基于转录组测序探讨EGFR-TKI致HaCaT细胞损伤机制.pdf

现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19期microRNA-374a/forkhead box O1 signaling axis J.Mol MedRep,2020,21(3):1471-1480.5DOU YL,LIN JP,LIU FE,et al.Midazolam inhibits the prolifera-tion of human head and neck squamous carcinoma cells by down-regulating p300 expression J.Tumour Biol,2014,35(8):7499-7504.6 QI Y,YAO X,DU X.Midazolam inhibits proliferation and acceler-ates apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by elevating mi-croRNA-124-3p and suppressing PIM-1J.IUBMB Life,2020,72(3):452-464.7 JJIAO J,WANG Y,SUN X,et al.Midazolam induces A549 cell ap-optosis in vitro via the miR-520d-5p/STAT3 pathwayJ.Int JClin Exp Pathol,2018,11(3):1365-1373.8LI Y,ZHANG Y,ZOU Y,et al.The paradoxical roles of miR-4295 in human cancer:Implications in pathogenesis and personal-ized medicineJ.Genes Dis,2020,9(3):638-647.9YANG X,YANG J,TANG Y,et al.miR-4295 promotes the malig-nant progression of gastric cancer via targeting PTEN J.CombChem High Throughput Screen,2022,25(11):1897-1906.10 LU S,ZHOU C,ZOU B,et al.MiR-4295 facilitates cell prolifer-ation and metastasis in head and neck squamous cell carcinoma bytargeting NPTX1 J.Genes Immun,2020,21(1):4-12.11QI Y,YAO X,DU X.Midazolam inhibits proliferation and accel-erates apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by elevatingmicroRNA-124-3p and suppressing PIM-1J.IUBMB Life,2020,72(3):452-464.12 7ZENG J,LI YK,QUAN FF,et al.Propofol-induced miR-125a-5p inhibits the proliferation and metastasis of ovarian cancer bysuppressing LIN28BJ.Mol Med Rep,2020,22(2):1507-1517.13 LU H,ZHENG G,GAO X,et al.Propofol suppresses cell viabili-ty,cell cycle progression and motility and induces cell apoptosis ofovarian cancer cells through suppressing MEK/ERK signaling viatargeting circVPS13C/miR-145 axis J.J Ovarian Res,2021,14(1):30 40.14 LI H,XU Y,ZHAO D.MicroRNA-193b regulates human ovariancancer cell growth via targeting STMN1 J.Exp Ther Med,2020,MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.1915 YAO CJ,CHEN CY,QIU XX,et al.MicroRNA-378a-3p con-tributes to ovarian cancer progression through downregulatingPDIA4J.Immun Inflamm Dis,2021,9(1):108-119.16 彭志霞，贾佳，于东坡，等.miR-30a对卵巢癌细胞PTEN/PI3K/AKT/mTOR自噬通路及顺铂耐药性的影响J.现代肿瘤医学,2 0 2 1,2 9(18):3143-3148.PENG ZX,JIA J,YU DP,et al.Effects of miR-30a on PTEN/PI3K/AKT/mTOR autophagy pathway and cisplatin resistance ofovarian cancer cells J.Modern Oncology,2021,29(18):3143-3148.17焦晶华，王宇恒，孙晓峰.咪达唑仑对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑制效应及机制J.实用临床医药杂志，2 0 2 0,2 4(4):21-25.JIAO JH,WANG YH,SUN XF.Inhibitory effect and mechanismof midazolam on human lung cancer A549 cells transplanted innude mice J.Journal of Practical Clinical Medicine,2020,24(4):21 25.18WANG C,DATOO T,ZHAO H,et al.Midazolam and dexmedeto-midine affect neuroglioma and lung carcinoma cell biology in vitroand in vivoJ.Anesthesiology,2018,129(5):1000-1014.19 GAO J,GAO Y,LIN S,et al.Effects of activating GABAB1 recep-tor on proliferation,migration,invasion and epithelial-mesenchy-mal transition of ovarian cancer cellsJ.J Ovarian Res,2020,13(1):126-136.20 CHENG JP,HUANG B,DUAN JH,et al.miR-4295 promotescell proliferation,migration and invasion of osteosarcoma throughtargeting interferon regulatory factor 1 J.Oncol Lett,2020,20(5):260-270.21NAN YH,WANG J,WANG Y,et al.MiR-4295 promotes cellgrowth in bladder cancer by targeting BTG1 J.Am J TranslRes,2016,8(11):4892-4901.22YAN R,LI K,YUAN DW,et al.Downregulation of microRNA-4295 enhances cisplatin-induced gastric cancer cell apoptosisthrough the EGFR/PI3K/Akt signaling pathway by targetingLRIG1J.Int J Oncol,2018,53(6):2566-2578.3539.20(4):3310 3315.(编校：李祥婷）基于转录组测序探讨EGFR-TKI致HaCaT细胞损伤机制钟弟12,肖冰颖 2,林小惠,陈欣 2,汪余嘉”,聂雪坤”,林敏华21福建医科大学，福建福州350 10 0；宁德师范学院附属宁德市医院药学部，福建宁德352 10 0【摘要】目的：探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowth factor receptort y r o s i n ekinase inhibitors，EG FRT K I s）致人永生化角质形成细胞（HaCaT)损伤机制,从而初步探索该药物诱导表皮不良反应机制。方法：利用MTS及Hoechst染色建立TKI药物对HaCaT细胞损伤模型；通过转录组测序筛选差异基因；利用数据库收集表皮不良反应靶点;将差异基因与表皮不良反应靶点取交集,得到潜在作【收稿日期】2022-06 27【基金项目】福建省自然科学基金面上项目（编号：2 0 2 0 J011341）；福建省宁德市科技局指导性项目（编号：2 0 190 0 45，2 0 17 0 10 4）【作者简介】钟弟（1995一），男，福建宁德人，硕士研究生，研究方向：临床药理学。【通信作者】林敏华（197 9），女，福建宁德人，副主任药师，研究方向：临床药理学。Ema i l：p h a r ma c h e n g 16 3.c o m【修回日期】2 0 2 3-0 5-30Moderm Oncology 2023,31(19):3539-35473540.用靶点；利用DAVID及R软件对潜在靶点进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes,KEGG）及基因本体论（gene ontology,GO）分析；应用STRING数据库进行蛋白互作（protein protein in-teraction,PPI)分析，并采用Cytoscape软件进行可视化分析和拓扑参数分析；通过Autodock软件对关键基因与EGFR-TKI药物进行分子对接；运用实时荧光定量PCR检测分子对接中结合能最低的靶点；利用免疫印迹实验（Wesrtern Blot)法检测通路相关蛋白表达。结果：MTS及Hoechst染色表明，奥希替尼与阿法替尼对细胞存活率有明显抑制作用；取交集后得到17 6 个潜在作用靶点；PPI显示IL6、H SPA 5、FN1、V EG FA、XBP1、T LR4、MMP1、CCL2、PT G S2 和VWF可能是ECFR-TKI表皮毒性关键靶点；KEGG信号通路包括IL-17、PI3K-A k t通路；GO功能涉及内质网应激、氧化应激、脂多糖反应；分子对接表明,奥西替尼、阿法替尼与PTGS2、H SPA 5、MMP1、V EG FA 和FN1有较好的结合活性。实时荧光定量PCR显示，奥西替尼与阿法替尼处理HaCaT细胞后FN1、H SPA 5和PTGS2表达上调，VEGFA和MMP1表达下调；免疫印迹实验表明FN1蛋白表达增加，VEGFA蛋白表达减少。结论：ECFR-TKI药物可能通过抑制PI3K-Akt、IL-17 信号通路中的MMP1、VEG FA 产生，促进PTCS2、FN1、H SPA 5表达，损伤HaCaT细胞，从而产生表皮毒性。【关键词】转录组测序;分子对接;EGFR-TKI;表皮毒性【中图分类号】R730【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)19-3539-0 9Transcriptome sequencing to explore the mechanism of EGFR-TKI damage to HaCaTcellsZHONG Di,XIAO Bingying,IN Xiaoui,CHEN Xin,WANG Yuja,NIE Xuckun,IN Minhua2 Fujian Medical University,Fujian Fuzhou 350100,China;Department of Pharmacy,Ningde Municipal Hospital of Ningde Normal Uni-versity,Fujian Ningde 352100,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e me c h a n i s m o f e p i d e r ma l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r -t y r o s i n e k i n a s e i n h i b i t o r s(ECFR-TKIs)causing damage to human immortalized keratinocytes(HaCaT)cells,and thus to explore the prelimi-nary mechanism of epidermal adverse reactions induced by this drug.Methods:MTS and Hoechst staining were usedto model TKI drug damage to HaCaT cells.Transcriptome sequencing was used to screen for differential genes.The da-tabase was used to collect targets for epidermal adverse reactions.The intersection of differential genes and targets forepidermal adverse reactions was taken to obtain potential targets.The potential targets were analyzed by the Kyoto en-cyclopedia of genes and genomes(KEGG)and gene ontology(GO)using DAVID and R sofware.Protein protein in-teraction(PPI)analysis was performed using the STRING database,and Cytoscape software was used to visualisationand topological parameters were analysed using Cytoscape software.Molecular docking of key genes to EGFR-TKIdrugs was performed using Autodock software.Real-time fluorescence PCR was used to detect the lowest binding en-ergy targets in molecular docking and Wesrtern Blot was used to detect pathway-related protein expression.Results:MTS and Hoechst staining showed that ositinib and afatinib had a significant inhibitory effect on cell survival.176 po-tential targets of action were obtained after taking intersection.PPI showed that IL6,HSPA5,FN1,VEGFA,XBP1,TLR4,MMP1,CCL2,PTCS2 and VWF may be key targets of EGFR-TKI epidermal toxicity.KEGG signaling path-way includes IL-17,PI3K-Akt pathway.GO function involves endoplasmic reticulum stress,oxidative stress,lipopo-lysaccharide response.Molecular docking showed that oxitinib and afatinib have good binding activity with PTGS2,HSPA5,MMP1,VEGFA and FN1.Real-time fluorescence quantitative PCR showed that FN1,HSPA5 and PTGS2 ex-pression were up-regulated and VEGFA and MMPI expression were down-regulated after treatment of HaCaT cellswith axitinib and afatinib.Immunoblotting experiments showed that FN1 protein expression increased and VEGFA pro-tein expression decreased.Conclusion:EGFR-TKI drugs may produce epidermal toxicity by inhibiting MMPI andVEGFA production in PI3K-Akt and IL-17 signaling pathways,promoting PTGS2,FN1 and HSPA5 expression anddamaging HaCaT cells.Key words transcriptome sequencing,molecular docking,EGFR-TKI,epidermal toxicity肺癌是起源于肺部支气管黏膜和腺体的恶性肿瘤，同时也是我国肿瘤发病和死亡的首要原因 。根据病理特征和治疗反应等,肺癌可以分为非小细胞肺癌（non-small celllung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC)2,其中,约有 8 0%的肺瘤患者病理类型为NSCLC(3。钟弟,等基于转录组测序探讨ECFR-TKI致 HaCaT细胞损伤机制【文献标识码】AD01:10.3969/j.issn.1672 4992.2023.19.003随着诊疗技术和方法的不断更新,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine ki-nase inhibitors,EGFR-TKIs）靶向治疗药物已成为NSCLC 治疗的主要手段之一,在 NSCLC 患者中获得了显著疗效。此外,EGFR-TKIs药物也可用头颈肿瘤、乳腺癌、胰腺癌现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19 期等4-5。然而EGFR不仅是跨膜酪氨酸激酶生长因子受体的重要组成部分，同时也广泛分布于表皮角质形成细胞膜表面及成熟毛囊的外根鞘部位6 抑制ECFR信号通路虽然可以干预肿瘤病程进展，也可导致细胞内信号转导通路的级联反应从而引起多种表皮不良反应，如皮疹/痤疮样皮疹、皮肤干燥、瘙痒和指甲/甲周组织的炎症7 。这些不良反应存在于10%35%的NSCLC患者中7 ,给患者带来了身体和精神的双重负担,降低了患者的用药依从性,严重影响了药物疗效。因此,探索EGFR-TKIs引起的表皮毒性的具体发生机制，对于预防和控制靶向治疗期间的不良反应至关重要。鉴于目前EGFR-TKIs所致表皮不良反应的发生机制尚不明确，本研究采用转录组测序（RNA-Sep）及相关实验,从关键靶点、信号通路等多方面预测EGFR-TKIs致表皮毒性反应的作用机制，为后期开展细胞及分子水平试验提供一定的参考依据。1材料与方法1.1实验细胞人角质形成细胞株HaCaT购于中国典型培养物保藏中心细胞库。1.2药物及制备Osimertinib（S7 2 97-5m g/支）购于美国Selleck公司；Afatinib（S10 11-5m g/支）购于美国Selleck公司。药物溶液的配制：取5mg奥希替尼于2 0 0.2 LDMS0溶液中，配制得50 mmol/L奥希替尼母液，-2 0 冰箱冷冻避光保存。取5mg阿法替尼于2 0 5.8 LDMSO中溶解，配制得50 mmol/L阿法替尼母液，-2 0 冰箱冷冻避光保存。1.3实验方法细胞实验：取培养至3 5代的HaCaT细胞,根据细胞计数结果,将细胞稀释成510 4个/mL浓度的细胞悬液,以50 0 0 个细胞/孔的密度接种于9 6 孔板中,培养2 4h后,加入不同浓度的奥希替尼和阿法替尼处理HaCaT细胞72 h后测吸光度。取培养至35代的HaCaT细胞，以50 0 0 0 个细胞/孔的密度接种于6 孔板中,培养2 4h后,分别加2 50 nmol/L奥希替尼、15nmol/L阿法替尼处理HaCaT细胞7 2 h,通过细胞调亡-Hoechst染色试剂处理细胞，并使用荧光显微镜捕获细胞的图像。RNA测序：利用TRIZOL法提取RNA并采用超微量紫外可见分光光度计进行RNA定量及纯度评估。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解污染,Nanodrop检测RNA浓度，Agilent5400检测RNA完整性、浓度和纯度。利用Epicen-treRibo-zeroTMrRNA移除试剂盒去除核糖体 RNA,用乙醇沉淀法纯化无rRNA的残留物。纯化的PCR产物通过Illumi-na公司生产的NEBNext?UltraTM定向RNA文库制备试剂盒，按照制造商的推荐方法，制备测序文库。利用AMPureXP系统对PCR产物进行纯化，并在AgilentBioAnalyst5400系统对文库质量进行评估。通过 IluminaNovaseq平台进行转录量测序。1.4数据分析1.4.1差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs)筛选使用R软件对Osimertinib组和Afatinib组与Control组样品中RNA测序数据进行分析，获取差异表达基因。用ggplot2R4.1.3语言包绘制火山图。MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.191.4.2疾病靶点收集以“acne“pruritus”“rash“Dermatitis作为关键词,通过检索 GeneCards(http:/www.genecards.org)、O M IM(h t t p:/www.omim.org)、D i s G e NET(h t t p:/w w w.d i s g e n e t.o r g)、CT D(https:/ctdbase.org/)和 DrugBank（h t t p:/w w w.d r u g b a n k.ca)数据库收集表皮不良反应相关表型靶点。1.4.3疾病靶点与差异表达基因映射将差异表达基因与表皮不良反应靶点取交集，删除重复值,得到EGFR-TKI致表皮毒性相关潜在作用靶点。应用“VennDiagramR4.1.3语言包绘制韦恩图。1.4.4KEGG及 GO富集分析应用DAVID在线数据库（https:/david.ncifcrf.gov/）及R4.1.3软件对潜在作用靶点进行KEGG和GO富集分析，筛选出相关性较高的生物学功能及通路。应用“ggplot2R4.1.3语言包根据分析结果绘制柱状图。1.4.5关键作用靶点蛋白网络互作分析基于STRING数据库（https:/cn.string-db.org/）构建EGFR-TKI致表皮毒性相关潜在靶点的蛋白互作网络(PPI)关系图,删除其中与网络无连接的节点后将靶点关系导人Cytoscape3.9.1软件，运用networkanalysis功能进行分析，根据度值，应用cytoHubba确定EGFR-TKI表皮毒性关键靶点。1.4.6成分靶点分子对接从PDB数据库（https:/www.rcsb.org/）下载核心蛋白的3D(threedimension）结构pdb格式文件，运用pymol软件去除靶蛋白中的小分子配体和水分子，保存为pdb后缀文件作为蛋白受体文件。从PubChem数据库（https：/p u b c h e m.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化合物2 D（t w o-d i m e n s i o n）结构的sdf格式文件，利用Chem3D软件生成3D结构作为分子对接配体。利用AutoDockTools1.5.7软件先上传去水加氢后的蛋白质文件，将其转化为pdbqt格式文件，再上传化合物文件使其能量最小化,并将其转化为pdbqt格式文件，最后运用vina软件8 进行分子对接,以评估目标与配体之间的匹配程度和活性,运用PyMOL展示分子对接结果。结合能小于-5.0kJ/mol表示化合物和靶标之间具有良好的结合相互作用9。1.5RT-PCR 法检测细胞中 PTGS2、H SPA 5、M M P1、VEGFA和FN1mRNA的表达细胞按照1.3中的细胞实验方法进行分组,给药干预7 2 h,弃去培养上清,PBS清洗2 次。用Trizol试剂提取细胞总RNA，在试剂盒说明书操作下,将RNA逆转录生成cDNA(25,5min;42,6 0 m in;7 0 ,15 m in),并进行RT-PCR分析(9 5,2 m in;9 5,15 s;57,40 s;9 5,15 s;6 0 ,1 m in;9 5,15s;扩增40 个循环）。使用人源GAPDH作为内参，采用2-ACT法进行分析。引物由生工生物工程（上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。1.6WesrternBlot法检测细胞中VEGFA和FN1蛋白的表达细胞按照1.3中的细胞实验方法进行分组，给药干预72h，弃去培养上清,PBS清洗2 次。利用强效蛋白裂解液（RI PA）提取总蛋白，在Omni-Easy即用型BCA蛋白定量试剂盒说明书操作下对细胞中总蛋白进行定量。通过配胶、蛋白变性、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、曝光呈现蛋3541:3542白条带。选用ImageJ软件分析蛋白条带，以GAPDH的灰度值作为内参对照。计算目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。表1引物序列Tab.1Primer sequencesGenesPrimer sequence(5-3)PTCS2ForwardReverseMMPIForwardReverseFN1ForwardReverseVECFAForwardReverseHSPA5ForwardReverseGAPDHForwardReverse钟弟,等基于转录组测序探讨ECFR-TKI致 HaCaT细胞损伤机制2结果2.1奥希替尼、阿法替尼对HaCaT细胞活力的作用MTS结果表明,与Control组相比,奥希替尼与阿法替尼对细胞存活率有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，因此,选择干预HaCaT细胞7 2 h的2 50 nmol/L奥希替尼和15nmol/L阿法替尼进行后续RNA测序（见图1）。2.2奥希替尼、阿法替尼对HaCaT细胞凋亡的作用通过Hoechst染色观察细胞核形态,空白组细胞核轮廓GGGTTGCTGGTGGTAGGAATGTTC规则，呈现弥散均勾荧光，未见核小、染色质浓缩的细胞，而CTGGTATTTCATCTGCCTGCTCTGG250nmol/L奥西替尼与15nmol/L阿法替尼组出现细胞核不规则，小核，致密浓染（明亮染色，箭头所示），呈现典型凋亡CTGGGAGCAAACACATCTGACCTAC形态学改变（见图2）。TGGAAGCCTTTCTCAATGGCATGG2.3差异表达基因筛选结果与Control组相比，Afatinib组共确定12 31个差异表达AGAGGCATAAGGTTCGGGAAGAGG基因。Osimertinib组共确定了8 90 个差异表达基因,红色圆CGAGTCATCCGTAGGTTGGTTCAAG点代表上调基因，蓝色圆点代表下调基因，灰色圆点代表差异不显著的基因（见图3）。AGAACGAGGAGGGCAGAATCATCAC2.4EGFR-TKI药物所致表皮不良反应靶点基因的获取GGGCACACAGGATGGCTTGAAG在 GeneCards、O M IM、D i s G e NET、CT D 和 DrugBank 等疾病数据库进行检索筛选，合并数据并删除重复值，共获CCAAGAACCACCTCACCTCCAAC得47 2 5个与表皮反应相关的疾病靶标。将疾病相关靶点与TGAACGGCAAGAACTTGATGTCCTG测序数据筛选出的差异表达基因进行映射,筛除重复值,共计得到17 6 个EGFRT K I 表皮毒性潜在靶点，以韦恩图的CAGGAGGCATTGCTGATGAT形式展现(见图4-5)。GAAGGCTGGGGCTCATTT120-100-80-604020-0Fig.1 Effect of Osimertinib and Afatinib on the viability of HaCaT cells(*P0.000 1,n=3)120-100-*LOSWa100150200250300350400450Osimertinib(nmol/L)图1Osimertinib和Afatinib对HaCaT细胞活力的影响（*P0.0001,n=3）80-60*水*40-20-0*OSWa152025303540Afatinib(nmol/L)AA：Co n t r o l 处理组;B:Osimertinib处理组;C：A f a t i n i b 处理组。Fig.2 Effect of Osimertinib and Afatinib on apoptosis of HaCaT(400)A:Control.B:Osimertinib.C:Afatinib.C图2 HaCaT 细胞 Hoechst 染色(40 0)现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19 期.Upregulated10-861MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19ADownregulatedNotchanged3543B.DownregulatedNotchanged.Upregulated108-62-20.2-6-41og2FC图3Afatinib和Osimertinib组mRNA差异表达火山图分析A:Afatinib处理组;B:Osimertinib处理组.Fig.3 Volcano plot analysis of differential mRNA expression in Afatinib and Osimertinib groupsA:Afatinib.B:Osimertinib.OvsCAvsC366524图4差异表达基因韦恩图分析O vs C:Osimertinib 组 vs Control 组;A vs C:Afatinib 组 vs Control组。Fig.4Venn diagram analysis of differentially expressed genesO vs C:Osimertinib vs Control.A vs C:Afatinib vs Control.图5疾病靶点和交集基因韦恩图分析O vs C:Osimertinib 组 vs Control 组;A vs C:Afatinib 组 vs Control 组。Fig.5The Venn graph of disease targets and intersecting genesO vs C:Osimertinib vs Control.A vs C:Afatinib vs Control.046707OvsC29834868176483224AvsC-6-4-202461og2FC2.5KEGG及GO通路富集分析结果采用DAVID数据库对17 6 个EGFR-TKI致表皮毒性潜在靶点进行KEGG和GO分析。KECG分析结果显示ECFR-TKI导致表皮不良反应潜在通路有PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用等;GO富集结果表明EGFRT K I 导致表皮不良反应潜在生物学过程主要与内质网应激反应、氧化应激、脂多糖反应等密切相关；细胞组件作用主要涉及内质网腔及细胞外基质等；分子功能涉及受体-配体活动、信号受体激活剂活动、细胞因子活动等（见图6-7）。2.6PPI蛋白互作网络的构建及关键靶点的分析将筛选出的EGFRT K I致表皮毒性潜在靶点导入STRING中进行蛋白互作网络分析,生成关系网络图；将PPI网络导人Cytoscape软件,通过Cytohubba 插件以连接度（De-gree)为标准最终筛选出处于关键位置的2 0 个基因,颜色越深Degree值越高(见图8-9)。结合相关文献报道，最终筛选出10 个EGFR-TKIs致表皮毒性的关键靶蛋白，分别为IL6、H SPA 5、FN1、V EG FA、4257XBP1、T LR4、M M P1、CCL2、PT G S2 和VWF(见表2)。2.7成分-靶点分子对接Disease一般认为配体与受体结合的构象越稳定能量越低，发生作用的可能性越大。将Osimertinib和Afatinib两药分别与上述筛选出的10 个蛋白靶标进行分子对接，二者结合能最低的蛋白靶标分别为PTGS2、H SPA 5、M M P1、VECFA、FN1(见表3)。IL-17signalingpathway-Rheumatoidarthritis-Cytokine-cytokinereceptorinteraction-Protein processing in endoplasmic reticulum-Biosynthesis ofaminoacids-AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications-Pertussis-Amoebiasis-PI3K-Aktsignalingpathway-Chagasdisease-Malaria-TNF signaling pathway-Lipidandatherosclerosis-Complementand coagulation cascades-TCF-betasignalingpathway-图6 交集靶点基因KEGC富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of targets of cross-targeted genesqvalue0.010.020.030.040510Count15:3544钟弟,等基于转录组测序探讨ECFR-TKI致 HaCaT细胞损伤机制responseto endoplasmicreticulum stress-responsetomoleculeofbacterialorigin-responsetotopologically incorrect protein-responsetounfoldedprolein-wo