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第十三章生物制品第十三章生物制品*第一节第一节 概概 述述三大主三大主要药物要药物化学药物化学药物生物药物生物药物中中 药药*药物化学药物生物药物中药生化药物生物合成药物生物体分离、纯化制得经发酵、基因重组等技术制得生物制品疫苗、血液制品、诊断试剂*一、生物药物与生物制品一、生物药物与生物制品1.生物药物生物药物 一般是指从动物、植物及微生物提取的，一般是指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物化学半合成或用现代生物技术也可用生物化学半合成或用现代生物技术制得得生命基本物质及其衍生物、降解物以制得得生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子得结构修饰物等。及大分子得结构修饰物等。包括：氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质、包括：氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质、核苷酸类等核苷酸类等*发展过程发展过程第一代：第一代：利用生物材料加工制成利用生物材料加工制成第二代：第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成份性治疗作用的特异生化成份第三代：第三代：应用生物工程技术生应用生物工程技术生产的天然生理活性物质产的天然生理活性物质鱼肝油鱼肝油胰岛素胰岛素重组重组人生长激素人生长激素*生物药物生物药物生化药物生化药物生物合成生物合成药物药物生物制品生物制品从生物体内分离纯化制得得从生物体内分离纯化制得得升华基本物质，以及用化学升华基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生合成、微生物合成或现代生物技术制得得一类药物。物技术制得得一类药物。利用现代生物技术研制得利用现代生物技术研制得药物，其中用基因工程生药物，其中用基因工程生产得药物称基因工程药物。产得药物称基因工程药物。应用普通得或以基因工程、应用普通得或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生细胞工程、蛋白质工程等生物技术获得的微生物、细胞物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源得组织和及各种动物和人源得组织和体液等生物材料制备，用于体液等生物材料制备，用于人类疾病治疗、预防和诊断人类疾病治疗、预防和诊断得药品。得药品。来源和来源和生产方法生产方法*动植物及微生物提取、分离的天然生物活性物质及半合成得到生命基本物质及其衍生物等2.生化药物生化药物biochemical drugs 人纤维蛋白原人纤维蛋白原凝血酶、胰蛋白酶凝血酶、胰蛋白酶肝素、玻璃酸肝素、玻璃酸 *应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的药品种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的药品 自动免疫制品自动免疫制品 3.生物制品生物制品biological products 其他（血液制品、组织制品等）其他（血液制品、组织制品等）免疫血清免疫血清菌苗、疫苗、类毒素菌苗、疫苗、类毒素诊断制品诊断制品*基因工程药物基因工程药物激素类及神经激素类及神经递质递质 类药物类药物细胞因子类细胞因子类药物药物酶类及凝血因子类药物酶类及凝血因子类药物人生长激素释放抑制因子人生长激素释放抑制因子人胰岛素人胰岛素人生长激素人生长激素人干扰素人干扰素人白细胞介素人白细胞介素集落刺激因子集落刺激因子*胰脏胰脏(A)n胰岛素原胰岛素原mRNAcDNA重组质粒重组质粒转化细菌转化细菌mRNA反转录酶反转录酶胰岛素原基因胰岛素原基因与质与质粒连粒连接接感染感染E.coli胰岛素原胰岛素原重组胰岛素原的合成*4.生化药物和基因工程药物特点生化药物和基因工程药物特点1 1）共同特点：）共同特点：活性强，毒副作用小活性强，毒副作用小2 2）分子量大，结构确证难）分子量大，结构确证难3 3）全过程全过程的质量控制：从原料、菌种到生产设备、的质量控制：从原料、菌种到生产设备、中间体、产品中间体、产品4 4）生物活性检查）生物活性检查5 5）安全性检查：异常毒性检查、过敏物质检查、）安全性检查：异常毒性检查、过敏物质检查、外源性外源性DNA残留量、宿主菌蛋白残留量等残留量、宿主菌蛋白残留量等 6 6）效价（含量）测定）效价（含量）测定*二、生物制品的种类和特点二、生物制品的种类和特点（一）生物制品的种类（一）生物制品的种类1、疫苗类药物（、疫苗类药物（vaccines）用病毒或立克次体接种于动物、鸡用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚、或经组织培养后制成。胚、或经组织培养后制成。*疫苗类药物种类疫苗类药物种类（1）细菌类疫苗：卡介苗、狂犬病疫苗等）细菌类疫苗：卡介苗、狂犬病疫苗等（2）病毒类疫苗：乙肝疫苗、腮腺炎减毒活疫苗）病毒类疫苗：乙肝疫苗、腮腺炎减毒活疫苗（3）联合疫苗：麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗）联合疫苗：麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗（4）双价疫苗及多价疫苗）双价疫苗及多价疫苗*2、抗毒素及抗血清类药物（、抗毒素及抗血清类药物（antitoxin and antisera）（1）抗毒素：用细菌类毒素或毒素免疫马等大动物）抗毒素：用细菌类毒素或毒素免疫马等大动物 所取得的免疫血清。（白喉抗毒素）所取得的免疫血清。（白喉抗毒素）（2）抗血清：用细菌或病毒免疫马等大动物）抗血清：用细菌或病毒免疫马等大动物 所取得的免疫血清。（抗狂犬病血清）所取得的免疫血清。（抗狂犬病血清）*3、血液制品（、血液制品（blood products）由健康人的血液或经特异免疫的人血浆由健康人的血液或经特异免疫的人血浆经分离、提纯或重组经分离、提纯或重组DNA技术制成的血浆蛋技术制成的血浆蛋白组分，及血液细胞有型成分。白组分，及血液细胞有型成分。人血白蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白人血白蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白*4、重组、重组DNA制品（制品（recombinant DNA products）利用重组利用重组DNA技术，将遗传修饰的编码技术，将遗传修饰的编码DNA通通过质粒或病毒载体导入受体细胞、微生物，过质粒或病毒载体导入受体细胞、微生物，DNA在在细胞中不断复制、表达，产生蛋白质细胞中不断复制、表达，产生蛋白质(药物药物)。*重组重组DNA制品种类：制品种类：1、细胞因子：重组人干扰素、白介素、细胞因子：重组人干扰素、白介素2、生长因子：重组人表皮生长因子、生长因子：重组人表皮生长因子3、激素：重组人胰岛素、激素：重组人胰岛素4、酶：重组链激酶、酶：重组链激酶5、疫苗：重组乙型肝炎疫苗（酵母）、疫苗：重组乙型肝炎疫苗（酵母）6、单克隆抗体：抗人、单克隆抗体：抗人T细胞细胞CD3鼠单抗鼠单抗*5、诊断制品（、诊断制品（diagnostic reagents）用于检测相应的抗原、抗体或机体免用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品疫状态的制品*诊断制品的种类：诊断制品的种类：1、体外诊断制品：由特定抗原、抗体或有关生物物、体外诊断制品：由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂、试剂盒。质制成的免疫诊断试剂、试剂盒。（HBsAg酶联免疫诊断试剂盒）酶联免疫诊断试剂盒）2、体内诊断制品：有变态反应原或有关抗原材料制、体内诊断制品：有变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂。（结核菌素纯蛋白衍生物）成的免疫诊断试剂。（结核菌素纯蛋白衍生物）*6、其他、其他 由有关生物材料或特定方法制成的生物制剂。由有关生物材料或特定方法制成的生物制剂。胰岛素、胃蛋白酶胰岛素、胃蛋白酶*（二）生物制品的特点（二）生物制品的特点生物制品化学合成药、中药分子量大、不确定小、确定结构难确定确定质量控制原料、生产过程、产品全过程质控产品、杂质活性生物检定法检查无安全性热源、过敏性、异常毒性、致突变、生殖毒性菌检（普通制剂）注射剂检热源、过敏性含量蛋白质含量、酶效价、活力主成分含量*生化药物即使组分相同，往往由于分子量不生化药物即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。同而产生不同的生理活性。例如：例如：1、低分子量肝素，其抗凝活性低于肝素。、低分子量肝素，其抗凝活性低于肝素。2、胶原蛋白的保湿功能远大于胶原多肽。、胶原蛋白的保湿功能远大于胶原多肽。*不同质控方法检测对象的特点不同质控方法检测对象的特点生物测定法生物测定法理化法理化法生产工艺生产工艺提取、分离提取、分离重组重组结构结构不明确不明确明确明确组分组分变异变异单一单一纯度纯度不纯不纯高纯度高纯度活性活性生物测定生物测定上市前采用生物活性测定上市前采用生物活性测定质控质控生物测定生物测定理化测定理化测定*三、生物制品的全程质量控制三、生物制品的全程质量控制、来源与种类、纯度、来源与种类、纯度、性状、干燥失重或水分、性状、干燥失重或水分、鉴别、残渣、鉴别、残渣、氨基酸组分分析、生物活性、氨基酸组分分析、生物活性、肽图、热原试验、肽图、热原试验、糖含量、含量分析、糖含量、含量分析*(一一)生物制品质量控制重点生物制品质量控制重点1、有效成分的同一性、结构确证、有效成分的同一性、结构确证2、有效成分的均一性、纯度检验、有效成分的均一性、纯度检验3、有害物质及残余杂质的控制、有害物质及残余杂质的控制4、高效灵敏的生物活性测定方法、高效灵敏的生物活性测定方法*收录于中国药典和中国生物制品规程（二）检验的程序和方法（二）检验的程序和方法鉴别鉴别杂质杂质检查检查安全性安全性检查检查含量（效价）含量（效价）测定测定*1.鉴别1 1）理化鉴别法：）理化鉴别法：UV、肽图肽图等等反应序列信息反应序列信息RP-HPLC法分析重组人胰高血糖素类多肽1（736）肽图谱标准品样品胰蛋白酶酶解 V8蛋白酶酶解rhGLP-1(7-36)由30个氨基酸组成，结构中含2Lys、1Arg、1Asp、3Glu*2 2）生化鉴别法：）生化鉴别法：免疫法免疫法、酶法、电泳法等、酶法、电泳法等3 3）生物鉴别法：动物试验等）生物鉴别法：动物试验等专属性强，应用广泛专属性强，应用广泛免疫双扩散法SDS-PAGEMarker Sample116.0k66.2k45.0k35.0k25.0k18.4k14.4k*2.杂质检查杂质检查1 1）一般杂质：氯化物、重金属、水分等）一般杂质：氯化物、重金属、水分等2 2）特殊杂质：有关物质等）特殊杂质：有关物质等 高效凝胶过滤色谱法(High Performance Gel Filter，HPGFC）、RP-HPLC 萄聚糖凝胶立体网状结构图*标准蛋白色谱图时间(min)04812165432 1.右旋糖酐蓝右旋糖酐蓝 2.醛缩酶醛缩酶 3.血清白蛋白血清白蛋白 4.碳酸酐酶碳酸酐酶 5.抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽 6.酪氨酸酪氨酸*3.安全性检查1 1）热原检查）热原检查 家兔法、鲎试剂法家兔法、鲎试剂法2 2）降压物质检查）降压物质检查3 3）过敏试验）过敏试验4 4）异常毒性试验）异常毒性试验 豚鼠、大鼠存活试验豚鼠、大鼠存活试验5 5）无菌试验）无菌试验6 6）宿主细胞蛋白残留、）宿主细胞蛋白残留、DNADNA残留残留 ELISA法法*1 1）理化分析法：）理化分析法：重量法、滴定法、重量法、滴定法、电化学法、光谱法电化学法、光谱法 色谱法（色谱法（HPLC法）法）4.4.含量（效价）测定含量（效价）测定例：蛋白质含量测定（例：蛋白质含量测定（ChP2005三部）三部）凯氏定氮法凯氏定氮法 Lowry法法 双缩脲法双缩脲法*2 2）生化分析法）生化分析法v 酶法：酶法：v免疫分析法免疫分析法酶活力测定法酶活力测定法 以酶为分析对象进行分析以酶为分析对象进行分析酶分析法酶分析法 以酶为分析工具或分析试剂以酶为分析工具或分析试剂 的分析方法的分析方法 *3 3）生物检定法）生物检定法 药物对生物体或离体器官所起的生物活性药物对生物体或离体器官所起的生物活性 测定效价时采用参考品，体内、体测定效价时采用参考品，体内、体外方法测定活性，计算效价外方法测定活性，计算效价IU 同时测定蛋白含量，计算特异比同时测定蛋白含量，计算特异比（比活性，（比活性，IU/mg）*第二节第二节 鉴别试验鉴别试验一、理化鉴别法一、理化鉴别法 （一）化学鉴别法：呈色反应，沉淀反应一）化学鉴别法：呈色反应，沉淀反应 鱼精蛋白（鱼精蛋白（-CONH-）结构有双缩尿反应。）结构有双缩尿反应。胃蛋白酶胃蛋白酶+酸、碱、有机溶剂、重金属酸、碱、有机溶剂、重金属 肽链破坏肽链破坏 沉淀沉淀 *（二）二）紫外分光光度法紫外分光光度法 辅酶辅酶A 的结构中含腺嘌呤，有紫外吸收。的结构中含腺嘌呤，有紫外吸收。蛋白质、多肽有固定的最大吸收波长。蛋白质、多肽有固定的最大吸收波长。*3、HPLC法法 保留时间、肽图的一致性（纯度保留时间、肽图的一致性（纯度95%以上）。以上）。构型均一，一个峰；构型均一，一个峰；构型不同，会出现两个峰。构型不同，会出现两个峰。*二、生化鉴别二、生化鉴别（一）酶法（一）酶法尿激酶（蛋白水解酶）尿激酶（蛋白水解酶）激活牛纤维蛋白溶酶原激活牛纤维蛋白溶酶原 溶解纤维蛋白溶解纤维蛋白 产生气泡产生气泡*（二）电泳法（二）电泳法 肝素（水溶液带负电荷）肝素（水溶液带负电荷）采用琼脂糖凝胶电泳法采用琼脂糖凝胶电泳法 鉴别，与对照品一致鉴别，与对照品一致。*（三）生物芯片技术（三）生物芯片技术 人类基因组计划的实施和大量珍贵的功能基人类基因组计划的实施和大量珍贵的功能基因组数据的获得，使得蛋白质研究显得越发重因组数据的获得，使得蛋白质研究显得越发重要。要。蛋白质芯片技术的出现为我们提供了一种比蛋白质芯片技术的出现为我们提供了一种比传统的凝胶电泳法更为方便和快速的研究方法。传统的凝胶电泳法更为方便和快速的研究方法。*生物芯片技术是一种将生命科学研究中的许生物芯片技术是一种将生命科学研究中的许多分析检测步骤和装置通过并行化和微型化处理多分析检测步骤和装置通过并行化和微型化处理后集成在一个只有几平方厘米大小的载体上的分后集成在一个只有几平方厘米大小的载体上的分析检测系统。析检测系统。*在薄片载体上在薄片载体上有规则地放置成有规则地放置成千上万甚至几十千上万甚至几十万个特性各异的万个特性各异的生物单元（如生物单元（如DNA、蛋白质或、蛋白质或生物组织；相应生物组织；相应地被称作为基因地被称作为基因芯片、蛋白芯片芯片、蛋白芯片或组织芯片）；或组织芯片）；*然后将其与待测样品在一定条件下反应，然后将其与待测样品在一定条件下反应，根据荧光等信号的变化来实现对未知样品的根据荧光等信号的变化来实现对未知样品的检测。检测。*三、生物鉴别三、生物鉴别（一）血清学法（一）血清学法体外抗原抗体试验体外抗原抗体试验 1、凝集反应、凝集反应 5、免疫扩散、免疫扩散 2、沉淀反应、沉淀反应 6、免疫电泳、免疫电泳 3、中和反应、中和反应 7、荧光标记、荧光标记 4、补给反应、补给反应 8、酶标记、酶标记*（二）生物学法（二）生物学法家兔惊厥试验鉴别胰岛素：家兔惊厥试验鉴别胰岛素：胰岛素大剂量注射胰岛素大剂量注射 家兔血糖降低家兔血糖降低30%惊厥惊厥 注射注射50%葡萄糖葡萄糖 惊厥停止惊厥停止*第三节第三节 杂质检查杂质检查一、一般杂质检查一、一般杂质检查 氯化物、硫酸盐、重金属、酸度、溶液澄清度、氯化物、硫酸盐、重金属、酸度、溶液澄清度、水分、干燥失重、残渣等。水分、干燥失重、残渣等。检查方法与化学药物相同。检查方法与化学药物相同。*二、二、特殊杂质检查特殊杂质检查 特殊杂质的种类：特殊杂质的种类：1、生物污染物：微生物、宿主细胞蛋白、外源、生物污染物：微生物、宿主细胞蛋白、外源DNA2、产品相关杂质：二聚体、多聚体、突变物、产品相关杂质：二聚体、多聚体、突变物、脱氨氧化产物等脱氨氧化产物等3、工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂、工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂、防腐剂等防腐剂等*（一）宿主细胞蛋白残留量检查（一）宿主细胞蛋白残留量检查 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定一般，病毒侵入的细胞就叫宿主细胞。病毒一般一般，病毒侵入的细胞就叫宿主细胞。病毒一般没有成型的细胞核，一般被蛋白质所包裹在里面没有成型的细胞核，一般被蛋白质所包裹在里面的是它的遗传物质，在病毒获得宿主后，利用宿的是它的遗传物质，在病毒获得宿主后，利用宿主的蛋白质和其他物质制造自己的身体，然后将主的蛋白质和其他物质制造自己的身体，然后将遗传物质注入到细胞内部感染细胞，有的使细胞遗传物质注入到细胞内部感染细胞，有的使细胞死亡，有的会使细胞变异，也就是所谓的癌变。死亡，有的会使细胞变异，也就是所谓的癌变。*残留在生物制品中的宿主细胞蛋白残留在生物制品中的宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)属异源蛋白属异源蛋白,既包括宿主细胞的结既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞构蛋白也包括宿主细胞(传代细胞传代细胞)分泌的促生分泌的促生长因子。长因子。有研究报道有研究报道,HCP不仅能引起机体的过敏反应还不仅能引起机体的过敏反应还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体。有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体。建立建立HCP残留量的检测手段对加强生物制品工残留量的检测手段对加强生物制品工艺过程的质量监控并最终提高制品的质量有极艺过程的质量监控并最终提高制品的质量有极大的帮助大的帮助,同时有助于开展药品生产的规范化研同时有助于开展药品生产的规范化研究究,切实降低临床使用药品不良反应事件的发生。切实降低临床使用药品不良反应事件的发生。*（二）外源性（二）外源性DNA残留量检查残留量检查（1）分子杂交技术）分子杂交技术(hybridization）（2）DNA结合蛋白（结合蛋白（threshold）分析系统）分析系统（3）实时定量）实时定量PCR(Q-PCR)*（三）产品相关杂质的检查（三）产品相关杂质的检查1、重组人生长激素产品中有关物质的限量检查、重组人生长激素产品中有关物质的限量检查（1）相关蛋白质）相关蛋白质（2）高分子蛋白质）高分子蛋白质2、破伤风抗毒素中痕量蛋质的检查、破伤风抗毒素中痕量蛋质的检查（四）残余抗菌素生素的检查（四）残余抗菌素生素的检查*二、安全性检查二、安全性检查（一）无菌检查（一）无菌检查（二）热原检查（二）热原检查 家兔法检查热原家兔法检查热原（三）细菌内毒素检查：家兔法、鲎试验（三）细菌内毒素检查：家兔法、鲎试验（四）异常毒性检查与特异性毒性检查：（四）异常毒性检查与特异性毒性检查：观察一定剂量药物的急性毒性反应。观察一定剂量药物的急性毒性反应。（五）过敏试验：检查异源蛋白（五）过敏试验：检查异源蛋白（六）致突变试验（六）致突变试验（七）生殖毒性试验（七）生殖毒性试验*异常毒性检查和特异性毒性检查异常毒性检查和特异性毒性检查：限度试验：限度试验 （1）异常毒性检查：通用安全试验，检查是否污染外源异常毒性检查：通用安全试验，检查是否污染外源 性毒性物质。性毒性物质。（2）特异性毒性检查：检查某些疫苗是否存在自身毒素特异性毒性检查：检查某些疫苗是否存在自身毒素 引起的特异性毒性的不安全因素。引起的特异性毒性的不安全因素。*（1）异常毒性检查）异常毒性检查例：小鼠（例：小鼠（17 22g）5只只 腹腔注射供试品腹腔注射供试品 0.5ml 观察观察7天天 每只小鼠体重增加每只小鼠体重增加 不得死亡不得死亡 如有一只死亡如有一只死亡 重复试验重复试验*（2）特异性毒性检查）特异性毒性检查 如：百日咳疫苗特异性毒性检查如：百日咳疫苗特异性毒性检查 a：小鼠体重减轻试验：小鼠体重减轻试验 b：小鼠白细胞增多试验：小鼠白细胞增多试验 c：小鼠组胺致敏试验：小鼠组胺致敏试验*过敏试验：检查异性蛋白过敏试验：检查异性蛋白例：细胞色素例：细胞色素C过敏试验过敏试验 细胞色素细胞色素C用注射用水配制成用注射用水配制成7.5mg/ml溶液（作为致敏溶液（作为致敏液和供试液）。液和供试液）。*豚鼠（豚鼠（250 350g）分别于分别于1、3、5天皮下或腹腔注射天皮下或腹腔注射0.5ml（致敏产（致敏产生抗体）生抗体）2周后周后 股静脉注射股静脉注射1ml（如有致敏性，即与抗体反应，肥（如有致敏性，即与抗体反应，肥大细胞释放组胺，产生过敏反应）大细胞释放组胺，产生过敏反应）15min内不得出现过敏反应内不得出现过敏反应（竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽（竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象出现声等现象出现2种或种或2种以上；抽种以上；抽搐、虚脱、死亡等现象之一，则为阳性）搐、虚脱、死亡等现象之一，则为阳性）*致突变试验致突变试验（）微生物回复突变试验（）微生物回复突变试验（）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（）啮齿动物微核试验（）啮齿动物微核试验（）微生物电极法的致突变试验（）微生物电极法的致突变试验*生殖毒性试验生殖毒性试验（）一般生殖毒性试验（）一般生殖毒性试验（）致畸敏感期毒性试验（）致畸敏感期毒性试验（）围生期毒性试验（）围生期毒性试验*第四节第四节 含量（效价）测定含量（效价）测定含量表示方法含量表示方法、百分含量（）：用于结构明确的小分子、百分含量（）：用于结构明确的小分子或水解后成小分子的药或水解后成小分子的药、生物效价或酶活力单位、生物效价或酶活力单位(IU)：用于酶、蛋白质：用于酶、蛋白质*含量测定含量测定、高效液相法、高效液相法(HPLC)：测定总体纯度，纯度：测定总体纯度，纯度95%以上。以上。、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：经银染显色，测出微量杂质蛋白质。经银染显色，测出微量杂质蛋白质。聚合体应在聚合体应在%以下，单体以下，单体+聚合体在聚合体在95%以上。以上。*（二）效价测定（二）效价测定体内或体外（细胞法）测生物活性，同时测蛋白体内或体外（细胞法）测生物活性，同时测蛋白 质含量，计算特异比活性。质含量，计算特异比活性。活性表示：单位数毫克蛋白活性表示：单位数毫克蛋白(IU/mg)*常用方法：常用方法：、理化法、理化法、生化法（酶法、电泳法、免疫法）、生化法（酶法、电泳法、免疫法）、生物检定法、生物检定法*一、理化分析方法一、理化分析方法（一）化学分析法：重量法、滴定法（一）化学分析法：重量法、滴定法（二）电化学法（二）电化学法（三）光谱法：比色法、紫外法、荧光法（三）光谱法：比色法、紫外法、荧光法（四）色谱法：（四）色谱法：HPLC法、灌注色谱法、法、灌注色谱法、高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法*（一）化学分析法（一）化学分析法1、重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所、重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的量。含成分的量。（1）提取法：溶剂提取成分）提取法：溶剂提取成分 挥发溶剂挥发溶剂 称重称重（2）挥发法：利用被测组分具有挥发性。）挥发法：利用被测组分具有挥发性。A、直接挥发法（残渣法）、直接挥发法（残渣法）B、间接挥发法（干燥失重）、间接挥发法（干燥失重）（3）沉淀法：被测组分）沉淀法：被测组分 沉淀沉淀 分离分离 烘干烘干 称重称重*2、滴定分析法：样品经标准溶液滴定反应计算含量。、滴定分析法：样品经标准溶液滴定反应计算含量。例：淀粉酶测定例：淀粉酶测定 淀粉酶淀粉酶+淀粉淀粉 还原糖还原糖+斐林试剂（斐林试剂（Cu2+）+OH-Cu2+H+KI I2 +Na2S2O3（滴定）（滴定）从从Na2S2O3滴定的量来推算淀粉的含量。滴定的量来推算淀粉的含量。*3、蛋白质测定的国标规定方法、蛋白质测定的国标规定方法 凯氏定氮法凯氏定氮法（1）原理：蛋白质是含氮的有机化合物。）原理：蛋白质是含氮的有机化合物。*（2）分析方法）分析方法 样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定。液滴定。根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。*（三）光谱分析法（三）光谱分析法 1、比色法：、比色法：供试品与显色剂发生颜色反应。供试品与显色剂发生颜色反应。如：蛋白质与双缩脲试剂如：蛋白质与双缩脲试剂*2、UV法：法：供试品或反应产物在某一波长处有最大吸收。供试品或反应产物在某一波长处有最大吸收。如：蛋白质在如：蛋白质在280nm处有最大吸收。处有最大吸收。*3、荧光分光光度法：、荧光分光光度法：（1）样品经紫外光照射产生荧光；）样品经紫外光照射产生荧光；（2）与荧光试剂反应的产物有荧光。）与荧光试剂反应的产物有荧光。*（三）色谱分析法（三）色谱分析法 1、HPLC法法 （1）RP-HPLC：色谱柱：色谱柱：C18、C8烷基硅烷键合相柱烷基硅烷键合相柱 流动相：流动相：甲醇甲醇-水（缓冲液）、乙氰水（缓冲液）、乙氰-水水 分析样品：肽类、氨基酸、蛋白质、多糖分析样品：肽类、氨基酸、蛋白质、多糖*（2）高效离子交换色谱法（）高效离子交换色谱法（HPIEC）：）：色谱柱：色谱柱：离子键合相柱离子键合相柱 流动相：流动相：不同浓度盐溶液（磷酸盐缓冲液）不同浓度盐溶液（磷酸盐缓冲液）分析样品：肽类、氨基酸、蛋白质分析样品：肽类、氨基酸、蛋白质 特点：特点：根据样品离子化程度进行分离；根据样品离子化程度进行分离；可回收活性蛋白质。可回收活性蛋白质。*（3）高效凝胶过滤色谱法（）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）：）：色谱柱：有亲水表面的有机物或改性硅胶色谱柱：有亲水表面的有机物或改性硅胶 流动相：流动相：缓冲液、有机改性剂、表面活性剂缓冲液、有机改性剂、表面活性剂 分析样品：肽类、蛋白质分析样品：肽类、蛋白质 特点：特点：可回收活性蛋白质；可回收活性蛋白质；测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。*2、灌注色谱法（、灌注色谱法（perfusion chromatography)以具有灌穿孔的颗粒作为分离介质的新型色谱以具有灌穿孔的颗粒作为分离介质的新型色谱技术。技术。主要用于基因工程药物和大分子药物的分离、主要用于基因工程药物和大分子药物的分离、纯化。纯化。*传统色谱法 灌注色谱法 介质 键合相硅胶等 颗粒5 10 um聚苯乙烯二乙烯苯高度交联结构；贯穿孔颗粒（扩散孔80 150 um，贯穿孔600800 um）流动相 从颗粒间隙流过，颗粒内部靠扩散 从内表面流过，扩散作用减小 流速 低，1ml/min 高，140cm/min 柱压 高 低 分辨率 低 高分析时间 长 短*3、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCE）根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小，及荷质比不同产生不同的迁移速度而进行分离。小，及荷质比不同产生不同的迁移速度而进行分离。*二、生化分析法二、生化分析法（一）电泳法（一）电泳法（二）酶法（二）酶法*（一）电泳法（一）电泳法 电泳法是指带电微粒在电场的作用下，向电泳法是指带电微粒在电场的作用下，向其对应电极方向按各自的速度泳动，而使组分其对应电极方向按各自的速度泳动，而使组分分离，再进行检测计算含量。分离，再进行检测计算含量。*（1）自由界面电泳：在）自由界面电泳：在U型管溶液中，同分子构型型管溶液中，同分子构型 及荷电的物质，与不同迁移率及荷电的物质，与不同迁移率 的物质之间形成明显界面。的物质之间形成明显界面。（2）区带电泳：在惰性支持介质中（纸、醋酸纤维）区带电泳：在惰性支持介质中（纸、醋酸纤维 素、凝胶），因泳动速度不同，形成素、凝胶），因泳动速度不同，形成 区带。区带。*3）高效毛细管电泳：在内径约）高效毛细管电泳：在内径约50m的毛细管中，的毛细管中，高压电场作用下分离样品。高压电场作用下分离样品。*电泳法一般分析步骤电泳法一般分析步骤1、配制缓冲液、配制缓冲液2、准备电泳介质、准备电泳介质3、点样、点样4、电泳、电泳5、显色定位、显色定位6、定量测定、定量测定*常用电泳方法的类型及其应用常用电泳方法的类型及其应用电泳类型 介质 特 点 应用纸电泳纸紫外观察或染色；洗脱或扫描定量核苷酸类、蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜光密度扫描血清蛋白、脂蛋白PAGE聚丙烯酰胺凝胶银染观察RNA、DNASDS-PAGE十二烷基硫酸钠-PAGE蛋白与SDS按重量比结合，Rm与分子量相关蛋白、酶的分子量琼脂糖凝胶电泳琼脂糖甲苯胺蓝、溴乙啶染色观察RNA、DNA及衍生物*（二）酶（二）酶 分析法分析法酶法酶活力测定法酶分析法以酶为分析对象，测定酶活性以酶为分析试剂，测定酶以外其他物质含量以活力单位、比活性表示%、mg/ml 等 *一一 酶分析法的基本知识酶分析法的基本知识二二 酶活力的测定酶活力的测定三三 酶法分析酶法分析*一 酶分析法的基本知识1.1 酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型1.2 酶分析法的特征酶分析法的特征1.3 酶分析法的意义酶分析法的意义*酶的化学组成单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质。单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质。结结合合蛋蛋白白酶酶：某某些些酶酶，例例如如氧氧化化-还还原原酶酶等等，其其分分子子中中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分。除了蛋白质外，还含有非蛋白组分。结结合合蛋蛋白白酶酶的的蛋蛋白白质质部部分分称称为为酶酶蛋蛋白白，非非蛋蛋白白质质部部分分包括辅酶及金属离子包括辅酶及金属离子(或辅因子或辅因子cofactor)cofactor)。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。*蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)辅助因子辅助因子(cofactor)金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)*辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。方法除去。辅基辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去滤的方法除去。*单体酶、寡聚酶、多酶复合体1.1.单体酶：由一条多肽链构成的酶。大多数的水解酶。单体酶：由一条多肽链构成的酶。大多数的水解酶。2.2.寡聚酶：由两条及两条以上的多肽链构成的酶。如：寡聚酶：由两条及两条以上的多肽链构成的酶。如：糖代谢的酶。糖代谢的酶。3.3.多酶体系：由几个功能上相关的酶嵌合而成的酶的多酶体系：由几个功能上相关的酶嵌合而成的酶的络合物。丙酮酸脱氢酶系。络合物。丙酮酸脱氢酶系。4.4.多功能酶：一些多酶体系在进化过程中由于基因的多功能酶：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。酶称为多功能酶。*1.1 1.1 酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型(1)(1)以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定，通常称为量或活力的测定，通常称为量或活力的测定，通常称为量或活力的测定，通常称为“酶活力测定酶活力测定酶活力测定酶活力测定”。(2)(2)以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等，一般称为活化剂和辅因子等，一般称为活化剂和辅因子等，一般称为活化剂和辅因子等，一般称为“酶法分析酶法分析酶法分析酶法分析”。两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能以酶能以酶能以酶能专一而高效地催化化学反应专一而高效地催化化学反应专一而高效地催化化学反应专一而高效地催化化学反应为基础，通过为基础，通过为基础，通过为基础，通过酶酶酶酶反应速度反应速度反应速度反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且的测定来检测相应物质的含量。并且的测定来检测相应物质的含量。并且的测定来检测相应物质的含量。并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法。都需要选择适宜的反应条件和测定方法。都需要选择适宜的反应条件和测定方法。都需要选择适宜的反应条件和测定方法。*1.2 1.2 酶分析法的特征酶分析法的特征酶分析法的特征酶分析法的特征 选择性高。选择性高。选择性高。选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。决定的。决定的。决定的。灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。一般可测到一般可测到一般可测到一般可测到1010-7-7mol/Lmol/L。如果与荧光法联用，。如果与荧光法联用，。如果与荧光法联用，。如果与荧光法联用，可高达可高达可高达可高达1010-9-9mol/Lmol/L左右。左右。左右。左右。*反应速度快，条件温和。反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在大多数酶促反应在30分钟以内可以完分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。近中性的条件下，反应速度很快。酶用量甚微，所以比较经济。酶用量甚微，所以比较经济。精确度一般。主要源于微量吸管误差，如精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。同时也与以下的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。组合方式有关。*适用范围有一定局限性。适用范围有一定局限性。适用范围有一定局限性。适用范围有一定局限性。只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。定。定。定。简便程度较差。简便程度较差。简便程度较差。简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件适反应条件适反应条件适反应条件(如温度、如温度、如温度、如温度、pHpH等等等等)的确定很重要，一个熟的确定很重要，一个熟的确定很重要，一个熟的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。往容易出错。往容易出错。往容易出