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(完整版)核酸外切酶、内切酶、聚合酶、连接酶核酸外切酶（exonuclease） 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）.按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 单链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶（exo）和核酸外切酶（exo）。核酸外切酶(exo）能够从5-末端或3末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶.核酸外切酶（exo)可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子. 双链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶（exo)、噬菌体核酸外切酶（exo）以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等。大肠杆菌核酸外切酶（exo )具有多种催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按35的方向从3-OH末端释放5单核苷酸。大肠杆菌核酸外切酶（exo）通过其35外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 噬菌体核酸外切酶（exo）最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子从5P末端进行逐步的水解释放出5单核苷酸。但不能降解5OH末端.内切酶（incision enzyme） 这是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键，从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序识别顺序内切酶主要分成三大类。 第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等. 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链.由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子.因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一.这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。如果识别位置在DNA分子中分布是随机的，则识别4个核苷酸的限制性内切酶每隔46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的单倍体基因组据估计为3199核苷酸，识别4个核苷酸的限制性内切酶的切点将有(3109/2.5102)约107个切点，也就是可被这种酶切成107片段，识别6个核苷酸的限制性内切酶也将有(3109/4103）约106个切点。第三类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同.这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端.粘性末端的意义：（1） 连接便利： 不同的DNA双链，只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接两个平齐末端容易的多;同一个DNA分子内连接，通过两个相同的粘性末端可以连接成环状分子。 （2）5末端标记: 凸出的5末端可以用DNA多核苷酸激酶进行32P标记.凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端（3）补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端如EcoRI的识别顺序为: | 5GAA TTC3 3CTT | AAG5 垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序(palindrome）.实线剪头表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过形成氢键而“粘合”。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端.例如Hae的识别位置是： 5GGCC3 3CCGG 在箭头所指处切割,产生的两个DNA片段是: 5GG CC3 和 3CC GG5 有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5GCGG3,如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割.这些有相同切点的酶称为同切酶或异源同工酶（isoschizomer）. 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个核苷酸对则是任意的.因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处.DNA聚合酶(DNA polymerase） DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 ， 以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。DNA聚合酶的共同特点是：(1）需要提供合成模板;（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。 功能1聚合作用：在引物RNAOH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去,就是DNApol的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后,可能使酶的构象发生变化,促进3-OH与5PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。 235外切酶活性校对作用：这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被35外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用,这表明温度升高使DNA生长链3末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强.当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论,35外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被35外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸.在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的35外切酶活性很低.相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多,因此，其DNA复制真实性好,变异率低。可见,35外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。 353外切酶活性切除修复作用：53外切酶活性就是从53方向水解DNA生长链前方的DNA链,主要产生5-脱氧核苷酸.这种酶活性只对DNA上配对部分(双链）磷酸二酯键有切割活力作用,方向是53。每次能切除10个核苷酸,而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10倍以上。因此,这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用.对冈崎片段5末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。 4焦磷酸解作用:DNApol的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNPPP）DNA 5焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应.反应式为32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA 最后两种作用,都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义. DNApol的DNA聚合酶活性和53外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移（Nick translation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoI能从切口开始合成新的NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为32P-dNTP,则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子,可以用作探针进行分子杂交实验。 大肠杆菌DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶（DNApolymerase，DNApol)这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶,又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点. (1) 理化性质：纯化的DNApol由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个SH基.通过二个酶分子上的SH基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用.每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段,小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物.在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。 DNAPol在空间结构上近似球体，直径约65A。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟（cleft），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点：1模板DNA结合位点；2DNA生长链或引物结合位点；3引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3-OH;4脱氧核苷三磷酸结合位点;553外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5端脱氧核苷酸并切除之;635外切酶活性位点,用以结合和切除生长链上未配对的3端核苷酸。 大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：(1)补平由核酸内切酶产生的5粘性末端（2）DNA片段的同位素末端标记（3）cDNA第二链的合成(4）双脱氧末端终止法测定DNA序列2、大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApol不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApol。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApol的5%。该酶的催化特性如下： （1）聚合作用:该酶催化DNA的聚合,但是对模板有特殊的要求.该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙（gap）的单链DNA部分，而且该单链空隙部分不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但是用单链结合蛋白(SSBP）可以提高其聚合速率，可达原来的50100倍。 （2)该酶也具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。 （3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2脱氧核苷酸掺入到DNA链中。 （4)该酶不是复制的主要聚合酶,因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。 3、 大肠杆菌DNA聚合酶（DNApol）:DNA pol 全酶由多种亚基组成(见下表)，而且容易分解。大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子,因此不易获得纯品,为研究该酶的各种性质和功能带来了许多困难。直到不久前，才对其性质和功能有所了解，但每个亚基的具体作用扔不十分清楚.尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶的15倍和30倍.该酶对模板的要求与DNA聚合酶相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA,单链结合蛋白可以提高该酶催化单链DNA模板的DNA聚合作用.DNApol也有35和53外切酶活性，但是35外切酶活性的最适底物是单链是DNA，只产生5-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3端开始切除一个核苷酸。53外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。DNA聚合酶是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶则可以恢复其合成DNA的能力。 大肠杆菌三种DNA聚合酶的特性 功能 pol pol pol 聚合作用53 + + + 外切酶活性35 + + + 外切酶活性53 + - + 焦磷酸解和焦磷酸交换作用 + - + 模板及引物的选择 完整的DNA双链 - 带引物的长单链DNA + - 带缺口的双链DNA + - 双链而有间障的DNA + + + 一般性质 分子量 1 09KD 120KD 140KD 每细胞中的分子量 400 17100 10-20 结构基因 polA polB polCT4-DNA聚合酶T4DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年来在枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏杆菌等细胞及噬菌体T4、T5、T7中分离到NDA聚合酶，这里只介绍T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶与大肠杆菌DNA聚合酶相似，也是一条多肽链，分子量亦相近,但氨基酸组成不同，它至少含有15个半胱氨酸残基。但是，它在作用上与大肠杆菌DNApol不同;1它无53外切酶活性;2它需要一条有引物的单链DNA作模板。在有缺口的双链DNA作模板时，需要有基因32蛋白的辅助（基因32蛋白在T4DNA复制中的作用和大肠杆菌单链结合蛋白的作用相似，基因32蛋白在复制叉处和单链DNA结合后可以促进双链的进一步打开，并保持其单链状态有利于新生链的合成）；它利用单链DNA为模板进,可同时利用它作为引物，即此单链DNA的3端能环绕其本身的某一顺序形成氢键配对,3端的未杂交部分即被T4DNA聚合酶的35外切酶活性切去，然后在其作用下从3OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再以互补链为模板合成原来的单链DNA实验室常用的耐热DNA聚合酶耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中.各种耐热DNA聚合酶均具有53聚合酶活性，但不一定具有35和5-3的外切酶活性。35外切酶活性可以消除错配,切平末端；5-3外切酶活性可以消除合成障碍。由于上述这些不同,可以将耐热DNA聚合酶分为三类： 一、普通耐热DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 由一种水生栖热菌yT1株分离提取出，是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，达200，000单位/mg.具有53外切酶活性，但不具有3-5外切酶活性,因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。 TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3突出的单A核苷酸尾；另一方面,在仅有dTTP存在时,它可将平端的质粒的3端加入单T核苷酸尾，产生3端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的TA克隆法。 Tth DNA 聚合酶 从Thermus thermophilus HB8中提取而得，改酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA；当加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加,从而使cDNA合成与扩增可用一种酶催化. 二、 高保真DNA聚合酶 pfu DNA 聚合酶 是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有53外切酶活性，但具有35外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误,使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3端突出的单A核苷酸. Vent DNA 聚合酶 改酶是从Litoralis栖热球菌中分离出的，不具有53外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能。 三、 DNA序列测定中应用的耐热DNA聚合酶 Promega公司测序级TaqDNA聚合酶 是在TaqDNA聚合酶的基础上对它进行修饰，去除53外切酶活性，保证测序记过的高度准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。 Bca Best DNA 聚合酶 从Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提纯，并使其53外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸长性能优越；可抑制DNA二级结构形成，可以得到均一的DNA测序带。 Sac DNA 聚合酶 从酸热浴流化裂片菌中分离，无35外切酶活性，可用于DNA测序，但测序反应中ddNTP/dNTP的比率要高.DNA连接酶（DNA ligase） DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的,最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA 链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。DNA连接酶主要用于基因工程，将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合，故也称“基因针线。 在大肠杆菌及其他细菌中,DNA连接酶催化的连接反应是利用NAD+做能源的；而在动物细胞及噬菌体中,是利用ATP作能源.DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口（nick），即在双链DNA的某一条链上的两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂 大肠杆菌DNA连接酶：只能催化双链DNA的互补粘性末端，以NAD为能量;T4噬菌体连接酶：粘性、平末端均可连接,以ATP为能量.从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多T4DNA连接酶T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5磷酸基和3羟基之间形成磷酸二酯键。可接双链DNA的平末端、相容粘末端及其中的单链切口，在分子生物学中有广泛的应用。T4DNA连接酶是经原核表达，柱层析纯化获得的高纯T4DNA接酶，SDSPAGE显示为一条62kD的蛋白条带。本品附带10xLigationBuffer含有ATP.适用于DNA片断接、克隆等各种反应。 内容与储存方法名称：T4DNALigase 数量：20ml 保存条件：20 名称:10xLigationBuffer 数量:100ml 保存条件：20 T4DNA接酶活性为3u/ml，单位定为Weiss单位（0。01Weiss单位活性的T4DNA接酶在16时20ml体系反应20分钟,可以连接95的1gDNA-HindIII的酶切物）。无DNA外切酶或内切酶活性.可进行50次以上常规DNA接反应。低温运输,-20保存.有效期6个月。 10LigationBuffer成分： Tris-HClpH7.8600mM MgCl215mM DTT100mM ATP10mM 连接条件推荐在1020ml反应体系中进行接反应，反应中DNA浓度最大可达1mM(1kbDNA约1mg/ml）。首先混合要接的DNA片段，加入10LigationBuffer至终浓度为1，再加入适量T4DNALigase混匀。最适连接温度为16.粘末端连接效率较高，加入0。21mlT4DNALigase，可在室温或16反应13小时完成反应；平末端连接效率较低，加入1mlT4DNALigase，通常需要在16或4过夜完成反应。 注意事项1)10xLigationBuffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化,然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。 2)T4DNALigase对热敏感,容易失活.使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。 3）如需在接反应后灭活T4DNALigase，可于65孵育10min即可.DNA聚合酶和DNA连接酶的比较DNA连接酶:主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上,形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键. DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板 比较项目DNA聚合酶DNA连接酶 不 同 点形成磷酸二酯键的方式只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键是否需要模板以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因DNA连接酶不需要模板是否参与基因工程在基因工程中，DNA连接酶可以作为连接运载体和目的基因的“针线”没有参与 相 同 点它们的化学本质都是蛋白质。两者均属于酶，具有酶的基本属性和特点.两者都能形成磷酸二酯键,即在相邻核苷酸的3位碳原子的羟基与5位碳原子上所连接的磷酸基团的羟基之间形成.两者均参与DNA的复制、逆转录等过程.