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实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

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实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展
摘要：实时荧光定量ｐｃｒ技术是在ｐｃｒ反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个ｐｃｒ反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点.近年来，实时荧光定量ｐｃｒ技术在植物检疫研究上不断深入，大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平.综合论述了实时荧光定量ｐｃｒ技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。
关键词：实时荧光定量ｐｃｒ技术；植物检疫；植物病害
ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ fluorescent ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ
ｈｕａｎｇ ｈａｉ－ｑｕａｎ
（ｂｅｉｌｕｎ ｅｎｔｒｙ－ｅｘｉｔ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｕｒｅａｕ，ｎｉｎｇｂｏ ３１５８００，ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ)
ａｂｓｔｒａｃｔ： ｆｑ－ｐｃｒ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｃｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ, ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ｐｃｒ) ｐｒｏｃｅｓｓ could be monitored ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ quantitatively ａｎａｌｙｚｅ ｕｎｋｎｏｗｎ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ． ｆｑ－ｐｃｒ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｔｃ． ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ， application of ｆｑ－ｐｃｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ was studied ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ detecting ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｐｉｄｅｍｉｃ． tｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇｉ， ｂａｃｔｅｒｉａ， ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ was comprehensively described．
ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ； ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ； ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ
实时荧光定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ，ｆｑ－ｐｃｒ）技术是２０世纪９０年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。最早是由ｈｉｇｕｃｈｉ等[１]于１９９２年提出来的，１９９６年由美国ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出.与普通ｐｃｒ相比，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。过去实时荧光定量ｐｃｒ技术主要应用在医学诊断、新型农业、基础研究等领域［２］,而在植物检疫中的应用相对较少［３]，随着分子生物学的不断发展，特别是在检疫检验系统，实时荧光定量ｐｃｒ技术已经被广泛用来检测植物病害，有效地遏制了国外有害生物的入侵，保证了生物入境安全。
１ 实时荧光定量ｐｃｒ技术原理
实时荧光定量ｐｃｒ技术是指在ｐｃｒ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个ｐｃｒ技术进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量ｐｃｒ技术中有一个很重要的概念,即ｃｔ值.ｃ代表循环（ｃｙｃｌｅ），ｔ代表阈值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）。ｃｔ值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多,ｃｔ值越小。因此,要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再利用分析软件获得未知样品的ｃｔ值,便能根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数［４］。
２ 实时荧光定量ｐｃｒ技术检测方法
该检测方法主要分为两大类:第一类是使用特异的双链ｄｎａ（ｄｓｄｎａ)结合染料，常用的有ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ和ｌｃ ｇｒｅｅｎ；第二类则是应用荧光标记探针，如ｔａｑｍａｎ探针、分子信标等,是建立在荧光共振能量转移原理（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ,ｆｒｅｔ)［５］上的。
２．１ ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ｉ荧光染料检测技术
ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ｉ是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于ｄｎａ双链结构的小沟中，非特异地与ｄｓｄｎａ分子结合，是应用最广泛的非探针类化学检测物。当它与 ｄｎａ双链结合时发出荧光，荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加，便可被荧光探测系统检测到.但是由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。可以在ｐｃｒ结束时通过分析扩增产物的熔解曲线来排除非特异性扩增［２］。
２．２ ｔａｑ ｍａｎ探针检测方法
ｔａｑｍａｎ水解探针主要是利用ｔａｑ酶５'→３’外切核酸酶活性，并在ｐｃｒ反应体系中加入一个荧光标记探针［２］。探针的５’端荧光发射基团ｆａｍ（６－羧基荧光素），３'端标记淬灭基团ｔａｍｒａ（６－羧基四甲基丹诺明）。该探针在ｐｃｒ过程中不能延伸。当探针保持完整时,根据ｆｒｅｔ原理，３’端淬灭基团抑制５'端发射基团的荧光发射;在ｐｃｒ的退火期,引物和探针同时与ｄｎａ模板发生特异性杂交；延伸期，引物在ｔａｑ酶作用下沿ｄｎａ模板延伸，当到达探针处，ｔａｑ酶发挥５’→３'外切核酸酶活性，将探针切断。此时发射基团远离淬灭基团，荧光信号得以释放，荧光探测系统便会检测到荧光密度有所增加。模板每复制１次，就有１个探针被切断并伴有１个荧光信号的释放。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号不断增强。当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即为循环阈值（ｃｔ）.ｃｔ与ｐｃｒ体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系,利用不同标准模板扩增的ｃｔ值和标准模板数经过对数拟合作图，制成标准曲线，再根据待测样品的ｃｔ值可以准确地确定起始模板的数量［６]。
２．３ 实时荧光定量ｐｃｒ技术定量方法
在实时荧光定量ｐｃｒ中，模板的定量有两种方法，即绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化［７］。
３ 实时荧光定量ｐｃｒ技术在植物检疫研究中的应用
３．１ 在真菌引起的植物病害检测中的应用

１９９９年ｂｏｈｍ等［８]首次将实时荧光定量ｐｃｒ方法应用于植物病理学研究，２０００年有学者首次将该方法应用于植物病理真菌的检测［９].在我国，使用定量ｐｃｒ技术对植物病理真菌检测相对较晚，程颖慧等［１０］报道了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光定量ｐｃｒ检测。章桂明等［１１］报道应用ｔａｑｍａｎ ｍｇｂ探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌，分别建立了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌实时荧光单重ｐｃｒ和实时荧光双重ｐｃｒ检测方法。ｍｉｇｕｅｌ等［１２］使用实时荧光定量ｐｃｒ技术检测了罂粟携带霜霉菌引起的霜霉病。年四季等［１３]根据筛选的ｔｃｋ独有差异基因片段（１ ３２２ ｂｐ）设计特异性引物对ｃｑｕｔｃｋ４／ｃｑｕｔｃｋ５和ｔａｑｍａｎ 探针ｃｑｕｐ１，建立ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎⅰ荧光染料法和ｔａｑｍａｎ水解探针法定量ｐｃｒ检测体系,均可成功鉴别出ｔｃｋ与小麦矮腥黑穗病菌，并可快速准确检测小麦矮腥黑穗病菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。黄国明等［１４]设计了通用ｔａｑｍａｎ探针及引物和特异ｔａｑｍａｎ探针及共用引物，结合通用探针的单色荧光ｐｃｒ和特异探针的双色荧光ｐｃｒ两种方法，成功摸索出一种ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｃｏｅｎｏｐｈｉａｌｕｍ和ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｌｏｌｉｉ的菌丝及单粒种子快速、稳定、可靠、特异性强的荧光ｐｃｒ检测方法,使检测时间由至少１个月缩短至７~８ ｈ，而且检测灵敏度达到单粒种子。苏丹等[１５］成功建立了利用ｐｃｒ技术对黑麦草中内生真菌感染状况的检测和定量分析方法，发现不同植株之间内生真菌含量差异较大。
３．２ 在细菌引起的植物病害检测中的应用
植物病原细菌（pｈｙｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）主要类群有１６个属，除土壤杆菌（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、欧文氏菌属（ｅｒｗｉｎｉａ）、假单胞菌属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、黄单胞菌属（ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ)和链丝菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）之外，革兰氏阴性菌增加了嗜酸菌属（ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、根杆菌属（ｒｈｉｚｏｂｚｃｔｅｒ）、根单胞菌属（ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ)、嗜木质菌属（ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、泛生菌属（ｐａｎｔｏｅａ)和木质部小菌属(xｙｌｅｌｌａ）等；革兰氏阳性细菌则有棒形杆菌属（ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ)、节杆菌属（ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)、短小杆菌属（ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒ）、红球菌属（ｒｈｏｄｏｃｏｃｘｃｕｓ）、芽孢杆菌属（ｂａｃｉｌｌｕｓ)、布克氏菌属和韧皮部杆菌属等能引起多种农作物、园林观赏、 经济作物及牧草上的病害。利用荧光定量ｐｃｒ技术准确成功鉴定的有柑橘黄龙病菌［１６,１７]、番茄溃疡病菌（ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｒｓｉｓ）［１８］、柑橘溃疡病菌(ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ)［１９］、西瓜细菌性果斑病菌(ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｔｒｕｌｌｉ）［２０]、 梨火疫病菌(ｅｒｗｉｎｉａａｍｙｌｏｖｏｒａ）［２1］、 水稻白叶枯病菌(ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ）[２２，２３］、玉米细菌性枯萎病菌（ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉｓｕｂ ｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）［２4］、 苜蓿细菌性萎蔫病菌（ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍｓ）[２5］、菜豆细菌 性 萎 蔫 病 菌（ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｐｖ．ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ)[２6］、哈密瓜细菌性果斑病菌（ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｔｒｕｌｌｉ）［２7］、香蕉枯萎细菌性病菌（ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｒａｃｅ ２)[２8]、马铃薯环腐病菌(ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）［２9］等细菌的检测.植物病原细菌的传统检测方法主要是采用生物学和免疫学的方法，这种方法费时费力，而且准确率也不高。但实时荧光定量ｐｃｒ技术可以很好地解决这些问题，不仅有效地提高了检测速度和水平,而且灵敏度也比一般的检测方法高出１００倍左右。还有一个明显的优点是试验中不需要ｐｃｒ的后续处理及病原菌的分离培养，大大简化了试验操作步骤,缩短了检测时间。
３．３ 在病毒引起的植物病害检测中的应用
植物病毒是仅次于真菌的一类病原体，由于病毒对寄主的绝对寄生性，使其危害增大，同时防治又很困难，故病毒病有植物癌症之称。植物病毒的检测方法主要有生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法［３０］,其中检测最方便的莫过于实时荧光定量ｐｃｒ技术，它具有灵敏、快速和特异性强等优点。烟草环斑病毒（ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ．）为中国公布的第二类禁止进境检疫有害生物，郑耘等［３１］首次应用直接结合反转录实时荧光ｐｃｒ技术检测烟草环斑病毒.杨伟东等［３２］首次应用免疫捕捉反转录实时荧光ｐｃｒ技术成功检测烟草环斑病毒,由此解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题，为植物病毒病原的快速、简便有效检测提供了一套科学的方法。闻伟刚等［３３］用实时荧光ｐｃｒ技术检测了齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒,用这种方法从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。闻伟刚等［３４］建立了玉米褪绿斑驳病毒的荧光定量ｐｃｒ的检测方法，其灵敏度比普通ｒｔ－ｐｃｒ高出１００倍.
３．４ 在线虫引起的植物病害检测中的应用
松材线虫病是世界上四大林木病害之一,也是世界重要的检疫性有害生物.在我国松褐天牛是它的主要传媒昆虫。松材线虫病致病力强，寄主死亡速度快,传播也快，且常常猝不及防,一旦发生,则治理难度大。由于环境、气候和不同寄主的影响，在形态上存在一定的差异［３５］。现在发现除了从美国、日本等疫区检测出木质包装携带松材线虫外,一些非疫区国家也检测出松材线虫，口岸检疫工作形势严峻.实时荧光ｐｃｒ技术在口岸植物检疫工作中起到了很大的作用.王金成等［３６]用探针法对松材线虫进行了定量ｐｃｒ检测，为口岸快速准确地鉴别松材线虫建立了行业标准。王翀等［３７］建立了鳞球茎茎线虫实时荧光ｐｃｒ的检测技术，整个检测过程只需要３０～１２０ｍｉｎ,能够满足口岸检验检疫快速通关的要求.有学者应用ｔａｑｍａｎ探针进行马铃薯金线虫和白线虫实时荧光ｐｃｒ的研究，可高度灵敏地检测单个马铃薯金线虫的孢囊或幼虫，最高检测灵敏度达到１０ｆｇ［３８，３９］.龚艳清等[４０］建立了简单异尖线虫ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ｉ荧光定量ｐｃｒ技术方法，可用于简单异尖线虫的鉴定。
４ 结语
目前实时荧光定量ｐｃｒ技术作为核酸定量的方法已经广泛地应用于植物研究,例如植物抗逆性研究，转基因植物检测，植物抗病性研究，植物发育学研究,环境对植物基因表达的影响[４１］。可见其应用的领域远比本研究涉及的范围要广得多.但是实时荧光ｐｃｒ技术也有其局限性，会受到非靶序列ｄｎａ的干扰，如何排除背景的影响,使实时荧光定量ｐｃｒ具有普遍性是人们面临的又一个挑战。
植物病害危害性是极其严重的，防治十分困难，例如柑橘溃疡病、柑橘黄龙病、果树根癌病、水稻细菌性条斑病和水稻白叶枯病等都是许多国家的植物检疫性病害,防治或根除办法都是极其棘手和困难的。口岸在加强植物检疫工作的同时，也要不断地进行基础研究，建立起一系列生物安全措施和简便准确的检测方法,以便进一步提高口岸植物检疫工作的效率。

总之，实时荧光定量ｐｃｒ技术为植物检疫工作的开展提供了强有力的技术支撑，如果能与其他分子生物学以及传统方法相结合，将会推动口岸检疫工作更好地发展。
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