3种氟喹诺酮联合暴露对铜锈环棱螺的急性致死效应_张小旭.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 17 卷 第 6 期 2022 年 12 月Vol.17,No.6 Dec.2022 基金项目:湖南省教育厅科学研究项目青年项目(21B0511);吉首大学引进人员科研资助项目 第一作者:张小旭(1996),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20211215001张小旭,马陶武,李金曼,等.3 种氟喹诺酮联合暴露对铜锈环棱螺的急性致死效应J.生态毒理学报,2022,17(6):357-364Zhang X X,Ma T W,Li J M,et al.Acute lethal effects of combined exposure to 3 fluoroquinolones onBellamya aeruginosaJ.Asian Journal of Eco-toxicology,2022,17(6):357-364(in Chinese)3 种氟喹诺酮联合暴露对铜锈环棱螺的急性致死效应张小旭,马陶武,李金曼,罗奔向,周影茹,何兴兵,王萌*吉首大学生物资源与环境科学学院,吉首 416000收稿日期:2021-12-15 录用日期:2022-02-24摘要:氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones,FQs)的大量使用导致其不可避免地进入水环境中,并对水生生物产生毒性作用。当前关于 FQs 生态毒理的研究大多是基于单独的某种 FQs,而关于不同 FQs 间联合作用的研究较少。本文以铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)幼体为受试生物,首先分别研究了环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、诺氟沙星(norfloxacin,NOR)和左氧氟沙星(levofloxacin,LEVO)3 种 FQs 的急性致死效应,随后考察了 3 种 FQs 的联合毒性作用。结果表明,单一 FQ 暴露下随着暴露浓度升高和时间的延长,死亡率均呈现上升趋势,3 种 FQs 对铜锈环棱螺的急性毒性作用依次为 NOR(LC50:59.212 mg L-1)CIP(LC50:114.255 mg L-1)LEVO(LC50:123.706 mg L-1)。铜锈环棱螺对 FQs 暴露较为敏感,在 FQs 生态风险评价中有较大应用潜力。联合暴露结果表明,二元系统及三元系统联合毒性作用有所区别,与 FQs 种类、浓度和暴露时间长短有关,但最终都趋向于协同作用。本研究结果指示虽然 FQs 单一暴露毒性较弱,但不同 FQs 的联合作用导致毒性有所增强,应当予以重视并开展深入研究。关键词:氟喹诺酮;铜锈环棱螺;急性致死效应;联合毒性作用文章编号:1673-5897(2022)6-357-08 中图分类号:X171.5 文献标识码:AAcute Lethal Effects of Combined Exposure to 3 Fluoroquinolones on Bel-lamya aeruginosaZhang Xiaoxu,Ma Taowu,Li Jinman,Luo Benxiang,Zhou Yingru,He Xingbing,Wang Meng*College of Biology and Environmental Science,Jishou University,Jishou 416000,ChinaReceived 15 December 2021 accepted 24 February 2022Abstract:The massive use of fluoroquinolones(FQs)has led to their inevitable introduction into the aquatic envi-ronment and their toxic effects on aquatic organisms.Most of the current research on the ecotoxicology of FQs isbased on individual FQs,and there are fewer studies on the combined effects of different FQs.In this study,the a-cute lethal effects of three FQs,ciprofloxacin(CIP),norfloxacin(NOR),and levofloxacin(LEVO),were investiga-ted separately usingBellamya aeruginosalarvae as test organisms.And the combined toxic effects of the three FQswere investigated.The results showed that the mortality enhanced with the increased of exposure concentration andtime.The acute lethal effect of the three FQs onBellamya aeruginosawere in the order of NOR(LC50:59.212 mg L-1)CIP(LC50:114.255 mg L-1)LEVO(LC50:123.706 mg L-1).Bellamya aeruginosais sensitive to FQs ex-358 生态毒理学报第 17 卷posure and has great application potential in FQs ecological risk assessment.The combined exposure resultsshowed that the joint toxicity effects of binary and ternary system differed and were related to the type,concentra-tion and duration of exposure to FQs,but eventually tended to be synergistic.The results of this study indicate thatalthough the toxicity of a single FQs is relatively weak,but the combined action of different FQs resulted in en-hanced toxicity,which should be paid more attention to and carried out further research.Keywords:fluoroquinolones;Bellamya aeruginosa;acute lethal effect;combined toxicity 氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones,FQs)是在以 4-喹诺酮为基本骨架的基础上引入氟原子,人工合成的一类抗生素1。FQs 通过抑制 DNA 的促旋酶和拓扑异构酶,阻碍 DNA 的正常转录和复制从而产生杀菌作用2。常用的 FQs 包括环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、诺氟沙星(norfloxacin,NOR)和左氧氟沙星(levofloxacin,LEVO)(表 1)。由于 FQs具有抗菌范围广、抗菌活性强和价格低等优点3,因此被广泛使用于人畜疾病的预防与治疗,其使用量近年来在世界范围内持续增长4。伴随 FQs 的大量使用,其不可避免地进入环境当中。水环境是 FQs的主要环境归宿5,近年来,FQs 在全球范围内的水体中被频繁检出。其中河流和湖泊中的平均检出浓度达到 ng L-1。如孙秋根等6对我国太湖流域中宜溧-洮滆水系中 FQs 的研究发现其中氧氟沙星(ofloxacin,OFL)的检出率达到60.5%,FQs 总检出浓度达到 127 1 210 ngL-1;Valds 等7在阿根廷的某河流中 67%的样本中检测到 FQs,其中 OFL 和CIP 在上覆水中的最高检出浓度分别为 69 ngL-1和 78 ng L-1;付雨等8在我国白洋淀水体中检测出 FQs 的浓度达到 0.738 2 004 ngL-1;Wagil等9对波兰河流中 FQs 检测发现,其检出浓度达到2.7 g L-1。已有大量研究表明,进入水环境中的 FQs 会对水生生物产生毒性作用,如导致水中微生物活性丧失和降低生物群落的多样性10。FQs 还会积累在鱼类的组织中,影响鱼的发育,损害其心血管和代谢系统,并改变鱼的抗氧化和免疫反应11。目前,关于FQs 对水生生物的急性毒性效应已引起了广泛关注,研究结果表明水生生物暴露于高浓度的 FQs 中会对其产生急性致死效应12-13。然而当前关于 FQs生态毒理的研究大多是基于单独的某种 FQs,而关于不同 FQs 联合作用的研究较少。在受 FQs 污染的水环境中,往往存在多种 FQs14。如 Du 等15对盐城沿海地区 25 种抗生素的分布调查中发现一份样品中至少检出 3 种以上的 FQs,且通过对 FQs 的风险评估发现单一 FQs 对水生生物的风险较低,而混合 FQs 产生的潜在风险可能高于预期风险;Liu等16调查胶州湾的湿地表层中 FQs,发现所有样品中都检测到了 FQs,共有 8 种 FQs,其中 NOR 对环境可能达到中风险水平。鉴于此,为了合理评估FQs 的潜在生态风险,需要针对不同种类 FQs 的联合生态毒理开展研究。表 1 3 种氟喹诺酮类抗生素(FQs)的分子结构Table 1 Molecular structure of 3fluoroquinolones(FQs)名称Chemical分子量a/(g mol-1)Molecular massa/(g mol-1)分子结构式aMolecular structurea诺氟沙星(NOR)Norfloxacin(NOR)319.336环丙沙星(CIP)Ciprofloxacin(CIP)331.347左氧氟沙星(LEVO)Levofloxacin(LEVO)361.373注:a数据参考美国环境保护局(US EPA)(https:/comptox.epa.gov/dashboard)。Note:aData refers to United States Environmental Protection Agency(US EPA)(https:/comptox.epa.gov/dashboard).我国生态环境部在 2020 年 12 月发布的化学物质环境与健康危害评估技术导则(试行)17中明确指出,在进行生态毒理学数据的筛选和评估时应优先采用我国本土生物的实验数据。铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)属于腹足纲田螺科的淡水软体动物,是我国淡水环境中一种主要底栖大型无脊椎动物。近年来,已有大量使用铜锈环棱螺对污染物第 6 期张小旭等:3 种氟喹诺酮联合暴露对铜锈环棱螺的急性致死效应359 生态毒性进行评价的相关研究见诸报道18-20,本研究使用铜锈环棱螺幼螺为受试生物,以 CIP、LEVO和 NOR 为目标污染物,考察了 3 种 FQs 单一及联合暴露的急性毒性效应,分析了联合作用模式。本研究结果可为合理评价 FQs 的潜在生态风险提供理论依据,并为发展铜锈环棱螺在生态毒理学中的应用提供参考。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 测试生物本次实验所用的铜锈环棱螺种螺采自吉首市峒河湿地公园洁净水体,在实验室人工控制条件下按照 Ma21的方法进行培养:采用上覆水(水温(241),pH 7.990.15,硬度(78.43.3)mg L-1)循环系统进行培养并连续繁殖,每日投喂一次商用鱼饲料(三元牌,中国),光周期为 16 h 8 h(光 暗)。每日将新生幼螺挑出并单独培养。本研究选择同批次出生的大小均匀的健康幼螺(7 日龄,(0.040.002)g)用于暴露实验。1.2 个体毒性测试暴露方法1.2.1 单一毒性测试根据预实验结果将 CIP 和 LEVO(98%,联硕生物科技有限公司,中国)暴露浓度设置为 25、50、100、200 和 400 mg L-1,NOR(98%,联硕生物科技有限公司,中国)暴露浓度设置为 12.5、25、50、100 和 200mg L-1,并设空白对照组(0 mgL-1)。每组设 3 个平行,所有溶液配制均使用超纯水。暴露实验于 90mm 培养皿中进行,每个培养皿放入 10 只幼螺及 46mL 对应浓度的溶液。在生化培养箱(SPL-250,天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司,中国)中于 25 下暴露96 h,每24 h 更换暴露液,每8 h 观察并记录死亡螺数量,以将幼螺取出放入清水中静置观察 10min,期间幼螺无主动反应为死亡依据,螺死亡后及时取出。为确保数据有效性,共进行 3 次重复实验1.2.2 二元、三元联合毒性测试培养皿中加入二元复合工作液(CIP+NOR、CIP+LEVO、NOR+LEVO)及三元复合工作液(CIP+NOR+LEVO),其浓度均为相应 FQs 单独暴露下的 10%致死浓度(LC10)、20%致死浓度(LC20)和半致死浓度(LC50)的等毒效应比混合,每组设 3 个平行。1.3 联合毒性评价方法采用毒性单位法(TU)、混合毒性指数法(MTI)对CIP、NOR 和 LEVO 二元、三元联合毒性作用模式进行分析。毒性单位法和混合毒性指数法对联合毒性作用模式的计算方法如公式(1)(4)所示22。TUi=Am/Ai(1)S=ni=1(TUi)(2)S0=S/(TUi)max(3)MTI=1-lgS/lgn(4)式中:TUi为混合物中i组分的毒性单位;Am为联合染毒后混合物中i组分相应的 LC 值(mg L-1);Ai为i组分单独染毒后相应的 LC 值;S为各组分生物毒性单位相加之和;(TUi)max为混合物中所有组分的毒性单位的最大值;S0为生物毒性单位之和与毒性单位最大值的比值;MTI 为混合毒性指数;n为混合物中各组分的种类个数。联合毒性作用分为独立、相加、协同和拮抗 4 种作用类型,判断依据如表 2 所示23。1.4 数据处理使用 SPSS 21.0 软件,采用 Probit 回归模型分析计算 LC10、LC20和 LC50值;使用 OriginLab 2021 绘制随着时间和浓度增加死亡数变化的柱状图。表 2 联合毒性作用类型判断方法Table 2 Combined toxicity type judgment method评价方法Evaluationmethod协同作用Synergyreaction部分相加作用Partial additionreaction简单相加作用Simple additionreaction独立作用Independentreaction拮抗作用Antagonismreaction毒性单位法(TU)Toxicity Unit(TU)SS1S=1S=S0SS0混合毒性指数法(MTI)Mixed Toxicity Index(MTI)MTI10MTI1MTI=1MTI=0MTICIPLEVO。根据死亡数计算出 96 h LC10、LC20和 LC50如表 3 所示。2.2 联合暴露致死效应二元体系(CIP+LEVO、CIP+NOR 和 NOR+LE-VO)及三元体系(CIP+LEVO+NOR)对铜锈环棱螺幼螺的联合毒性评价分别如表 4 7 所示。由表 4 可知,CIP 和 LEVO 联合暴露下,对螺的毒性作用在24 h 均表现为拮抗作用;48 h LC10、LC20表现为协同作用,48 h LC50表现为拮抗作用;96 h LC10、LC20表现为协同作用,96 h LC50表现为部分相加作用。CIP 和 NOR(表 5)以及 NOR 和 LEVO(表 6)联合暴露下表现出相同的作用,即对螺的毒性作用在 24 h和48 h 时均表现为拮抗作用,然而,在暴露至 96 h时,转变为协同作用。CIP、NOR 和 LEVO 联合暴露24 h 对螺的毒性作用均为拮抗作用;48 h LC10表现为协同作用,48 h LC20表现为部分相加作用,48 hLC50表现为拮抗作用,96 h 均表现为协同作用(表7)。图 1 FQs 暴露不同时间下铜锈环棱螺死亡数量注:(a)CIP;(b)NOR;(c)LEVO。Fig.1 Number of deadBellamya aeruginosaunder FQs exposure at different timeNote:(a)CIP;(b)NOR;(c)LEVO.表 3 3 种 FQs 暴露 96 h 对铜锈环棱螺幼螺的致死效应Table 3 Lethal effects of 3 kinds of FQs onBellamya aeruginosalarva after exposure for 96 h(mg L-1)FQsLC10LC20LC50浓度(95%置信区间)Concentration(95%confidence interval)浓度(95%置信区间)Concentration(95%confidence interval)浓度(95%置信区间)Concentration(95%confidence interval)CIP13.4(2.06 28.1)27.9(7.83 48.6)114(71.8 196)NOR3.67(0.09 10.6)9.54(0.82 20.4)59.2(32.2 129)LEVO9.86(0.59 24.6)23.5(3.67 45.7)124(72.1 249)第 6 期张小旭等:3 种氟喹诺酮联合暴露对铜锈环棱螺的急性致死效应361 表 4 CIP 和 LEVO 联合暴露对铜锈环棱螺幼螺的毒性作用Table 4 Toxic effects of CIP and LEVO combined exposure onBellamya aeruginosalarva浓度Concentration24 h48 h96 hSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectLC102.571.95-0.36拮抗Antagonism0.051.815.19协同Synergy0.402.762.31协同SynergyLC203.451.90-0.79拮抗Antagonism0.251.893.01协同Synergy0.562.811.85协同SynergyLC505.711.81-1.51拮抗Antagonism3.291.97-0.72拮抗Antagnism1.041.570.95部分相加Partial addition表 5 CIP 和 NOR 联合暴露对铜锈环棱螺幼螺的毒性作用Table 5 Toxic effects of CIP and NOR combined exposure onBellamya aeruginosalarva浓度Concentration24 h48 h96 hSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectLC102.301.04-0.20拮抗Antagonism4.341.68-1.12拮抗Antagonism0.021.366.45协同SynergyLC202.641.02-0.40拮抗Antagonism3.971.71-0.99拮抗Antagonism0.081.504.63协同SynergyLC503.401.00-0.77拮抗Antagonism3.421.76-0.77拮抗Antagonism0.991.851.02协同Synergy表 6 NOR 和 LEVO 联合暴露对铜锈环棱螺幼螺的毒性作用Table 6 Toxic effects of NOR and LEVO combined exposure onBellamya aeruginosalarva浓度Concentration24 h48 h96 hSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectLC106.071.00-1.60拮抗Antagonism2.921.55-0.55拮抗Antagonism0.011.747.14协同SynergyLC204.581.00-1.20拮抗Antagonism5.241.52-1.39拮抗Antagonism0.061.795.04协同SynergyLC502.811.00-0.49拮抗Antagonism14.301.47-2.84拮抗Antagonism0.931.961.11协同Synergy表 7 CIP、NOR 和 LEVO 联合暴露对铜锈环棱螺幼螺的毒性作用Table 7 Toxic effects of CIP,NOR and LEVO combined exposure onBellamya aeruginosalarva浓度Concentration24 h48 h96 hSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectSS0MTI毒性作用Toxic effectLC104.931.87-1.30拮抗Antagonism0.661.981.60协同Synergy0.272.302.88协同SynergyLC205.841.82-1.55拮抗Antagonism1.292.350.63部分相加Partial addition0.362.422.48协同SynergyLC507.911.77-1.98拮抗Antagonism4.292.82-1.10拮抗Antagonism0.612.491.71协同Synergy362 生态毒理学报第 17 卷3 讨论(Discussion)本次研究中的 3 种 FQs 单一暴露下幼螺死亡数均随着时间和浓度的增加呈上升趋势。与本研究结果类似,Peltzer 等24的研究表明,随着暴露于低浓度 FQs 的时间和浓度的增加,蟾蜍幼虫(Rhinellaarenarum)生长和发育受到的影响会逐渐增加。Shen等25研究了多种 FQs 单一暴露 24 h 后斑马鱼的致死率,发现斑马鱼的致死率随着 FQs 浓度的增加而升高,与本次实验中铜锈环棱螺幼螺死亡率随浓度的增加而升高一致。通过比较本研究中 3 种 FQs间的 LC50可知 NOR 的毒性大于 CIP 和 LEVO。He等18用 NOR 和 OFL 对铜锈环棱螺幼螺进行急性毒性实验,研究发现 NOR 的毒性大于 OFL。根据新化学物质危害评估导则(HJ/T 1542004)26,化学品生态毒理学危害性按 LC50可分为极高(1 mgL-1)、高(1 10 mgL-1)、中(10 100 mgL-1)和低(100 mg L-1)。据此,CIP 和 LEVO 对铜锈环棱螺幼螺属低度生态毒理学危害,而 NOR 属于中度危害。目前关于不同 FQs 间联合毒性作用的研究已有一些报道,如 Riaz 等27研究了 CIP、LEVO 和恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)联合暴露对小麦萌发和温室沙土培养下的短期毒性,结果表明 FQs 在低浓度下便会发生协同毒性作用;Wang 等14探究了红霉素和 ENR 单一及联合暴露对小球藻的毒性,发现联合暴露对小球藻的抗氧化和光合系统有更大的刺激作用。上述研究结果与本文中暴露 96 h 后各浓度产生的毒性作用趋向于协同作用的结果一致,指示不同种类 FQs 的联合污染产生的风险不容忽视。此外,本研究结果还显示,在暴露至 24 h 时联合毒性作用均为拮抗,而在 96 h 时绝大部分均转为协同作用,仅有 CIP+LEVO 在 LC50浓度下为部分相加作用。Magdaleno 等28用 6 种抗生素分别二元联合对羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)进行了复合暴露,结果表明联合暴露产生的毒性作用在前期为拮抗作用,后期为协同作用,这与本研究结果一致。对于联合暴露毒性在前期表现为拮抗作用的原因可能是不同化合物间在生物体内发生了竞争吸收作用29。Xu 等30的研究指出 CIP 可通过下调药物代谢酶 CYP3A29 的基因表达和阻碍 CYP3A29 与ENR 的结合而延缓 ENR 在猪肝脏中的代谢,这可能是本研究中不同 FQs 间联合暴露毒性最终趋向协同作用的潜在机制。目前针对 FQs 对水生生物毒性的研究大多使用国际上通用的模式生物,如 Han 等31研究了 17种 FQs 对斑马鱼胚胎的致死效应,研究结果表明CIP 和 LEVO 的 LC50分别为 619.618 mgL-1和5 420.595 mg L-1;Xi 等12的研究表明1 200 mg L-1的 NOR 对斑马鱼胚胎暴露 96 h 后,死亡率为46.7%。相比于本次实验所使用的铜锈环棱螺幼螺,上述研究中 FQs 对斑马鱼胚胎的 LC50较高,指示铜锈环棱螺幼螺对 FQs 暴露的敏感性更高。Ker-garavat 等32使用大型溞(Daphnia magna)和网纹溞(Ceriodaphnia dubia)研究了莫西沙星(MOXI)的生态毒性,结果显示大型溞暴露 48 h 和 72 h 的 LC50分别为14.2 mg L-1和3.4 mg L-1,网纹溞暴露48 h 和72 h 的 LC50分别为 29.2 mgL-1和 5.4 mgL-1,表明水溞类对 FQs 暴露较为敏感。大量研究证实 FQs在进入水环境后倾向于富集于沉积物当中,其在沉积物中浓度远高于地表水33,因此开展基于沉积物介质的 FQs 生态毒理研究具有重要科学意义。为顺利开展该方面的研究迫切需要一种营沉积物栖居且对 FQs 较为敏感的受试生物,本研究结果表明本土淡水底栖大型无脊椎动物铜锈环棱螺对 FQs 暴露较为敏感,是一种适合开展 FQs 在我国水环境尤其是沉积物中生态风险评价的受试生物。当前关于 FQs 对水生生物的毒性效应已受到大量关注,然而对于不同 FQs 的联合毒性效应研究较少。本研究考察了 3 种 FQs 单一及联合暴露对本土生物铜锈环棱螺幼螺的致死效应。单一暴露结果表明 NOR 对铜锈环棱螺幼螺为中度危害,而 CIP和 LEVO 为低度危害。铜锈环棱螺对 FQs 暴露较为敏感,是一种适合开展 FQs 在我国水环境中生态风险评价的受试生物。联合暴露研究结果显示 3 种FQs 的毒性作用趋向于协同作用,指示尽管 FQs 单独暴露导致的毒性效应较低,然而鉴于不同 FQs 往往共存于水环境当中,其联合毒性作用可能会导致更高的水生态风险,需对其开展深入研究。通信作者简介:王萌(1988),男,博士,讲师,主要研究方向为生态毒理学。参考文献(References):1 沙乃庆,李艳红.氟喹诺酮类抗生素水污染现状及去除技术研究进展J.工业水处理,2021,41(5):22-28Sha N Q,Li Y H.Current situation of water pollution andresearch progress treatment technology of fluoroquinolone第 6 期张小旭等:3 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