血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用.ppt

血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用验用目的要求目的要求n n(一一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。掌握分离纯化蛋白质的基本原理。n n(二二)了解柱层析技术。了解柱层析技术。（一）分离纯化的意义（一）分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能结构与功能结构与功能结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明，对于了解生命活动的规律，阐明，对于了解生命活动的规律，阐明，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。生命现象的本质有重大意义。生命现象的本质有重大意义。生命现象的本质有重大意义。工业生产工业生产工业生产工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等的需要：食品、发酵、纺织、制革等的需要：食品、发酵、纺织、制革等的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗医疗医疗医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程基因工程基因工程基因工程的需要的需要的需要的需要（二）分离纯化的要求（二）分离纯化的要求1 1 1 1、纯度纯度纯度纯度：主要取决于研究的目的和应用上的：主要取决于研究的目的和应用上的：主要取决于研究的目的和应用上的：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的剂，都要求均一；工业、医药方面应用的剂，都要求均一；工业、医药方面应用的剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。要求均一。要求均一。要求均一。2 2 2 2、活性活性活性活性：要求大分子保持天然构象状态，有：要求大分子保持天然构象状态，有：要求大分子保持天然构象状态，有：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。高度的生物活性。高度的生物活性。高度的生物活性。3 3 3 3、收率收率收率收率：希望收率越高越好，但在分离纯化：希望收率越高越好，但在分离纯化：希望收率越高越好，但在分离纯化：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。损失越大。损失越大。损失越大。（三）分离纯化的一般程序（三）分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般生物大分子的分离纯化一般生物大分子的分离纯化一般生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：可分为以下几个阶段：可分为以下几个阶段：可分为以下几个阶段：材料的选择和预处理材料的选择和预处理材料的选择和预处理材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还破碎细胞及提取（有时还破碎细胞及提取（有时还破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）需要进行细胞器的分离）需要进行细胞器的分离）需要进行细胞器的分离）分离纯化：包括粗分级分分离纯化：包括粗分级分分离纯化：包括粗分级分分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离离和细分级分离离和细分级分离离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分其中前两个阶段为生物大分其中前两个阶段为生物大分其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。子分离纯化的前处理。子分离纯化的前处理。子分离纯化的前处理。选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定常用的蛋白质分离纯化技术常用的蛋白质分离纯化技术溶解度溶解度盐析盐析、等电点沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀分子大小分子大小透析、超过滤透析、超过滤密度梯度离心、凝密度梯度离心、凝胶过滤胶过滤带电特性带电特性电泳、电泳、离子交换层析离子交换层析吸附特性吸附特性吸附层析吸附层析对配体分子对配体分子的亲和性的亲和性依据性质依据性质方方 法法用于粗分用于粗分用于细分用于细分亲和层析亲和层析、金属、金属螯合层析螯合层析 一、盐析（一、盐析（中性盐沉淀中性盐沉淀）n n在在溶溶液液中中加加入入中中性性盐盐使使生生物物大大分分子子沉沉淀淀析析出出的的过过程程称称为为“盐盐析析”。除除了了蛋蛋白白质质和和酶酶以以外外，多多肽肽、多多糖糖和和核核酸酸等等都都可可以以用用盐盐析析法法进进行行沉沉淀分离。淀分离。n n盐析法的优点：盐析法的优点：成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。盐析的基本原理盐析的基本原理n n蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。n n中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶溶溶解解度度盐浓度盐浓度SaltingoutSalting-inSalting-in+等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱+水化膜水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）中性盐的选择中性盐的选择n n常用的中性盐常用的中性盐常用的中性盐常用的中性盐：(NH4)(NH4)2 2SO4SO4 1)1)溶解度大：溶解度大：溶解度大：溶解度大：0 0 20 20 80 80 100 100（NH4NH4)2 2SOSO4 4 70.6 75.4 95.3 70.6 75.4 95.3 103 103 NaNa2 2SOSO4 4 4.9 18.9 43.3 42.2 4.9 18.9 43.3 42.2 NaHNaH2 2POPO4 4 1.6 7.8 93.8 1.6 7.8 93.8 101 101 硫酸铵在硫酸铵在硫酸铵在硫酸铵在0 0时的溶解度，远远高于其它盐类时的溶解度，远远高于其它盐类时的溶解度，远远高于其它盐类时的溶解度，远远高于其它盐类2)2)分分分分离离离离效效效效果果果果好好好好：有有有有的的的的提提提提取取取取液液液液加加加加入入入入适适适适量量量量硫硫硫硫酸酸酸酸铵铵铵铵盐盐盐盐析析析析，一一一一 步就可以除去步就可以除去步就可以除去步就可以除去7575的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度提高了四倍。3)3)不不不不易易易易引引引引起起起起变变变变性性性性，有有有有稳稳稳稳定定定定酶酶酶酶与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构的的的的作作作作用用用用。有有有有 的的的的酶酶酶酶或或或或蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质用用用用2 23mol/L3mol/L浓浓浓浓度度度度的的的的（NH4NH4）2 2SOSO4 4保保保保存存存存可达数年之久。可达数年之久。可达数年之久。可达数年之久。4)4)价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。分段盐析分段盐析n n不同的蛋白质分子，由于其分子表面的不同的蛋白质分子，由于其分子表面的不同的蛋白质分子，由于其分子表面的不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团极性基团极性基团极性基团的的的的种类、数目以及排布的不同，其种类、数目以及排布的不同，其种类、数目以及排布的不同，其种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度水化层厚度水化层厚度水化层厚度不同，不同，不同，不同，故盐析所需要的故盐析所需要的故盐析所需要的故盐析所需要的盐浓度盐浓度盐浓度盐浓度也不一样，因此调节蛋白质也不一样，因此调节蛋白质也不一样，因此调节蛋白质也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出1)1)清蛋白等电点是清蛋白等电点是清蛋白等电点是清蛋白等电点是4.04.0，2 2球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是5.065.06，球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是5.15.1，球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是球蛋白等电点是7.17.1。2)2)清蛋白的分子量清蛋白的分子量清蛋白的分子量清蛋白的分子量远小于远小于远小于远小于球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白色色 谱谱 法法chromatography脱盐和纯化脱盐和纯化石油醚（流动相石油醚（流动相M）植物叶子的石油醚萃取液植物叶子的石油醚萃取液(样本样本)碳酸钙（固定相碳酸钙（固定相S）玻璃管（色谱柱）玻璃管（色谱柱）胡萝卜素、叶黄素胡萝卜素、叶黄素和叶绿素和叶绿素A、B连续色带连续色带（色谱）（色谱）1906年俄国植物学家米哈伊尔年俄国植物学家米哈伊尔.茨维特茨维特一基本概念一基本概念色色谱谱法法：利利用用混混合合物物中中各各组组分分的的理理化化性性质质的的差差异异（吸吸附附力力、溶溶解解度度、分分子子形形状状和和大大小小、分分子子极极性性、分分子子亲亲和和力力、电电荷荷等等），使使各各组组分分以以不不同同程程度度分分布布在在两两个个相相中中，其其中中一一个个相相叫叫固固定定相相，另另一一个个相相流流过过此此固固定定相相叫叫流流动动相相。由由于于各各组组分分受受流流动动相相作作用用产产生生的的推推力力和和受受固固定定相相作作用用产产生生的的阻阻力力不不同同，使使各各组组分分产产生生不不同同的的移移动动速速度度，从从而而使使结结构构上上具具有有微微小小差差异异的的各各组组分分得得到到分分离离的的过过程程，称之为色谱法。称之为色谱法。二特点二特点1、高效能、高效能2、高度选择性、高度选择性3、高灵敏度、高灵敏度4、操作简单、操作简单不足之处：定量精确，但定性较差不足之处：定量精确，但定性较差 色谱色谱三、色谱的种类三、色谱的种类气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱气液色谱气液色谱气固色谱气固色谱液液色谱液液色谱液固色谱液固色谱1、吸附色谱法、吸附色谱法2、分配色谱法、分配色谱法3、离子交换色谱法离子交换色谱法4、凝胶色谱法凝胶色谱法5、亲和色谱法、亲和色谱法按原理分类按原理分类二、脱盐（凝胶层析法）二、脱盐（凝胶层析法）透析只用于除盐类和小分子杂质超过滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加加压压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液凝胶层析n n又叫又叫又叫又叫分子筛层析分子筛层析分子筛层析分子筛层析。n n具备条件：具备条件：具备条件：具备条件：1 1 1 1惰性，惰性，惰性，惰性，2 2 2 2水不溶性，水不溶性，水不溶性，水不溶性，3 3 3 3能高度水化。能高度水化。能高度水化。能高度水化。n n常用分子筛：常用分子筛：常用分子筛：常用分子筛：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephadexSephadexSephadex）型号：型号：型号：型号：G200G200G200G200、G150G150G150G150、G100G100G100G100、G75G75G75G75、G50G50G50G50、G25G25G25G25、G15G15G15G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典琼脂糖凝胶（瑞典琼脂糖凝胶（瑞典琼脂糖凝胶（瑞典SepharoseSepharoseSepharoseSepharose、美国、美国、美国、美国Bio-GelABio-GelABio-GelABio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelPBio-GelPBio-GelPBio-GelP）n n原理：原理：原理：原理：1 1 1 1、分子量大的物质不能、分子量大的物质不能、分子量大的物质不能、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗进入凝胶粒子内部，随洗进入凝胶粒子内部，随洗进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空脱液从凝胶粒子之间的空脱液从凝胶粒子之间的空脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以隙挤落下来，所以隙挤落下来，所以隙挤落下来，所以大分子大分子大分子大分子物质迁移速度快物质迁移速度快物质迁移速度快物质迁移速度快；2 2 2 2、小分子物质要通过凝、小分子物质要通过凝、小分子物质要通过凝、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，胶网孔进入凝胶粒子内部，胶网孔进入凝胶粒子内部，胶网孔进入凝胶粒子内部，所以所以所以所以小分子物质迁移速度小分子物质迁移速度小分子物质迁移速度小分子物质迁移速度慢慢慢慢。蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化 离子交换色谱（离子交换色谱（ion exchange chromatography）以离子交换剂为固定相，利用样品中以离子交换剂为固定相，利用样品中不同的生物大分子的带电部分与具有相反不同的生物大分子的带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，而将混电荷的离子交换剂吸附强弱不同，而将混合物中的不同离子进行分离的色谱技术。合物中的不同离子进行分离的色谱技术。三、纯化（离子交换色谱法）三、纯化（离子交换色谱法）蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化阳离子交换剂（阳离子交换剂（cation exchanger）两种离子交换剂两种离子交换剂阴离子交换剂（阴离子交换剂（anion exchanger）RSO3H+Na+RS O3 Na+H+RNH4 OH+ClRNH4+Cl+OH蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化离子交换剂的化学成分离子交换剂的化学成分 1 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变通过改变盐浓度，辅助改变pHpH值进行梯度洗脱。值进行梯度洗脱。蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n n球蛋白中：球蛋白中：球蛋白中：球蛋白中：及及及及 球蛋白的球蛋白的球蛋白的球蛋白的pIpI6.56.5，带负电带负电带负电带负电 而而而而 球蛋白的球蛋白的球蛋白的球蛋白的pIpI6.5(pI7.36.5(pI7.3)，带正电，带正电，带正电，带正电 球蛋白先洗脱出来。球蛋白先洗脱出来。球蛋白先洗脱出来。球蛋白先洗脱出来。n n白蛋白中：白蛋白中：白蛋白中：白蛋白中：、及白蛋白均带负电，挂于柱上及白蛋白均带负电，挂于柱上及白蛋白均带负电，挂于柱上及白蛋白均带负电，挂于柱上 先用低盐洗去先用低盐洗去先用低盐洗去先用低盐洗去、球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 再用高盐竞争洗下白蛋白再用高盐竞争洗下白蛋白再用高盐竞争洗下白蛋白再用高盐竞争洗下白蛋白DEAE纤维素阴离子交换层析纤维素阴离子交换层析:本次实验纯化采用本次实验纯化采用操操 作作一、盐析一、盐析 白蛋白、白蛋白、白蛋白、白蛋白、球蛋白的粗分离球蛋白的粗分离球蛋白的粗分离球蛋白的粗分离 取取取取0.5ml0.5ml血清血清血清血清 取取取取0.5ml0.5ml饱和饱和饱和饱和(NH(NH)SOSO溶液，溶液，溶液，溶液，缓慢滴入，边加边摇缓慢滴入，边加边摇缓慢滴入，边加边摇缓慢滴入，边加边摇。混匀后于室温中混匀后于室温中混匀后于室温中混匀后于室温中放置放置放置放置1010分钟分钟分钟分钟。8000r/8000r/minmin10min10min 小心小心小心小心吸取吸取吸取吸取上清液，作为纯化上清液，作为纯化上清液，作为纯化上清液，作为纯化白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白用。用。用。用。沉淀加沉淀加沉淀加沉淀加0.5ml0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化蒸馏水，使之溶解，作为纯化蒸馏水，使之溶解，作为纯化蒸馏水，使之溶解，作为纯化 球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白用。用。用。用。洗脱液中蛋白质及盐分的检查洗脱液中蛋白质及盐分的检查n n取取取取9696孔板一块孔板一块孔板一块孔板一块，上四排加，上四排加，上四排加，上四排加300g/L300g/L三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸溶溶液液，下三排加下三排加下三排加下三排加BaClBaCl2 2液。液。液。液。n n从下端管口取从下端管口取从下端管口取从下端管口取1 1滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于300g/L300g/L三氯乙三氯乙三氯乙三氯乙酸酸酸酸中，出现中，出现中，出现中，出现白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。即有蛋白质析出。即有蛋白质析出。即有蛋白质析出。n n从下端管口取从下端管口取从下端管口取从下端管口取1 1滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于BaClBaCl2 2中，出现中，出现中，出现中，出现白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。即有盐分析出，不再收集。即有盐分析出，不再收集。即有盐分析出，不再收集。二、二、G-25凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备层析柱的制备（二）上样与洗脱：（二）上样与洗脱：n n1 1 1 1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降刚好下降刚好下降刚好下降到凝胶床表面到凝胶床表面到凝胶床表面到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床进行凝胶床进行凝胶床进行凝胶床)。n n2 2 2 2、关紧下端出口关紧下端出口关紧下端出口关紧下端出口，用滴管吸取盐析，用滴管吸取盐析，用滴管吸取盐析，用滴管吸取盐析球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白液，小心缓慢液，小心缓慢液，小心缓慢液，小心缓慢的的的的加到凝胶床表面上加到凝胶床表面上加到凝胶床表面上加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整胶床表面的平整胶床表面的平整胶床表面的平整)。n n3 3、开下端出口开下端出口开下端出口开下端出口，使样品进入凝胶床（，使样品进入凝胶床（，使样品进入凝胶床（，使样品进入凝胶床（刚好下降到刚好下降到刚好下降到刚好下降到凝胶床表面）凝胶床表面）凝胶床表面）凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量，关闭出口，小心加入适量，关闭出口，小心加入适量，关闭出口，小心加入适量pH6.5pH6.5的的的的0.02mol/L NH0.02mol/L NH4 4AcAc缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。n n4 4、放开，放开，放开，放开，流速约流速约流速约流速约2020滴滴滴滴/分钟，立即分钟，立即分钟，立即分钟，立即收集并检测收集并检测收集并检测收集并检测，2020磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，1010滴滴滴滴/管管管管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。n n5 5、BaClBaCl2 2检测出现检测出现检测出现检测出现白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀即有盐分析出，即有盐分析出，即有盐分析出，即有盐分析出，不再收集。不再收集。不再收集。不再收集。n n6 6、平衡再生：继续洗脱、平衡再生：继续洗脱、平衡再生：继续洗脱、平衡再生：继续洗脱30ml30ml。n n7 7、白蛋白样品脱盐。、白蛋白样品脱盐。、白蛋白样品脱盐。、白蛋白样品脱盐。1515滴滴滴滴/管收集管收集管收集管收集三、纯化（阴离子交换层析）三、纯化（阴离子交换层析）n n将脱盐后含将脱盐后含将脱盐后含将脱盐后含球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白的溶液加于的溶液加于的溶液加于的溶液加于DEAEDEAE纤维阴离子交纤维阴离子交纤维阴离子交纤维阴离子交换换换换柱上，用柱上，用柱上，用柱上，用0.02mol/L0.02mol/L NH NH4 4AcAc缓冲液洗脱，缓冲液洗脱，缓冲液洗脱，缓冲液洗脱，n n分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，三管，三管，三管，1010滴滴滴滴/管，编号管，编号管，编号管，编号。（纯化的。（纯化的。（纯化的。（纯化的球蛋白）球蛋白）球蛋白）球蛋白）n n继续洗脱继续洗脱继续洗脱继续洗脱30ml30mln n将脱盐后含将脱盐后含将脱盐后含将脱盐后含白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白的溶液加于柱上，用的溶液加于柱上，用的溶液加于柱上，用的溶液加于柱上，用0.06mol/L0.06mol/L NHNH4 4AcAc洗脱洗脱洗脱洗脱30ml30ml。n n改用改用改用改用0.3mol/L0.3mol/L NH NH4 4AcAc洗脱，检测到蛋白后立即收洗脱，检测到蛋白后立即收洗脱，检测到蛋白后立即收洗脱，检测到蛋白后立即收集集集集三管，三管，三管，三管，1515滴滴滴滴/管，编号管，编号管，编号管，编号。（纯化的白蛋白）。（纯化的白蛋白）。（纯化的白蛋白）。（纯化的白蛋白）n n再生：再生：再生：再生：1.5mol/L1.5mol/L NaCl NaCl0.3mol/L0.3mol/L NH NH4 4Ac 20mlAc 20ml，0.02mol/L0.02mol/L NH NH4 4Ac 40mlAc 40ml。四、醋酸纤维素薄膜电泳检查四、醋酸纤维素薄膜电泳检查（1 1 1 1）血清）血清）血清）血清（2 2 2 2）粗分的）粗分的）粗分的）粗分的-球蛋白液球蛋白液球蛋白液球蛋白液（3 3 3 3）粗分的白蛋白液）粗分的白蛋白液）粗分的白蛋白液）粗分的白蛋白液（4 4 4 4）纯化的）纯化的）纯化的）纯化的-球蛋白液球蛋白液球蛋白液球蛋白液（5 5 5 5）纯化的白蛋白液）纯化的白蛋白液）纯化的白蛋白液）纯化的白蛋白液样品：样品：以醋酸纤维薄膜为支持物，在以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PIPI均小于均小于8.68.6，带负电荷，电泳时向正极移动，由，带负电荷，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。于迁移率不同而被分离。实验原理实验原理 1准备与点样准备与点样2.电泳（点样面朝下，电泳（点样面朝下，110V 1h）3氨基黑氨基黑10B染色染色5分钟分钟4.漂洗漂洗2cm粗糙面粗糙面操作步骤操作步骤学号学号（1 1）血清）血清（2 2）粗分的）粗分的-球蛋白液球蛋白液（3 3）粗分的白蛋白液）粗分的白蛋白液（4 4）纯化的）纯化的-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（应多次点样于同一位置（2 2次），次），每次点样每次点样时时待干后再点待干后再点。（5 5）纯化的白蛋白液）纯化的白蛋白液样品：样品：影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素（1）样品本身：带电量、分子大小、形状。）样品本身：带电量、分子大小、形状。Q越多，越多，V越大；越大；r越小，越小，V越大；越大；球形分子球形分子纤维状纤维状（2）电场强度：）电场强度：X越大，越大，V越大越大（3）缓冲液：）缓冲液：pH 决定决定Q，(pHPI)越大，越大，Q越多，越多，V越大越大结果分析结果分析 21 21fibrinogenalbumin-+血浆血浆