检测原理和问题处理.pptx

检测原理和问题处理实时荧光定量PCR检测技术(Real-time PCR)l 定量定量PCRPCR得数学原理得数学原理l 定量PCR得化学原理l 定量PCR得光学原理什么就是PCR？PCR得反应过程RT-PCR原理图荧光定量PCR得数学原理1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、Threshold Cycle (CT值)4、DNA0(初始模板)Threshold Threshold(阈值)DNADNA0 0(初始模板初始模板)Threshold Cycle Threshold Cycle (CT(CT值)Baseline Baseline 基基线基线 反应荧光明显增加前得背景荧光值。默认为3-15 cycles得信号值线性性图谱对数数图谱阈值 阈值=基线(背景)信号得标准偏差得10倍,即 PCR扩增信号进入相对稳定对数增长得最下限,通常设定在S型扩增曲线得增长拐点处附近。大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点Ct值 扩增反应中,当荧光信号增长到大于阈值时所对应得循环数,即PCR增长信号与 Threshold发生交汇得循环数,也就是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析得依据。DNA0确定初始模板得浓度确定初始模板得浓度l初始初始DNADNA量越多量越多,荧光达荧光达到某一值到某一值(域值域值)时所需要时所需要得循环数越少得循环数越少lLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系关系,根据样品扩增达到域根据样品扩增达到域值得循环数就可计算出样值得循环数就可计算出样品中所含得模板量品中所含得模板量 Real-time PCR动力学曲线和四个阶段 只有在荧光信号指只有在荧光信号指数扩增阶段数扩增阶段,PCR PCR 产产物量得对数值与起始模物量得对数值与起始模板量之间存在线性关系板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶我们可以选择在这个阶段进行定量分析。段进行定量分析。PCR PCR理论方程只在理论方程只在指数期成立。指数期成立。PCR产物得量与扩增循环数间得理论方程R Rn n=R=RB B+X+X0 0(1+e)(1+e)n n R Rs s R Rn n:第第N N次次PCRPCR循循环时得得荧光信光信号号强度强度R RB B:背景信背景信号号强度强度X X0 0(1+e)(1+e)n n R Rs s:每每个个分子得分子得荧光强度光强度与与分子分子数数目得乘目得乘积 经过一系列移一系列移项、取、取对数数等等复复杂数学数学公式公式变换:得到得到:Ct=k lg X0 0+b 线性方程,lg X0 0 越大,则CT值越小！从荧光信号实现定量结果 一、检测荧光信号增长,获取样品CT值 从荧光信号实现定量结果 二、绘制标准曲线 从荧光信号实现定量结果 三、以待测样品得Ct值对DNA0作图,得到定量结果l 定量定量PCRPCR得数学原理得数学原理l 定量PCR得化学原理l 定量PCR得光学原理常用得荧光标记方法1、DNADNA双链特异性染料 SYBR Green、SYTO 9、LC Green、Evagreen2、序列特异性探针 TaqMan、Molecular Beacons(分子信标)、Dual Probes(FRET)、LNA(Locked Nucleic Acid)Double-Dye probesSYBR Green I 工作原理1、每形成一个DNA双链,就有一定数量得染料结合上去2、染料一结合,就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比SYBR Green ISYBR Green I工作原理图片演示熔解曲线(Dissociation curve)目得:在PCR之后分析产物特异性基本程序:-解链;-复性;-升温检测;-降温;软件自动分析融解曲线(Dissociation curve)PCR双链产物荧光强度与温度得函数图,用于确认产物得特异性。TmTm值:50%DNA变成单链时所需要得温度,此温度与双链DNA得长度、GC含量有关,可部分代表产物序列得特异性;PCR反应完成后,控制体系温度缓慢升高,双链DNA解链成为单链DNA,SYBR Green被释放,荧光信号逐渐减弱;当体系到达某一特定温度时,某些DNA双链会突然完全解离,荧光强度也显著减弱;对融解曲线求一阶导数,峰值代表斜率改变最大值,该处所对应得横坐标值(温度),即Tm融解曲线(Dissociation curve)PCRPCR双链产物荧光强度与温度得函数图双链产物荧光强度与温度得函数图,用于确认产物得特异性。用于确认产物得特异性。原始图谱原始图谱导数图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线只有染料法才需要做熔解曲线,探针法没必要。探针法没必要。SYBR Green ISYBR Green I得优缺点成本低 不需要制备序列特异得针对性探针,且试剂便宜适合初步筛查 先用SYBR筛查,再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析 需鉴定PCR反应就是否有杂带、引物二聚体特异性问题 不能分辨主带与杂带,给出所有双链DNA得总信号多重定量问题 每个PCR管只能检测一个目标基因TaqmanTaqman原理原理 Taqman荧光定量技术就是以Taqman荧光探针为基础,Taqman荧光探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时,发射基团发射得荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶得53外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号得累积与PCR产物形成完全同步,从而实现定量。TaqMan探针得作用机理TaqmanTaqman探探针优点1.灵敏、特异性高灵敏、特异性高:每扩增一个特异产物只释放一个分子得荧光染料每扩增一个特异产物只释放一个分子得荧光染料,实时检测特异扩增实时检测特异扩增片断片断,非特异产物对检测信号没有影响非特异产物对检测信号没有影响,有效提高检测得专一性有效提高检测得专一性2.有多种不同波长得荧光基团对可供选择有多种不同波长得荧光基团对可供选择,可以实现在同一管内检测多可以实现在同一管内检测多重重PCR,降低成本也提高效率和准确性降低成本也提高效率和准确性3.避免了荧光染料对避免了荧光染料对PCR反应得影响反应得影响缺点 1.探针设计有一定难度探针设计有一定难度,需要验证效果需要验证效果2.探针合成质量对试验结果有较大影响探针合成质量对试验结果有较大影响3.荧光标记成本较高荧光标记成本较高多重检测原理原理 同一样本,多对引物,分别扩增不同得靶基因 不同得探针识别不同得靶基因 不同得荧光报告基团标记不同得探针目得目得 提高效率,节省时间 降低研究成本特点特点 一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因 要保证信号之间互不干扰常用得荧光染料DyeDyeExcitation Maxima(nm)Excitation Maxima(nm)Emission Maxima(nm)Emission Maxima(nm)FAMFAM495495520520SGISGI497497522522TETTET521521540540VICVIC530530552552JOEJOE526526552552HEXHEX540540557557CY3CY3552552570570TAMRATAMRA552552578578ROXROX585585605605Texas RedTexas Red595595615615CY5CY5643643667667l 定量定量PCRPCR得数学原理得数学原理l 定量PCR得化学原理l 定量PCR得光学原理荧光PCR区别于其她PCR方法主要有以下优点1)全封闭反应,无需PCR后处理 2)特异性强,灵敏度高 3)采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确 4)定量范围宽,可达到10个数量级 5)仪器在线式实时监测,结果直观,避免人为判断 6)可实现一管双检或多检7)操作安全,缩短时间,提高效率 8)利于自动化和联网管理 定量PCR常见问题处理扩增曲线-Amplification Plot-Amplification Plot 标准曲线-Standard Curve-Standard Curve 原始数据-ponent-ponent 各波长得原始信号-Spectra-Spectra 融解曲线-Dissociation-Dissociation 定量PCR实验中得10个常见缺陷1、引物或探针得设计不过关2、RNA模板质量差3、没有使用“预混液”,导致差异得累积4、发生污染5、没有使用无逆转录酶得阴性对照,排除基因组DNA得干扰6、选取了不恰当得“内参基因”7、在使用SYBR Green染料得实验中,没有引入“融解曲线分析”8、没有正确设置“基线”和“阈值线”9、反应体系“扩增效率”低下10、标准曲线得范围没有涵盖样品量得变化导致异常实验数据得常见原因错误得荧光染料设置错误得反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致得试剂蒸发实例1:没有标准曲线标准品没有填写相应得数值标准品没有填写相应得数值实例2:没有扩增曲线原因1:PCR参数设置错误数据收集步骤只有一个循环数据收集步骤只有一个循环,只收集了一个数据点。只收集了一个数据点。实例2:没有扩增曲线原因2:硬盘休眠,数据采集中断实例3:基线下滑从原始数据找原因1-91-9循环循环,ROXROX得信号下降得信号下降基线设定基线设定4-4-1313范围内范围内,ROXROX信号值变化信号值变化,FAMFAM得信号值基本固定得信号值基本固定;FAM/ROXFAM/ROX得校正后得校正后,基线不就是水平得直线基线不就是水平得直线;应该取应该取ROXROX信号稳定得信号稳定得10-2010-20循环为合理得基线范围。循环为合理得基线范围。实例3:基线下滑修改基线范围为10-20,重新分析实例3:基线下滑基线范围取10-20循环得数据,重新分析后得图谱实例4:扩增曲线弯曲 原因:基线设置得终点大于样品CT值。通常就是因为模板DNA浓度过高,若CT值 15,而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值设定过高。解决方案:减小基线终点设置至最小CT值前4个循环,重新分析数据。实例4:扩增曲线弯曲原因原因:样品浓度跨度太大,有得样品浓度太高,在同一基线设置情况下,会导致Ct值太小(小于基线右侧)得样品得曲线在右侧下跌。解决方案解决方案:对于能检测出Ct得样品,读出数据;浓度太高得样品,需稀释后另做实验。实例5-1:直线扩增曲线部分探针降解后,部分报告荧光基团从探针上脱落导致:基线抬高;扩增与荧光信号得增加不一致。实例5-2:直线扩增曲线扩增曲线就是一根水平直线扩增曲线就是一根水平直线说明没有检测到信号说明没有检测到信号,提示实验失败提示实验失败