基本技术操作规程.doc

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1. 目的
保证检验前的质量控制，并对合格的标本进行规范的接种，不同类别的标本按照不同的接种方法，选择不同的培养基，有针对性地分离出有临床意义的致病菌。
2. 范围
微生物实验室所有标本。
3. 职责
微生物实验室检验人员应遵守本程序。
4. 程序
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1. 目的
保证检验前的质量控制，并对合格的标本进行规范的接种，不同类别的标本按照不同的接种方法，选择不同的培养基，有针对性地分离出有临床意义的致病菌。
2. 范围
微生物实验室所有标本。
3. 职责
微生物实验室检验人员应遵守本程序。
4. 程序
4.1 标本接种的优先处理原则
所有标本到达微生物实验室后都需及时处理，依据标本的性质，制定标本优先处理的四个水平方针，第一水平的标本需立即接种处理，第四水平的标本可延迟处理，以下为临床标本优先处理的四个水平方针。
4.1.1 水平一标本
分类属于“危险的或易被污染的”，是由于疾病入侵性质的严重性或所检测的微生物对环境温度等较敏感，容易死亡。此类标本必须立即处理，包括脑脊液、心包液、血液、支气管肺泡灌洗液、心脏瓣膜。
4.1.2 水平二标本
未保护并且能很快退化或污染的菌群能很快大量繁殖，从而改变这些标本的性质，必须很快提供合适生长的环境，使这些标本中营养要求高的微生物得以生长繁殖。此类标本包括痰液、未被列入水平一的体液、组织、伤口分泌物、粪便、脓液等标本。
4.1.3 水平三标本
为需要定量的尿液或定量组织活检标本，延迟处理则会影响到标本检出菌量的精密度。
4.1.4 水平四标本
为床边接种入培养基中的标本（如放入碱性蛋白胨水、血培养瓶、运送培养基的标本），是具有保护的标本，为了处理好较高水平的标本，水平四标本可以延迟处理。
4.2 标本的编号
标本的编号规则根据检验目的的不同，按照标本的接收、标识程序中的编号规则进行编号。
4.3 标本的处理
4.3.1 血液标本
接受标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要登记联系方式。将血培养瓶置于全自动血培养仪中培养。抽取血液前，先将血培养瓶颠倒混匀，血培养瓶口用75%酒精消毒。
待酒精干燥后，用一次性1ml注射器抽出待检标本，滴少量待检标本在每块平板上的一区。接种在平皿上的标本采用三分区划线法划线。
4.3.2 痰、肺泡灌洗液、支气管毛刷、纤支镜吸痰标本
4.3.2.1 痰标本先用无菌接种环挑取标本涂片。
4.3.2.2 用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再划第二、第三区。
4.3.3 咽拭子、咽喉分泌物标本
用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再用无菌接种环划第二、第三区。
4.3.4 脑脊液标本
用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再划第二、第三区。并离心涂片检查。
4.3.5 伤口分泌物、脓液、抽取物、胸腹水等穿刺液
床边抽取体液标本5～10ml注入血培养瓶，若量少时（1～2ml）可直接置于无菌管中，立即送检。接受标本后，立即对标本进行编号、登记，置孵育箱培养。
4.3.6 粪便或肛拭子标本
取粪便脓血或粘液部分标本接种于SS平板和中国蓝平板和血平板。霍乱弧菌培养（不能用肛拭子标本）需接种碱性蛋白胨水、庆大平板和SS平板。
4.3.7 尿标本
将尿标本混匀，用10μl定量接种环立即接种血琼脂平板、中国蓝平板，分离细菌和菌落计数。
4.3.8 生殖道分泌物标本
用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再用无菌接种环划第二、第三区。淋球菌培养直接接种于巧克力平板上。
4.3.9 以上标本真菌（念珠菌属）培养
加种一个沙保罗培养基。
4.4 标本的接种方法
4.4.1 平板划线接种法：平板划线接种法是最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥，可在临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样既有利于分离培养，又有利于培养某些对低温敏感的细菌（如脑膜炎奈瑟菌等）。划线接种时，接种环与培养基表面约成45°为宜。划线时应尽可能做到置、密、匀，有效地利用培养基表面达到充分分离细菌的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基上时或标本含菌较少时，采用分区划线接种，接种环可一直划完各区，不必灭菌。常用平板划线接种法有以下2种
4.1.1 分区划线法
4.4.1.1.1 此法用于痰液、粪便等含较多微生物标本的分离。
4.4.1.1.2 首先将接种环灭菌后冷却，沾取适量标本均匀划线5～6个往返于平板培养基第一区，将接种环火焰灭菌，待冷却，第二区接触第一区中央3～4次后连续划线5～6个来回，依次可分3～4区，最后烧灼接种环灭菌，每一区细菌数可逐渐减少，直至分离出单个菌落为止。
4.4.1.2 连续划线法
4.4.1.2.1 此法用于含菌量较少的标本（如中段尿）。
4.4.1.2.2 方法是首先用10μL定量接种环将标本以均匀直线涂布于平板培养基的中央一条线，然后用接种环在其自左向右连续划线并逐渐向下移动使标本均匀涂布于培养基平板上，不用烧环和分区。
4.4.2 斜面接种法：此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。其方法为从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯菌种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上画一条直线，再从底部开始向上画曲线接种，尽可能密而匀，或直接自下而上画曲线接种。如移种试管培养物时，可与斜面培养基管同持于左手，右手拿接种环的同时，小指与环指及环指与中指之间各拔取并夹持一个胶塞，取培养物直接接种于斜面培养基上，然后塞上胶塞，火焰灭菌管口和接种环。
4.4.3 穿刺接种法：此法用于保存菌种、观察动力或接种某些生化反应管。其方法是将纯菌插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基的底部，然后沿穿刺线退出接种针，其他操作与斜面接种法类似。
4.4.4 液体接种法：本法多用于普通肉汤、真菌肉汤及蛋白胨水等液体培养基的接种。其方法是左手持培养基与菌种管，右手持接种环并夹持胶塞，经火焰灭菌试管口后，以灭菌并冷却后的接菌环沾取菌种，倾斜液体培养基管，先在液面与管壁交界处研磨接种物（试管直立后液体应淹没接种物为准），然后再在液体中摆动2～3次接种环将标本洗下，塞好胶塞后轻轻混匀。
4.5 接种步骤
4.5.1 选择所需的培养基，标明标本编号。
4.5.2 接种环使用前需用电热高温接种灭菌器进行灭菌，方法是将接种环伸入加热孔的高热区，停留5～7秒或以肉眼可见接种环变红为止。
4.5.3 具体划线接种操作根据具体需要按上述几种接种法进行。
4.5.4 划线接种完毕后，盖好平皿盖、将平板倒置（板盖朝下），试管插入试管架，检查标记号的标本号、接种日期等，按要求放入相应孵育箱培养。
参考文献
1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,2007
2叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006

1.目的
规范细菌鉴定标准操作规程。
2.适用范围
革兰阴性菌、革兰阳性菌等。
3.职责
检验人员严格执行本程序。
4.程序
4.1.观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等观察内容应记录在跟单上。
4.2.涂片，革兰染色，观察染色性质及细菌形态，大小和排列，球菌、杆菌或螺形菌等内容应记录在跟单上。
4.3.初步生化反应：根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等
4.4.制定细菌鉴定方案
4.4.1仪器鉴定方案（以ATB为例）
4.4.1.1革兰阴性杆菌 选择ID32E卡。
4.4.1.2革兰阳性球菌 选择ID32STAPH ID32STREP卡。
4.4.1.3 酵母菌 选择ID32C卡（酵母菌鉴定卡）。
4.4.2 手工细菌鉴定方案。
4.4.2.1氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。
4.4.2.2氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合：触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸橼酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。
4.4.2.3疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。
4.4.2.4革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、凝固酶、CAMP试验、杆菌肽、胆计七叶苷、葡萄糖O/F、木糖、蔗糖、麦芽糖、硝酸盐、七叶苷、甘露醇等。
4.4.2.5革兰阳性杆菌，选择革兰阳性杆菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。
5. 参考文献
1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,2007
2叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006

1. 目的
规范不染色标本检查法标准操作规程。
2. 范围
微生物不染色标本检查。
3. 职责
微生物检验人员严格执行本程序。
4. 程序
不染色标本的检查法主要用于检查细菌的动力及运动状况。有鞭毛的细菌，在显微镜下呈现活泼的运动。
4.1 湿片法
用接种环取细菌悬液或细菌培养液2环，置于清洁载玻片中央，轻轻覆上盖玻片，于油镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。
4.2 悬滴法
取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各一块，将凹孔四周的平面上涂薄薄一层凡士林，取1接种环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻轻压，使盖玻片与凹孔边缘粘紧，使凡士林密封其边缘，菌液不致挥发变干.镜下观察时，先用低倍镜，调成暗光，对准焦距后以高倍镜观察，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见其从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野或位相显微镜观察其形态、活动。
4.3 毛细吸管法
主要用于检查厌氧菌的动力。以毛细管(长60～70mm，管径0.5～1.0mm)接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上，镜检。
5. 参考文献
1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,2007
2叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006

1．革兰氏染色原理：
革兰氏阳性菌细胞壁上有一层比阴性菌厚的肽聚醣，能与结晶紫紧密结合，不容易被脱色液脱掉，此为染色原理。
2．试剂组成：(BASO革兰氏染色液)
龙胆紫液 碘溶液 脱色液 沙黄溶液
3．染色方法：
3.1涂片待干经火焰固定后，加结晶紫染液染色10秒钟，水洗干净。
3.2碘液媒染10秒钟，水洗干净。
3.3滴加脱色液脱色，侧动玻片，10-20秒钟，水洗干净。
3.4沙黄复染10秒钟，水洗干净，待干，镜检。
4．结果判断：
G+菌呈紫色 G－呈红色
5．影响因素：
5.1涂片要均匀，厚度要适当，染妇科白带应稍延长染色时间，以镜检下细菌单个均匀分布为度。
5.2微火固定标本，以60℃为宜。
5.3染色时必须按操作规程进行，每次滴加染色液必须覆盖整个涂抹标本。脱色时间要适度，以无紫色流下即可。
5.4试剂储存避免高、低温环境及阳光直射。
6．质量控制：
阳性菌对照：金黄色葡萄球菌。
阴性菌对照：大肠埃希氏菌。
7．参考文献：
《全国临床检验操作规程》（第3版）

1. 抗酸染色原理：
结核菌、麻风杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质的皮膜而不易着色，但一经着色，盐酸酒精的作用也不容易脱色。利用此特性，以增强的染色液予以染色，然后再用盐酸酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初的颜色（红色），也就易于鉴别。
2. 试剂组合：(BASO抗酸染色液)
石碳酸复红；盐酸酒精溶液；亚甲基蓝溶液。
3. 染色方法：（热染法）
3.1在已经固定的涂片上滴加石炭酸复红，使其盖满涂面，徐徐加温，使冒蒸汽，但不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时添加，防止干枯，维持5分钟。
3.2待冷却后水洗干净。
3.3加盐酸酒精脱色，直到无红色脱落为止，约需2分钟，水洗干净。
3.4亚甲基兰复染0.5-1分钟，水洗，待干，镜检。
4. 结果判定：
抗酸性细菌（结核菌）呈红色。
非抗酸性细菌及细胞呈蓝色。
5. 注意事项：
5.1玻片应选择新而无纹路的，应经过95%乙醇脱脂方可使用。涂片厚度适中，涂片时注意不要四溅。涂片迅速在空气中干燥或在35℃孵干，，通过火焰固定待冷。染色液盖没涂片不可过多，以免溢出。
5.2水洗不可太急，阴干镜检，不用纸吸。镜检前加油时，不可触及标本，镜检后遇阳性，用擦镜纸将镜头擦干净。
5.3染色镜检结果采用分级报告，阳性结果应由他人复验。
5.4所有抗酸染色镜片上的编号应与登记本上一致，至少保留三个月。
6. 质量控制：
阴性菌对照：大肠杆菌
7. 参考文献：
《全国临床检验操作规程》（第3版）
《BASO抗酸染色液使用说明书》

1. 目的
规范墨汁染色标准操作规程。
2. 原理
墨汁染色（负染色法）：背景着色而菌体本身不着色法称负染色法。此法用以观察细菌及某种真菌的荚膜等。
3. 试剂
印度墨汁；曹素功墨汁。
4. 质控
新型隐球菌 ATCC 32609为阳性，白色假丝酵母菌ATCC 64677为阴性。
5. 操作步骤
脑脊液等其它标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于洁净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检，背景呈黑褐色，菌体无色。
6. 结果判断
新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。
7. 注意事项
7.1不要使用过期的印度墨汁。
7.2墨汁应无污染、无颗粒等。
8. 临床意义
主要应用于新型隐球菌的鉴定。
参考文献
1 周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,2007
2 叶应妩、王毓三、申子瑜主编，全国临床检验操作规程（第3版），东南大学出版社，2006

1. 目的
规范药物敏感性试验标准操作程序，确保药敏结果准确。
2. 原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
3. 试剂
MH培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。
4. 质控
4.1常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。
4.2质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信.
4.3质控的频率 由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作一次到两次质控菌株的测定。如果发现有失控的情况，就必须每日作一次，寻找失控的原因并予以纠正。如果连续30日失控<3次的，可以恢复每周一次。
5. 操作步骤
5.1挑取4～5个纯培养菌落
5.2用无菌生理盐水或MH肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同。
5.3用无菌棉拭蘸取校正过的菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个MH平板表面，再重复两次，每次旋转平板60º，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭涂布平板四周边
5.4涂布菌液的平板于室温中干燥3～5min后，无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，90mm直径的平板宜贴6张药敏纸片。
5.5将贴好纸片的平板置35℃ 孵育18～24h后，用卡尺量取抑菌圈直径。个别菌孵育温度，时间及条件应按照CLSI规定
6. 结果判断
根据CLSI M100最新标准将所测抑菌圈的大小，报告为敏感（S）、中介/中敏（I）或耐药（R）。
7. 注意事项
7.1测试链球菌时应测量生长受抑制区域而不是溶血受抑制区域。
7.2如抑菌圈内有独立生长的菌落，则提示可能有杂菌，需要重新分离鉴定和药敏试验。此菌落也可能为高频突变耐药株。
7.3某些细菌的磺胺类药抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可忽略不计，应以外圈为准。
8. 临床意义
测定细菌对药物的敏感程度，指导临床合理选用抗菌药物。
参考文献
1 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006
2 倪语星，尚红等主编.临床微生物学与检验.第4版.人民卫生出版社，2007
3 CLSI2009M100-S19

常用培养基及试剂是检验科微生物室的一个组成部分，是保证微生物室为临床提供及时、准确的检验报告的先决条件，良好的工作环境是制备优良品质培养基及染色液的必要因素，所以，培养基室因为工作性质的特殊要求应具备严格的操作环境，为达到这一要求培养基室工作人员应遵循以下原则：
(a) 桌面、地面无闲杂物品。
(b) 器皿、试剂摆放整齐便于擦拭消毒。
(c) 室内生物安全柜每次使用前1-2h打开紫外线灯，保证生物安全柜内环境清洁。
(d) 紫外线灯管定期用75%酒精擦拭清洁，灯管定期更换以保证其功效。
(e) 室内空气洁净度定期监测，要求达到合格标准。
(f) 工作人员操作前应戴口罩、帽子。
(g) 擦拭桌面含氯消毒剂浓度：500mg/L。
1 培养基种类
1.1 分离培养基：中国兰 SS
1.2 鉴定培养基：双糖、碱性蛋白胨水培养基、庆大霉素琼脂培养基
1.3 增菌培养基：营养肉汤
1.4 真菌培养基：沙保罗
2培养基配制
2.1中国兰乳糖琼脂
a 品牌：杭州天和
b 名称：China Blue Lactose Agar
c制作：
(a) China Blue Lactose Agar干粉35g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 上述各物混合于三角烧瓶。
(d) 15磅15分钟高压灭菌。
(e) 冷却到约50-60℃加入1%玫红酸溶液5ml。
(f) 冷却45-50℃左右倾倒无菌平皿。
c 用途：
检测肠杆菌科细菌的弱选择培养基。
d 配置方法来源：
参照杭州天和China Blue Lactose Agar配制说明。
2.2 SS琼脂
a 品牌：杭州天和
b 名称：SS Agar

c 制作：
(a) SS琼脂干粉63g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 上述各物混合加热至完全溶解。
(d) 冷却至45-50℃左右倾倒无菌平皿。
d 用途：
临床标本中分离沙门氏菌及志贺氏菌。
e 配置方法来源：
参照杭州天和 SS Agar配制说明
2.3双糖铁琼脂
a 品牌：杭州天和
b 名称：Kliger Agar

c 制作：
(a) 双糖铁琼脂干粉55g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 上述各物混合加热溶解。
(d) 分装试管约3.5ml。
(e) 15磅15分钟高压灭菌。
(f) 将灭菌后的试管倾斜至45度角冷却。
f 用途：鉴定、区分肠杆菌。
g 配置方法来源：
参照杭州天和 Kliger Agar配制说明。

2.4碱性蛋白胨水培养基
a 品牌：杭州天和
b 名称：碱性蛋白胨水培养基

c 制作：
(a) 碱性蛋白胨水培养基干粉20g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 上述各物混合加热溶解。
(d) 分装试管约8-10ml。
(e) 调PH8.3±0.1。
(f) 15磅15分钟高压灭菌。
d 用途：
霍乱弧菌的增菌。
e 配置方法来源：
参照杭州天和碱性蛋白胨水培养基配制说明。
2.5庆大霉素琼脂培养基
a 品牌：杭州天和
b 名称：Gentamycin Agar Medium

c 制作：
(a) 庆大酶素琼脂培养基干粉66g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 上述各物混合加热至完全溶解。
(d) 冷却45-50℃左右倾倒无菌平皿、不高压、不调PH。
d 用途：
霍乱弧菌分离、培养。
e 配置方法来源：
参照杭州天和庆大酶素琼脂培养基配制说明。
2.6营养肉汤
a 品牌：杭州天和
b 名称：Nutrient Broth

c 制作：
(a) 营养肉汤干粉13g。
(b) 蒸馏水1000ml。
(c) 将上述成份混合加热溶解。
(d) 分装试管，每管约3ml左右。
(e) 121℃15分钟高压灭菌。
d 用途：
多用途培养基、增菌。
e 配置方法来源：
参照杭州天和营养肉汤配制说明。

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1. 目的
保证检验前的质量控制，并对合格的标本进行规范的接种，不同类别的标本按照不同的接种方法，选择不同的培养基，有针对性地分离出有临床意义的致病菌。
2. 范围
微生物实验室所有标本。
3. 职责
微生物实验室检验人员应遵守本程序。
4. 程序
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