第二章磺胺二甲嘧啶抗体的制备.doc

个人收集整理 勿做商业用途第二章 磺胺二甲嘧啶抗体的制备引言免疫分析是以抗原抗体间的特异性反应为基础，其作为一种特殊的分析技术，近几年在兽药和农药等小分子化合物的残留分析中的应用越来越广泛，抗体是该技术中的核心试剂。临床上使用的抗体主要有多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）和单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）两类.McAb是由一个祖代B淋巴细胞通过无性繁殖所产生的基因组相同，表现性状一致的细胞群所产生的免疫球蛋白。McAb针对某一特定的抗原决定簇或表位，并且由于均来源于同一祖代B淋巴细胞，其结构相同、特异性强，生物活性高，在免疫特性和理化性质等方面高度一致；具有均一性，专一性和无限量供应等特点，非常利于标准化。PcAb是直接免疫动物获得抗血清，由于抗原物质具有多种抗原决定簇所以用该法获得的抗血清是多种特异性不同的抗体混合物称为多克隆抗体。多克隆抗体也称为第一代抗体,虽然简单易得但产量有限，效价不稳定。本研究用合成的完全抗原SM2BSA免疫小鼠，此时小鼠脾细胞具有分泌抗体的能力;同时扩大培养SP2/0骨髓瘤细胞，SP2/0细胞具有连续繁殖的能力;将免疫后鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，利用选择性培养基选择培养杂合体细胞，通过ELISA进行阳性测定，克隆化筛选，选择出合适的阳性杂交瘤细胞株;细胞株扩大培养后，通过动物体内诱生的方法，制备了大量的含有单克隆抗体(McAb )的腹水;腹水经纯化,可得到高纯度的抗体，采用ELISA等方法对单抗亲和性及对抗原的特异性等性质进行考察。同时对新西兰大白兔进行免疫，制备出抗磺胺二甲嘧啶的多克隆抗体，在对抗题进行鉴定后，选取好的抗体继续建立酶联免疫分析方法和对新型检测方法进行探索。磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备材料与方法实验材料主要仪器医用净化工作台（北京设备厂)；CO2恒温培养箱OPTIMA；光学倒置显微镜（OLYMPUS）；台式低速离心机（HERMLT）；酶联免疫检测仪(SPECTRAIII)；微量移液器（220l 、20200l、2001000l， 德国，Eppendorf)。主要材料与试剂BSASM2（防化学院范崇旭博士提供）;磺胺二甲嘧啶（SM2）；牛血清白蛋白(BSA）；卵清蛋白（OVA)；碳二亚胺（EDC）；福氏完全佐剂(FCA）；福氏不完全佐剂（FICA）；二甲基亚砜(DMSO);辣根过氧化物酶（HRP)；胎牛血清（FBS)；DMEM培养基；谷氨酰胺；HAT;HT；PEG以上均购自sigma公司；细胞96孔、24孔培养板；96孔酶标板；细胞培养瓶均购自costar公司；Balb/C小鼠、新西兰大白兔，中国医学科学院实验动物研究所。实验方法抗原联接:采用碳二亚胺法联结SM2和BSA,投料比为1分子BSA对100分子SM2.（1#免疫原）免疫程序 以范博士提供(2#免疫原）的和自己联接的BSASM2作为免疫原，选用68周龄雌性BALB/c小鼠5只，取免疫抗原100g（以蛋白含量计算)，加生理盐水、弗氏佐剂乳化后。按照常规免疫程序对BALB/C小鼠进行背部皮下多点注射免疫。每次免疫时间间隔为4周,免疫45次后采集血清并测定滴度。小鼠在融合前3天开始进行腹腔注射加强免疫。表 BALB/C小鼠的免疫方案Table Immunization protocol免疫次数Immunity times佐剂类型Adjuvant间隔时间Interval（d)抗原量（g/只）Ammount注射部位Injection sites基础免疫弗氏完全佐剂1420颈背部皮下多点第1次加强弗氏不完全佐剂2810颈背部皮下多点第n次加强弗氏不完全佐剂2810颈背部皮下多点腹腔加强生理盐水融合前3天10腹腔抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体细胞株的建立骨髓瘤细胞的复苏和培养：从液氮罐中取出冰冻的骨髓瘤细胞，将冻存管迅速放入37水浴中，快速复苏，将冻存的细胞悬液融化后以8OOrpm离心5min，弃去上清液，加入约5m1 GEN培养基，置于37 C02培养箱中培养。细胞经换液、传代扩大培养，直至细胞状态良好、细胞数目增多可供细胞融合之用.融合：经过三次加强免疫后，对小鼠进行眼底采血，抗血清具有较高滴度即可进行融合。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按10-2：1的比例在50%PEG（Mr：1，2001,600)作用下融合。融合后的细胞至于培养基中，铺于含有饲养细胞的96孔培养板内，在37，5%CO2的培养箱中培养2,3。筛选：待细胞群落长至14孔大小时,采用ELISA方法进行筛选。包被板制备:包被浓度0。5gml,包被体积100l/孔,4放置过夜，洗涤一次，以200l孔封闭液37封闭包被板1h,拍干，4放置.分析方法：100l孔温浴液（阴性对照)或100l孔细胞上清或100l孔阳性血清（阳性对照），37温育1h，洗涤三次，100l孔羊抗小鼠二抗HPR，37温育0.5h，洗涤三次，100l孔TMB（H2O2） 37显色15min，50l孔2M H2SO4终止反应，450nm测量O.D.值。克隆化:将细胞上清液呈阳性的细胞株按有限稀释法进行克隆化，待细胞长至1/5空时筛选、克隆，直至全部细胞上清液呈阳性为止。诱发腹水:将已成功克隆的细胞扩大培养后，以5105个细胞只的剂量接种于用降植烷处理的Balb/c小鼠腹腔内，78天后即可获得含阳性单克隆抗体的小鼠腹水。腹水经沉淀离心后去上清备用。抗体鉴定： 抗体滴度测定：采集来的腹水进行倍比稀释后，用ELISA法测定其IC50时的腹水稀释倍数。抗体亲和常数测定：按照Beatty等提出的方法测定抗磺胺二甲嘧啶的抗体亲和常数4。抗体十倍倍比稀释与二倍倍比稀释包被原,通过ELISA方法测定，以抗体的不同稀释浓度为横坐标，测定的相应OD值为纵坐标，绘出不同浓度的抗原反应曲线，从反应曲线上针对每一包被原的浓度读出最大吸光度值OD50一半时对应抗体浓度，利用下列公式确定Kaff:Kaff=（n-1)/2(n（Ab)t-（Ab)t）N=(Ag)t/(Ag)t其中(Ag）t和（Ag)t分别为两个不同的包被浓度,（Ab）t 和（Ab)t 为对应包被原浓度(Ag)t和（Ag）t时，达到O。D50时的抗体浓度。抗体特异性测定：对SM2抗体采用ELISA方法，对类似物测定其交叉蛋白G亲和层析法提纯抗体：用亲和层析柱纯化抗体，腹水经缓冲液（PB， 0.02mol/L， pH 7。4)适当稀释后,上样用于平衡缓冲液平衡好的亲和柱，用平衡缓冲液彻底洗去杂蛋白后，换洗脱液(GlyHCI， O.1mol/L. pH 2。8）将抗体洗下，洗下的抗体立即用中和缓冲液(Na2HPO4, 0。2mol/L， pB9。0)中和，使pH恢复至7.0左右，以免失去活性。抗体特异性鉴定将SM2、SMX、SMP、SMM、SQX、STZ、SDZ、SAM进行倍比稀释,每个浓度分别取50l加入到包被封闭好的酶标板微孔内，再加入50l最适工作浓度的抗体37温育反应1小时，其余步骤同ELISA筛选操作流程.计算各竞争物中的IC50，按下列公式计算各竞争物与SM2抗体的交叉反应率。SM2IC50 (ng/ml)交叉反应率(%）=- X 100竞争物IC50 （ng/ml）结果与分析融合与筛选结果研究进行了7次融合实验，经细胞筛选与克隆共获得11株阳性细胞株，具体见下表:表Table融合次数免疫原结果1SM2OVASM2 2A3SM2 2B9SM2 2G7SM2 4G11SM2 4H32防化学院未融合上3防化学院SM2 7H74防化学院无阳性5防化学院SM2-17A66防化学院SM2-23E1SM2-24H37防化学院SM225C4SM227F42不同细胞株诱发腹水效价及10ng SM2 抑制情况抗体效价是评价抗体性能的一个重要指标，本研究采用间接ELISA法测定抗体在不同稀释倍数情况下的结合情况，以最高结合一半时认定为抗体效价，结果如下：表table编号27F425C424H323E117A67H74H34G112G72B92A3滴度5E65E52E55E51E33E31E72E61E73E52E5为了检验抗体是否能够应用于免疫竞争反应，我们选取一定稀释度的腹水与等体积含0、10ng/ml SM2标准品溶液混合加入包被有一定浓度的BSA-SM2 的酶标板内反应，检验其（O。D450 10ng/ml）/ （O.D450 0ng/ml）。由于磺胺二甲嘧啶单个药物的LOD为10ng/ml,我们用10ng/ml的磺胺二甲嘧啶作为竞争物来考察抗体能够达到足够的检测灵敏度。表table编号27F425C424H323E117A67H74H34G112G72B92A3工作浓度5E65E52E51E51E21E35E61E65E62E52E5O.D450 10ng1.3780。8050.2820。6451。0761。1421.6591。0761。3461.3753.014O。D450 0ng1。2520。8750。5341.9110。9711.3111。7360。9751.2991.5092。799从以上结果中可以看出仅23E1可以达到检测灵敏度，是所得到的11株抗体中唯一一株可以应用于免疫反应的单克隆抗体。抗体亲和性经过7次融合实验我们获取了11（27F4、25C4、24H3、23E1、17A6、7H7、4H3、4G11、2G7、2B9、2A3)株单抗,但只有1株23E1既有滴度同时又可以做出抑制曲线。按照Beatty等提出的方法对其亲和常数进行测定，得到如下结果：表1抗体亲和常数抗体编号23E1Ka L/Mol3。51083。2抗体特异性用酶联免疫分析法（ELISA）测定其与其他几种磺胺类药物的交叉反应率:表2 抗体与其他磺胺类药物的交叉反应率交叉物SM2SMZSMPSMMSQSTSDZSAM23E1100%-0.050.05%数据表明所制备的单抗23E1与SM2交叉反应率为100%，与磺胺嘧啶（SDZ)、磺胺噻唑（STZ）交叉反应率0。01%，与其他磺胺类药物基本无交叉。磺胺二甲嘧啶多克隆抗体的制备实验动物新西兰大白兔,中国医学科学院实验动物研究所。主要试剂：同单抗制备实验方法免疫方案新西兰大白兔3只，平均体重2。0kg,单笼饲养。基础免疫：取适量合成的免疫原，用灭菌生理盐水稀释后与等体积的弗氏完全佐剂混匀。每只兔子注射抗原量为100g/mL.经背部皮内多点注射；两周后进行第一次加强免疫时将弗氏完全佐剂更换为弗氏不完全佐剂，颈背部皮下多点注射.此后每四周进行一次加强免疫,三次加强免疫后第7天，兔耳缘静脉采1ml全血，取血清,用间接EL15A测定血清效价。效价达到要求后，即可颈动脉采血。表 新西兰兔的免疫方案Table Immunization protocol免疫次数Immunity times佐剂类型Adjuvant间隔时间Interval（d）抗原量(g/只）Ammount注射部位Injection sites基础免疫弗氏完全佐剂14200背部皮下多点第1次加强弗氏不完全佐剂28100背部皮下多点第n次加强弗氏不完全佐剂28100背部皮下多点抗血清滴度测定ELISA测定具体步骤如下:用包被缓冲液将包被抗原稀释至适当的工作浓度，每孔加100l,4冰箱过夜，取出板弃去孔内液体；每孔加封闭液200l,37温箱温育1h后，用洗涤缓冲液洗三遍；将SM2多抗血清倍比稀释后每孔加入100l，37温箱温育1h后，用洗涤缓冲液洗三遍;每孔加入1:5000辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgGHRP 100l/ml, 37温箱温育0.5h后，用洗涤缓冲液洗三遍，每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100l,37温箱温育15min；每孔加终止液硫酸50l,上酶标仪测O。D450.值。以待测血清的OD最高值的一半处判定为血清滴度.抗体抑制情况测定将磺胺二甲嘧啶标准品配制成1ng/ml， 10ng/ml，100ng/ml，1g/ml,10g/ml系列浓度，取50l加入到包被好的酶标板中，再加入50l适当浓度的兔血清，37反应1hr后洗涤，加入100l酶标驴抗兔二抗37反应0.5hr后加入显色剂显色，观察标准品的加入是否能抑制抗体与包被抗原的结合。抗体亲和常数测定方法同单抗抗体特异性测定方法同单抗实验结果与分析免疫结果与血清滴度先后1#免疫原与2#免疫原分别免疫3只新西兰大白兔，情况如下:表 免疫批次情况第一批1免疫原1滴度高无抑制,弃23第二批2#免疫原2508取血前死滴度2510获取血清2E62512获取血清2E6采用1免疫原加强免疫3次后开始采血进行滴度和抑制性测试,所获血清均滴度较高却毫无抑制性。而采用2免疫原所免疫动物的血清产生良好的滴度和抑制性。其中2510与2512#抗体的滴度曲线如下：图 SM2多抗2510、2512滴度曲线抗体亲和常数测定采用Beatty等提出的方法对其亲和常数进行测定，得到如下结果：图表 SM2多抗2510#、2512亲和常数测定表 SM2多抗2510、2512#亲和常数测定抗体编号25102512Ka L/Mol9.51082.2108 抗体特异性用酶联免疫分析法（ELISA）测定其与其他几种磺胺类药物的交叉反应率：表 SM2多抗2510#、2512交叉反应测定交叉物SM2SMXSMPSMMSQXSTZSDZSAM2510100%-0。01%0。01-25121000.01%0.01%数据表明所制备的多抗与SM2交叉反应率为100%，与磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺噻唑（STZ）交叉反应率0。01，与其他磺胺类药物基本无交叉。讨论a、磺胺二甲嘧啶是小分子化合物，分子量278。32，不具有免疫原性，不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后,才具有免疫原性，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。因此我们先后采用碳二亚胺法和琥珀酸酐碳二亚胺法联结的人工免疫原免疫动物。在第一批采用碳二亚胺法所免疫的动物中，虽然无论是多抗还是单抗在和其免疫原的结合上都具有很高的效价，但在用磺胺二甲嘧啶对其作抑制曲线时均显示磺胺二甲嘧啶标准品的添加无法抑制所获得抗体和其包被抗原之间的结合，即我们所获得的抗体不仅仅是针对人工抗原中的磺胺二甲嘧啶部分。而用琥珀酸酐-碳二亚胺法联结的人工抗原所免疫动物获得的单抗和多抗则既具有较高的效价又同时能被磺胺二甲嘧啶标准品所抑制，是我们需要的抗磺胺二甲嘧啶的抗体。分析原因应该是人工抗原的联结方法所致：图1 人工免疫原碳二亚胺法联结示意图图2 琥珀酸酐-碳二亚胺法联结示意图应用碳二亚胺法联结的人工免疫原小分子药物与大分子蛋白之间并没有桥梁所以小分子药物很容易折叠进蛋白的三级结构中去，不能够发挥独立的抗原决定簇的作用，而是与周围蛋白的结构共同作为决定簇产生抗体。因此该抗体是无法与单独的磺胺二甲嘧啶分子相结合的，也就无法被磺胺二甲嘧啶标准品抑制其与人工免疫原之间的结合。而琥珀酸酐碳二亚胺法通过对小分子药物的改造在小分子与载体蛋白之间引入了一个4碳结构臂,从而将小分子药物暴露出载体蛋白，使其可以作为独立的抗原决定簇产生抗体，因而其抗体是针对磺胺二甲嘧啶分子的，也就可以被磺胺二甲嘧啶标准品抑制其与人工免疫原之间的结合7。b、本研究中制备了抗磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体和多克隆抗体。一般说来McAb的优点是高度均质性，杂交瘤技术一旦建立，即可源源不断提供性能均一的McAbs，试剂与方法易于标准化和商品化.但是在本次方法学的建立中所采用的抗体是多抗而非单抗。原因是实验中所制备的单抗亲和性和灵敏度都不及多抗。分析原因可能是筛选细胞株时所用的包被抗原是免疫用的免疫原(SM2BSA）的缘故。所筛选出的抗体针对的不仅仅是磺胺二甲嘧啶部分还有一部分是其载体蛋白BSA或者是两者的连接部位.应在以后的实验中用不同的载体蛋白如卵清蛋白（OVA）的联结物做包被物筛选出只针对磺胺二甲嘧啶的抗体.C、所制备抗体均与SDZ和STZ有一定交叉，从分子结构上看本章小节采用琥珀酸酐碳二亚胺法联结的人工免疫原免疫效果要好于采用碳二亚胺法联结的免疫原.可以得到针对磺胺二甲嘧啶抗原决定簇的抗体.制备出了抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体SM223E1和多克隆抗体2510#、2512，亲和常数分别为3。5108 、9.5108和2。2108 L/Mol 满足免疫分析的检测要求.本章参考文献