[医学]2012级研究生生第四章-放射性核素标记化合物20121116.ppt

第四章第四章 放射性核素标记化合物放射性核素标记化合物 第一节第一节 概述概述一、放射性核素标记技术和放射性核素一、放射性核素标记技术和放射性核素标记化合物的含义标记化合物的含义放射性核素标记技术放射性核素标记技术Radionuclide labeled techniqueRadionuclide labeled technique放射性核素标记化合物放射性核素标记化合物Radionuclide labeled compoundsRadionuclide labeled compounds第四章第四章 放射性核素标记化合物放射性核素标记化合物 第一节第一节 概述概述一、放射性核素标记技术和放射性核素一、放射性核素标记技术和放射性核素标记化合物的含义标记化合物的含义 放射性核素标记化合物是化合物的放射性核素标记化合物是化合物的分子结构中某一分子或原子被放射性核分子结构中某一分子或原子被放射性核素原子取代后的化合物。素原子取代后的化合物。1414C-C-尿素尿素-1414COCO2 2 -3232P PATPATP 1-1-1414C C乙酰胆碱乙酰胆碱二、放射性核素标记化合物二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点（一）放射性核素标记化合物的特点结合牢固结合牢固有合适的放射性物理半衰期有合适的放射性物理半衰期容易测量容易测量二、放射性核素标记化合物二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点（一）放射性核素标记化合物的特点（二）同位素标记与非同位素标记（二）同位素标记与非同位素标记（1 1）同位素标记）同位素标记(isotopic labelling)(isotopic labelling)：被标记化合物中固有元素被其放射性被标记化合物中固有元素被其放射性核素的同位素取代所形成的标记。核素的同位素取代所形成的标记。有机化合物：有机化合物：1414C C 、3 3H H 硫、磷化合物：硫、磷化合物：3535S S、3232P P特点：所得化合物的物理化学及生特点：所得化合物的物理化学及生 物特性与原化合物基本相同物特性与原化合物基本相同 （2 2）非同位素标记）非同位素标记(non-isotopic(non-isotopic labelling)labelling)：非：非固有元素固有元素131131I I-蛋白质、蛋白质、125125I I-蛋白质蛋白质125125I I-类固醇激素类固醇激素特点：特点：组成不完全相同组成不完全相同物理化学及生物特性有所改变物理化学及生物特性有所改变二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点（二）同位素标记与非同位素标记（三）（三）放射性核素标记化物的命名放射性核素标记化物的命名无机化合物：无机化合物：131131I-NaII-NaI、3535S-S-硫酸硫酸有机化合物：有机化合物：1-1-1414C-C-醋酸醋酸（1 1）定位标记）定位标记（Specific Specific labelinglabeling ）5(S)-5(S)-3 3H-H-尿嘧啶尿嘧啶（2 2）准定位标记）准定位标记（Normal labelingNormal labeling）6,7(n)-6,7(n)-3 3H-H-雌二醇雌二醇（3 3）均匀标记）均匀标记（Uniform labelingUniform labeling）U-U-1414C-C-葡萄糖葡萄糖（4 4）全标记）全标记 （GeneralGeneral labeling labeling）G-G-3 3H-H-胆固醇胆固醇（三）放射性核素标记化物的命名（5 5）双标记或多标记）双标记或多标记（Double labeling and Double labeling and multipedmultiped labelinglabeling）C C3 3H H3 3-3535S S-CH-CH2 2CHCH2 2CH(NHCH(NH2 2)-COOH)-COOH 1313C CH H3 3-1414C COOHOOH（三）放射性核素标记化物的命名放射性比活度Specific activity放射化学纯度Radiochemical purity（四）放射性比活度与放射化学纯度（五）不稳定性（五）不稳定性1.1.核衰变核衰变2.2.辐射自分解辐射自分解3.3.脱落脱落4.4.位移位移（四）放射性比活度与放射化学纯度碘标记化合物的基本特性碘标记化合物的基本特性125125I I、131131I I、123123I:I:半衰期、能量适宜半衰期、能量适宜125125I I、131131I I：价廉易得价廉易得125125I I：易于探测易于探测第二节第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记蛋白质与多肽放射性碘标记124Xe+1n-125I+124Xe(n,)125IXian氙氙碘标记化合物的基本特性碘标记化合物的基本特性一、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术一、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术特点：苯环比直链易于标记且稳定特点：苯环比直链易于标记且稳定（一）基本原理（一）基本原理形式：形式：NaNa*I-I-*I I-*I I2 2 或或 *I I+（二）常用标记方法（二）常用标记方法分类：直接标记法间接标记法分类：直接标记法间接标记法第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记Na*I氧化剂氧化剂*I2或或*I+酪氨酸残基酪氨酸残基1.1.直接标记法直接标记法lao1.1.直接标记法直接标记法(1)(1)氯胺氯胺T T法法原理：原理：次氯酸使次氯酸使*I-氧化氧化特点：特点：简便、快速简便、快速 便宜易得、便宜易得、标记效率高、标记效率高、重复性好、反应易控制重复性好、反应易控制 是使用最广泛的碘标记技术是使用最广泛的碘标记技术还原剂：还原剂：偏重亚硫酸钠（焦亚硫酸钠）偏重亚硫酸钠（焦亚硫酸钠）氯胺氯胺T T法注意事项法注意事项 氯胺氯胺T T溶液应新鲜配制溶液应新鲜配制 氯胺氯胺T T 用量应严格控制用量应严格控制 偏重亚硫酸钠也应新鲜配制、偏重亚硫酸钠也应新鲜配制、1.5-21.5-2倍于氯胺倍于氯胺T T pH7.4-7.8pH7.4-7.8,0.2-0.5M,0.2-0.5M磷酸缓冲液磷酸缓冲液 减少反应体积减少反应体积 反应时间：反应时间：10s-3min10s-3min 室温进行室温进行1.1.直接标记法直接标记法 (1)(1)氯胺氯胺T T法法1.1.直接标记法直接标记法 （2 2）乳过氧化物酶法）乳过氧化物酶法原理：原理：当少量当少量H H2 2O O2 2存在时存在时,乳过氧化物酶与乳过氧化物酶与H H2 2O O2 2结合结合,释放出新生氧释放出新生氧,使使*I I-氧化。氧化。特点：特点：反应十分温和反应十分温和 放射性比活度高放射性比活度高 能保持生物和免疫活性能保持生物和免疫活性缺点：缺点：标记率比氯胺标记率比氯胺T T法低法低,30%,30%40%40%。还原剂：还原剂：缓冲液或半胱氨酸或巯基乙醇缓冲液或半胱氨酸或巯基乙醇乳过氧化物酶法注意事项 H H2 2O O2 2应分次加入应分次加入乳过氧化物酶用量应控制乳过氧化物酶用量应控制 在标记蛋白量的在标记蛋白量的1%1%以下以下 采用双酶标记法采用双酶标记法(葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶)pHpH 3.0-8.0 3.0-8.0反应时间：反应时间：30-60min30-60min1.直接标记法(3)固相氧化剂法原理：原理：将氧化剂交联在琼脂糖凝胶上或将氧化剂交联在琼脂糖凝胶上或涂在塑料管或塑料珠子表面涂在塑料管或塑料珠子表面,形成不溶性形成不溶性的固相氧化剂。的固相氧化剂。特点：特点：能简化标记能简化标记中止反应不需加还原剂中止反应不需加还原剂1.1.直接标记法直接标记法(3)(3)固相氧化剂法固相氧化剂法 固相酶法固相酶法 将乳过氧化物酶或葡萄糖氧化酶将乳过氧化物酶或葡萄糖氧化酶交联到琼脂糖凝胶（交联到琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose 4B 4B）上上,反应条件仍同于上述酶法。反应条件仍同于上述酶法。氯甘脲氯甘脲(IodogenIodogen)法法 1 1，3 3，4 4，6-6-四氯四氯3,6-3,6-二苯甘脲二苯甘脲 将氯甘脲用氯仿溶解后涂于反应管将氯甘脲用氯仿溶解后涂于反应管底部，用底部，用N N2 2气吹干，置气吹干，置-20-20o oC C冷藏备用。冷藏备用。1.直接标记法直接标记法(3)固相氧化剂法固相氧化剂法 IodoIodo-Beads-Beads法法 将氯胺将氯胺T T的衍生物的衍生物N-N-氯苯磺胺共价氯苯磺胺共价连接到无孔的聚苯乙烯小珠表面。连接到无孔的聚苯乙烯小珠表面。1.直接标记法直接标记法(3)固相氧化剂法固相氧化剂法 固相酶法固相酶法 氯甘脲氯甘脲(IodogenIodogen)法法 IodoIodo-Beads-Beads法法 1.直接标记法直接标记法(3)固相氧化剂法固相氧化剂法1.1.直接标记法直接标记法(4)N-(4)N-溴替丁二酰亚胺溴替丁二酰亚胺 (N-(N-BromosuccinimideBromosuccinimide)原理：原理：溴代瑚玻酰亚胺的作用与氯胺溴代瑚玻酰亚胺的作用与氯胺T T和和IodogenIodogen法相似。法相似。特点：特点：标记率高、操作简单、快、安全标记率高、操作简单、快、安全 可标记较低浓度蛋白质可标记较低浓度蛋白质缺点：缺点：体内实验可能产生微量毒性体内实验可能产生微量毒性三、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术三、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术 1.1.直接标记法直接标记法 (1)(1)氯胺氯胺T T法法 (2)(2)乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法 (3)(3)固相氧化剂法固相氧化剂法 固相酶法固相酶法 氯甘脲氯甘脲(IodogenIodogen)法法 IodoIodo-Beads-Beads法法 (4)N-(4)N-溴替丁二酰亚胺溴替丁二酰亚胺 2.间接标记法又称联接标记法联接标记法 是先将放射性碘是先将放射性碘联结到一个小分子载联结到一个小分子载体上体上,再将这个小分子再将这个小分子物质与蛋白质结合。物质与蛋白质结合。3-丙酸丙酸-N-琥珀酰亚脂琥珀酰亚脂2.间接标记法优缺点优点：优点：避免了蛋白质和氧化剂直接接触避免了蛋白质和氧化剂直接接触 Bolton-HunterBolton-Hunter试剂主要联接到试剂主要联接到 蛋白质分子表面的赖氨酸残基的蛋白质分子表面的赖氨酸残基的 氨基或蛋白质的氨基或蛋白质的N-N-末端上末端上缺点：缺点：较大分子的引入较大分子的引入 碘化蛋白质的放射性比活度和碘化蛋白质的放射性比活度和 碘的利用率均较直接标记法低碘的利用率均较直接标记法低二、核酸的放射性碘标记技术放射性碘放射性碘-碱基碱基方法：解链方法：解链 三氧化铊三氧化铊 碘碘-碳共价键碳共价键第三节第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯 游离放射性核素游离放射性核素 标记的杂质标记的杂质 辐射自分解辐射自分解第三节第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定1.1.基本原理基本原理（1 1）纸层析）纸层析(paper chromatography)(paper chromatography)（2 2）薄层层析）薄层层析(thin layer-)(thin layer-)硅胶或氧化铝硅胶或氧化铝-吸附力和分配系数吸附力和分配系数离子交换树脂离子交换树脂-携带电荷携带电荷聚酰胺聚酰胺-氢键氢键第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定1.1.基本原理基本原理2.2.基本操作基本操作（1 1）选择固定相）选择固定相（2 2）选择展开剂）选择展开剂（3 3）点样与展开）点样与展开第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定1.1.基本原理基本原理2.2.基本操作基本操作3.3.测量结果测量结果（1 1）放射自显影）放射自显影（2 2）分段测量）分段测量（3 3）放射性扫描）放射性扫描第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定1.1.基本原理基本原理2.2.基本操作基本操作3.3.测量结果测量结果4.4.注意事项注意事项（1 1）层析系统：有效分开）层析系统：有效分开（2 2）高比活度：加载体）高比活度：加载体（3 3）多次点样）多次点样第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析2.2.柱层析柱层析（1 1）凝胶过滤层析）凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)（2 2）离子交换层析）离子交换层析（ion-exchange chromatographyion-exchange chromatography）第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析2.2.柱层析柱层析（3 3）亲和层析）亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)（4 4）放射性高效液相色谱仪）放射性高效液相色谱仪第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析2.2.柱层析柱层析3.3.透析法透析法第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（一）放射化学纯度的测定 特定组分的放射性（特定组分的放射性（cpmcpm）放射放射化学纯度化学纯度=100%100%各组分的放射性之和（各组分的放射性之和（cpmcpm）第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（二）放射性浓度（三）放射性比活度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法直接测定计算法 放射性浓度放射性浓度(KBq/ml)放射性比活度放射性比活度=化学浓度化学浓度(g/ml)第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（二）放射性浓度（三）放射性比活度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法直接测定计算法2.2.色谱扫描面积计算法色谱扫描面积计算法 特定组分峰的特定组分峰的 各段放射性之和各段放射性之和标记率（标记率（%）=100%100%全层析谱全层析谱 各段放射性之和各段放射性之和 投入标记的放射性活度投入标记的放射性活度标记率标记率放射性比活度放射性比活度 =投入标记的待标记物质的化学量投入标记的待标记物质的化学量（三）放射性比活度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法直接测定计算法2.2.层析谱放射性测定计算法层析谱放射性测定计算法第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（二）放射性浓度（三）放射性比活度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法直接测定计算法2.2.色谱扫描面积计算法色谱扫描面积计算法3.3.自身取代计算法自身取代计算法第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（二）放射性浓度（三）放射性比活度（三）放射性比活度（四）生物活性和免疫活性的测定（四）生物活性和免疫活性的测定（四）生物活性和免疫活性的测定方法：鉴定生物活性时方法：鉴定生物活性时,让其与受体结合让其与受体结合;鉴定免疫活性时鉴定免疫活性时,让其与抗体结合。让其与抗体结合。三、标记化合物的辐射自分解与对策三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型1.初级内分解2.初级外分解3.次级分解H2OH2OO OH1.1.初级内分解初级内分解2.2.初级外分解初级外分解3.3.次级分解次级分解核衰变释放的核衰变释放的射线射线核衰变产生核衰变产生子体核素子体核素产生产生激活物质激活物质三、标记化合物的辐射自分解与对策三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型（一）辐射自分解的类型（二）影响辐射自分解的因素（二）影响辐射自分解的因素1.标记化合物吸收射线能量的效率标记化合物吸收射线能量的效率2.标记化合物的比活度标记化合物的比活度3.标记化合物的化学纯度标记化合物的化学纯度三、标记化合物的辐射自分解与对策三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型（一）辐射自分解的类型（二）影响辐射自分解的因素（二）影响辐射自分解的因素（三）控制辐射自分解的方法（三）控制辐射自分解的方法1.比活度适当比活度适当2.稀释分散稀释分散3.加自由基消除剂加自由基消除剂4.降低储存温度降低储存温度 同位素标记与非同位素标同位素标记与非同位素标记记 蛋白质与多肽的放射性碘蛋白质与多肽的放射性碘标标 记技术记技术的方法 标记化合物的提纯小结小结