蛋白酶于细胞间隙,促使动脉管壁中的斑块蓄积增加,进而转为不稳定斑块,最终进展为心肌梗死 2 。然而有效延缓 AS 的进展一直是困扰学术界的难题之一。近年来备受欢迎的新兴药食同源之品海巴戟被证明其有良好地调节血脂，改善AS的作用 3海巴戟（Morinda citrifolia），又称诺丽（Noni）为茜草科巴戟天属植物,具有抗炎、抗氧化、降脂等药理作用 4。根据中医理论,海巴戟药味酸、甘,药性平和,有补益肾精、平补阴阳及延缓衰老之功效,可有效预防心脑血管疾病 5。然而,海巴戟治疗 AS的具体机制尚不清楚。鉴于海巴戟的化学成分复杂,其主要由葱醌类、黄酮类、苯丙素类、酚酸类等成分组成 7 ,符合传统中药的多成分、多靶点的特点，因此使用网络药理学可较清楚地阐述海巴戟发挥药理作用的分子机制。近年来网络药理学是一门以计算机科学、生物信息学及数据挖掘为一体的新兴学科,它通过构建“药物-有效成分-疾病靶点-疾病”网络,并对该网络进行生物学功能解释,使人们更加清楚地认识到药物治疗疾病的机制机理 6 。本研究基于海巴戟有效成分多样，作用靶点丰富的特点,拟天然产物研究与开发采用网络药理学方法,对海巴戟治疗AS的靶点、生物学过程、信号通路预测和分析,同时采用体外实验进行验证,以期为治疗AS的药物开发和治疗提供药理学依据。1材料与方法1.1丝细胞与主要试剂THP-1细胞（货号：CL-0233,武汉普诺赛生命科技有限公司）；海巴戟萃取粉（货号：0 0 0 3S,海南西沙诺丽生物科技有限公司）；胎牛血清（货号：10 2 7 0-106,美国Gibco公司）；RPMI1640培养基（货号：C11875500BT,美国Gibco公司）；佛波酯（PMA）（货号：P1585,批号：SLCD3659,美国Sigma）；油红0 染色试剂盒（货号：0 139 1,美国Sigma）；人源性氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）（货号：YB-002，广州奕元生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（货号：GK10001；GlpBio公司）;2 2-NBD-Cholesterol（货号：GC46527,美国GlpBio公司）；TRIzol（货号：ER501-01-01,北京全式金生物技术股份有限公司）;cDNA逆转录试剂盒（货号：AT311-03,北京全式金生物技术股份有限公司）；PPAR、A BCA 1引物（货号：0 0 7 P20220307，北京擎科生物科技有限公司）；抗PPAR抗体（货号：ab178860，英国Abcam公司）；抗ABCA1抗体（货号：A-7228，武汉ABclonal公司）;PPAR抑制剂GW9662（货号：A4300,美国APExBio公司）。1.22主要仪器多功能酶标仪（美国BIOTeK公司）;倒置相差显微镜（美国Olympus公司）；倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；低温高速冷冻离心机（美国ThermoVol.35Vol.35公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；转膜仪（美国Bio-Rad公司）；化学荧光凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）;PCR仪（美国Bio-Rad公司）。1.3海巴戟有效成分靶点及疾病靶点收集在 CMAUP 数据库（https:/www.bidd.group/CMAUP)中利用关键词“Morinda citrifolia检索其有效成分 7 。活性成分的筛选：在CMAUP数据库的“Ingredient of the Plant功能区中选择实验已验证的有效成分,其他未经验证的成分以化合物名称或者SMILES 格式分别在TCMSP数据库（https:/tcmsp- SwissADME数据库（http:/www.swissadme.ch/）中筛选。TCMSP数据库筛选标准为口服生物利用度（oral bioavailability，O B）30%,且类药性（drug-likeness,DL）0.18;Sw i s-SADME数据库需满足“药代动力学”与“类药性”两个特征。通过文献检索又补充了部分活性成分 7 。疾病靶点的获取借助“GeneCards”（h t t p s:/www.genecards.org/）、“O M IM”（h t t p s:/o mi m.org/）、“T T D”（h t t p:/d b.i d r b l a b.n e t/）、“PharmGKB”（h t t p s:/w w w.p h a r mg k b.o r g/）、“DrugBank”（h t t p s:/g o.d r u g b a n k.c o m/）五个数据库,以“atherosclerosis”为关键词在各数据库中检索，其中“GeneCards”中设置筛选条件,即“score”1。删除或合并各数据库中检索得到的重复基因。将获取的海巴戟有效成分靶点与疾病靶点取交集，导人R语言4.2.1中,使用“venn”包作图。1.4海巴戟治疗 AS疾病蛋白互作网络(PPI)构建及核心网络筛选将得到的交集基因导入 STRING在线数据库构建PPI，下载同时生成的“.tsv”格式文件导入Cyto-scape3.7.2计算各节点的自由度并对其可视化操作,然后利用软件中“CytoNCA”插件 6 根据“介数”“接近中心性”“自由度”“特征向量”“基于局部平均连接度方法”“网络中心性”6 个拓扑学参数对各个节点评分,经过筛选后得到靶点的核心网络,筛选条件为核心基因均须大于6 个拓扑参数的中位数分值。1.5(GO功能富集分析及KEGG通路富集分析使用 R语言 4.2.1 中“org.Hs.eg.db”“cluster-Profiler”及“enrichplot”包计算交集基因的GO富集与KEGG富集条目，再使用“ggplot2包”分别作图，其中GO富集中的细胞成分（cellular component，CC）、生物学过程（biological process,BP）和分子功张哲等：基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟抗动脉粥样硬化的作用机制1979能（molecularfunction，M F）显示排名前10 的条目；KEGG通路富集显示排名前2 0 的条目。1.6体外实验验证1.6.1分组与造模先使用10 0 ng/mL PMA预处理THP-1 细胞48h,然后将 THP-1源性巨噬细胞分为6 组:正常对照组、模型组、海巴戟低浓度组、海巴戟中浓度组、海巴戟高浓度组、海巴戟高浓度组+PPAR抑制剂GW9662组。除正常对照组外,其余各组均需与50g/mL ox-LDL共孵育48 h;而海巴戟低、中、高浓度组需加人各浓度的海巴戟萃取液（海巴戟萃取粉溶于RPMI1640培养基中配成海巴戟萃取液)并与ox-LDL共孵育48 h;海巴戟高浓度组+PPAR抑制剂GW9662组在共孵育前2 h加人10 mol/LGW9662预处理;正常对照组使用无血清RPMI 1640培养基培养48 h。1.6.2CCK-8 实验取对数生长期的 THP-1 细胞,利用细胞计数板计数，调整细胞浓度每孔2 10 4个,使用10 0 L含100ng/mLPMA工作液将细胞接种于9 6 孔板中,组别设置空白组和海巴戟8 个不同浓度组（0、10、2 0、40、8 0、16 0、32 0、6 40 g/mL）其中0 浓度组为对照组,每组设置3个复孔。分别培养2 4 h、48 h 后，检测前每孔加人10 L CCK-8试剂后继续于细胞培养箱中培养2 h。然后使用多功能酶标仪检测450 nm波长的吸光值（OD值）,实验重复3次。按公式（1)计算细胞存活率。细胞存活率=（A 实验组=A空白组）（A对照组 A空白组）10 0%（1）1.6.3油红0 染色取灭菌的细胞爬片分别放置于12 孔板中,将对数生长期的细胞接种于各孔，每孔细胞的数量调整为310 5个，每组设置2 个复孔。待PMA诱导48h后,分别向各组中加入 ox-LDL及不同浓度的海巴戟共孵育48 h,弃上清,PBS溶液洗3次。4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次，向每孔中加人1mL的油红0 工作液并于37 烘箱避光孵育30 min，60%异丙醇分色10 s,PBS清洗3次,待自然晾干后滴加甘油封片，使用倒置荧光显微镜拍照保存。1.6.422-NBD-Cholesterol 细胞荧光将处于对数生长期的各组细胞接种于9 6 孔板中,每孔细胞数量调整为110 4个,每组设置5个复孔。待各组给药处理完成后，弃去上清，每孔加人1980100 L浓度为1 g/mL 22-NBD-Cholesterol 工作液共孵育2 4h,PBS洗3次,避光条件下迅速于多功能酶标仪测量荧光值和倒置荧光显微镜下拍照保存。1.6.5RT-PCR检测各组细胞中PPAR、A BCA 1mRNA的表达消化各组加药处理后的细胞，收集于离心管中，离心后取上清,PBS清洗1次，各组加人0.5 1mL的TRIzol冰上裂解3min，分别加入氯仿、异丙醇、无水乙醇离心分离提取总RNA,使用cDNA逆转录试剂盒逆转录成cDNA。PCR反应中模板定量为1g,2Fine TaqMix25L,上游引物、下游引物各1L,其中引物序列见表1。PCR反应经历94预变性、94变性、56 退火、7 2 延伸、7 2 再延伸，得到扩增后产物。配置2%琼脂糖凝胶，上样后进行DNA电泳，于凝胶成像显影仪拍照,计算mRNA的相对表达量。表1引物序列Table 1IPrimer sequences基因引物序列GenePrimer sequence(53)PPARYF:TGCACTGGAATTAGATGACAGCR:TCCGTGACAATCTGTCTGAGGABCA1F:GTCCTCTTTCCCGATTATCTGGR:CACTCACTCTCGCTCGCAATGAPDHF:CTCCTCCACCTTTGACGCTGR:TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG1.6.6Western blot检测各组细胞中PPAR、A B-CA1 蛋白的表达向各组加药处理后的6 0 mm细胞培养皿中加人裂解液10 0 L并在冰上裂解30 min,收集细胞悬液后离心,取上清用BCA法检测各组蛋白的浓度后MOL IDMOL000003MOL000006MOL000040MOL000073MOL000098MOL000103MOL000114MOL000131MOL000216天然产物研究与开发调整各组蛋白浓度一致,加入上样缓冲液后10 0 煮沸10 min配制成样品。配置8%、10%的SDS-PAGE凝胶,电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭1.5h，一抗孵育过夜（抗PPAR抗体：1:10 0 0；抗ABCA1抗体:1:10 0 0）,次日TBS-T洗膜3次，二抗孵育1h，均匀滴加高敏化学发光液后显影,利用ImageJ软件分析目的条带与内参条带的灰度值,计算目的条带/内参蛋白的比值。1.7丝统计学分析上述实验分别独立重复3次。实验数据使用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料使用均数标准差（xs)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差（one-way ANO-VA)分析,并使用Tukey检验进行组间差异比较,以P0.05 为差异有统计学意义。采用 GraphPadPrism8软件进行作图。2结果2.1海巴戟有效成分靶点及疾病靶点在CAMUP数据库中得到实验验证的有效成分有17 个及7 3个疾病靶点,TCMSP数据库、Swis-sADME数据库及检索文献去重后共获得有效成分42个,相关疾病靶点2 59个。因此海巴戟中共检索到59个有效成分（见表2）,332 个相关疾病靶点。分别从“GeneCards”“OMIM”“TTD”“PharmGKB”“DrugBank”数据库中检索到AS相关靶点为142 8个、2 个、35个、4个和45个，去重后得到的靶点1461个靶点。与海巴戟有效成分靶点的交集靶点为154个（见图1）。使用Cytoscape软件绘制海巴戟有效成分与交集靶点网络图，根据各节点的“degree设置节点的颜色，“degree”越高颜色越趋于蓝色（见图2)。表2 海巴戟的有效成分Table 2 Effective ingredients of M.citrifolia成分Ingredient甘露醇Mannitol木犀草素 Luteolin羟基甲氧苯并吡喃酮Scopoletol表儿茶酸（+）-Epicatechin皮素 Quercetin苦味酸Picricacid香草酸Vanillicacid亚油酸 Linoleic acid东芸苷ScopolinVol.35分子式MolecularformulaC,Hi4 0Cis Hio O6CioH,04CisHi4 06Cis Ho O7C,H.O3C,H 04C1sH32 02CicH1:0,Vol.35续表 2(Continued Tab.2)MOL IDMOL000252MOL000263MOL000296MOL000303MOL000339MOL000346MOL000359MOL000360MOL000365M0L000414MOL000415MOL000422MOL000449MOL000476M0L000481MOL000511MOL000513MOL000635MOL000675MOL000748MOL001442MOL001691MOL001842MOL002046MOL002049MOL002771MOL002830MOL002836MOL003135MOL003178MOL003578MOL003686MOL004328MOL004348MOL004456MOL005021MOL005125张哲等：基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟抗动脉粥样硬化的作用机制3,4,5-三羟基苯甲酸3,4,5-Trihydroxybenzoic acid5-羟甲基糠醛5-Hydroxymethylfurfural叶绿醇Phytol抗坏血酸 Ascorbic acid松脂醇 Pinoresinol已酸Hexanoic acid4-羟基-3-甲氧基肉桂醛4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde维生素EVitamin E对甲酚 P-cresol茴香醛Anisaldehyde鸡屎藤次苷Scandoside2,5-二羟基苯甲酸2,5-Dihydroxybenzoic acid环阿屯醇Cycloartenol水仙苷Narcissoside柚皮素Naringenin对羟基苯甲酸甲酯Methylparaben七叶树苷Esculin邻苯二甲酸二甲酯Dimethyl phthalate4-甲氧基苯甲酸4-Methoxybenzoic acid1981成分 Ingredient分子式Molecular formula法尼醇FarnesolCis H26 0齐墩果酸Oleanolic acidC3o H4:03常春藤素 HederageninC3o H4s 04羊脂酸Caprylic acidCsHi602异亭IsoscopoletinCio H,04琥珀酸Sucinic acidC4H.04-谷笛醇-sitosterolC2g H5o O阿魏酸Ferulic acidCoHio 04丁香脂素 SyringaresinolC2 H26 0:咖啡酸酯CaffeateC,H:04芦丁RutinC27 H30 016山奈酚KaempferolCis Hio 06豆醇 StigmasterolC2gH4s 0大黄酚PhyscionCicH12 0;染料木素 GenisteinCisHio Os乌索酸 Ursolic acidC3o H4s 03C,H.Os香草醛VanillinC.H.O3十八烯酸OleicacidCis H34 O2C.H.O3C2o H40 0CH:O6C20H2 06C,H2 02CioHioO3C2g H50 O2C,H:0C.H:02CHi4 06C,H.04C3o H5o 0C2s:H32 016Ci,H/2 0sCsHO;CisHi6O,CioHio 04C.H:O31982续表 2(Continued Tab.2)MOL IDMOL005812MOL006142MOL006162MOL007563MOL007930MOL008143MOL009292MOL009537MOL009547MOL009551MOL012254M0L013087MOL013092天然产物研究与开发成分 Ingredient柚皮苷Naringin1,3-二羟基-2-乙氧甲基-9,10-葱醌Lucidin ethyl ether去甲基虎刺素 Nordamnacanthal鹅掌楸树脂酚B二甲醚Yangambin橙皮素Hesperidin篦麻油酸 Ricinoleic acid五羟黄酮Tricetin美商陆素AAmericanin A去乙酰基车叶草苷酸Desacetyl asperulosidic acid异虎耳草素Isoprincepin菜油笛醇 Campesterol前胡香豆素 II Peucedanocoumarin II北美芹素PteryxinVol.35分子式Molecular formulaC27 H32 014Ci7Hi4 OsCisH,OsC24H3o 0C28 H34 O1sCigH34 03Cis HioO7CisHi6 06Ci6H22 O 11C27 H26 0C2s H4s OC2;H2 07C2;H22 07海巴戟Morindacitrifolia动脉粥样硬化Atherosclerosis1781541307图1有效成分与疾病交集靶点Fig.1Intersection targets of active ingredients and diseaseAtherosclerosisMorndaclirifoliaPIGSICCL2EDNIMMP10MMP2CCNA2MAPKIPTENPIPNIESRIIGS2VEGFATGFBI16CDC42PPARDF3MOL000635-MOL012254MOLOO0S13MOL.013092MOL000360MOL0OH348MOLD0283MOL000114MOL000073MOL.006142MOL000422MOL00955LMOL000365MOL002836MOL.000481-MOL003178MOL007563MGL00098MOL0003 MOL005812MOL00021GMOL039 MOL006162MOL000263MOL001842MOL000414MOL.008143ARGSTMI儿UNNRI3AKTIC5ARISOATIMOL0003591OL002049MOL000232MOL0000-40L.00432OL005021MOL001442OLA953MOL000675OL.0027OL009292MOL000296MOLD0044OL:00204MOL00512MOL000346MOL004456MOL00051MOL.000006MOL003686MOL.000748MOL001691图2 汽海巴戟有效成分与交集靶点网络图Fig.2 Network diagram of active ingredients of M.citrifolia and intersection targetsMAT2ABCL2IRFIADRBZDPP4MDM2PRKDCCHUKGIAIPCNANOS3MPOAKRIBIRUNX2SELECD4OLGPRKCBNO52PTGESIFNGCYP3A4SODIPLATMMP3MMP9ELKILILTHBDBDNFCATCISDMAOBCYPIAIMYCLCP3PECAMICSF2PONIL003133MOL400103MOL.0004761L2HTR2ACRP非4SLC2A4IL1BIGFBP3NOS1LTA4HPRKCAEP300AGXTADIHICGSK3BAPPCTSATIMGCRIKBKBTXNRDIPLGHSPBIIL10HFIACDKN1ASERPINEIALOX5APSRCSTAT1ICAMIINFRXRAXDIIVCAMICXLIOCOL3AISCNSAITGB2FPARAPARPICOLIAIF10MAPK8NFKBIACREBIABCAICAVISPPIBAXNR3C2INSLCTABCG2SLC2A2FASL.GEGFMAOACCP2RELACASPITBXA2RCASP3STAT3FASVF2ADRBIGCGPIK3CGRAFIPPARGCDKN2ANFE2L2F7ADHIHIGF2CETPEGFRCHEK2NRI2OCNDIINSRFOSPLAUCXCL8NCOA2CHRNA7TP53RBIMMPIGSTPIAHRTIMOxINCFIILIAVol.352.2PPI构建及核心网络构建将交集靶点导人STRING数据库中在线生成PPI图,在Cytoscape软件中对其可视化，交集靶点邻接节点个数越多,颜色愈趋于蓝色（见图3）。使用软件的插件“CytoNCA”对PPI网络的核心网络进行筛选，纳入同时大于各项拓扑参数中位数分值的靶点进行下一级分析,共完成两级核心网络创建,最CHEK2CYPA4PIKBCGFOSPRRDCBC12HSPBDPPTEHIDARRPNCOA2CASPSERPINEIAHRMNIPUCP3IKBKBNOS2GF2COBATCHIPFI0ASINEEDNSEETGB2HMGCRELKIMMP2PECAMSSODIGFBP3SOATIPTSIUA图3海巴戟治疗AS的蛋白互作网络(PPI)Fig.3PPI network of M.citrifolia in the treatment of AS张哲等：基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟载抗动脉粥样硬化的作用机制1983后得到的核心网络中包含核心节点为2 8 个,7 16 条边（见表3)。筛选得到的核心靶点相邻节点越多，圆形面积越大且颜色越蓝（见图4）。值得注意的是,核心网络中含有大量与脂代谢及炎症相关的基因,如PPARG、M M P9、IL-6、CCL2 等，这些均是促进AS发生发展的直接关联基因。NR113PPARDPONAICAMADRBICCNA2ABCG2PARPPRRCBHMOXIADRB2NMPOMAPK8GSK33INSCYPAICIKSIACASP3C02RXRAPPARAUCP2STAT3PTENCASROMAPKIRUNGNCFXNEKBIAESRIPRRC/ONTMMPIOABDNTBDMAOABXA2RAL.OXSAPCHRNA7AGXTCTSDREDKTCTSBSLTAIPTCNR3C2M2AMEDKNPLATEP300GSTP1PPARGNDTXNRDINR112TP-3CDHOLG1MIMPSLC2A2NOSXOSFGSTMIHTR2APTGESAKRIBIMAOBXDIILTA4HADHIBLCTVEGFACSARISONSAADHIC表3核心网络节点拓扑参数Table 3Topological parameters of the nodes in the core network接近中心性基因介数BetweennessGeneCentralityCXCL813.23EGF16.12CCL210.80TGFB18.63VEGFA19.04PPARG15.58IL109.94HIF1A15.68NFKBIA9.63FOS12.96基于局部平均连接度方法自由度特征向量ClosenessLocal average connectivity-DegreeEigenvectorCentrality0.930.970.920.881.000.950.900.970.880.92网络中心性Networkbased methodCentrality520.15540.15510.14480.14560.15530.15500.14540.15480.13510.1443.4244.3043.3341.2945.1843.3642.7644.3741.0042.5550.0652.8849.0144.9556.0051.0747.7052.9344.8148.501984续表 3(Continued Tab.3)基因GeneIL1BJUNCASP3INSPTGS2STAT3MMP9NOS3SRCICAM1CATEGFRTNFAKT1TP53IL6MYC天然产物研究与开发接近中心性介数 BetweennessClosenessCentralityCentrality14.920.9719.041.0019.041.0019.041.0019.041.0019.041.0017.720.9810.760.8914.420.9511.120.899.460.8913.870.9319.041.0017.270.9819.041.0019.041.0012.080.90Vol.35基于局部平均连接度方法网络中心性自由度特征向量Local average connectivity-DegreeEigenvector540.15560.15560.15560.15560.15560.15550.15490.14530.15490.14490.14520.15560.15550.15560.15560.15500.14Networkbased methodCentrality44.6353.1045.1856.0045.1856.0045.1856.0045.1856.0045.1856.0044.6554.3341.3545.9543.8951.4641.2745.9141.9646.1